Perka, Carsten: Die Rekonstruktion von Knorpel- und Knochendefekten Untersuchungen zu den strategischen Möglichkeiten des Tissue Engineering in der Orthopädie

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Kapitel 2. In-vitro-Untersuchungen zum Einsatz differenter Matrixsysteme für die Chondrozytentransplantation

Das zelluläre Wachstum sowie die Morphologie und die Differenzierung der Zellen werden wesentlich durch die Bedingungen der zellulären Mikroumgebung beeinflußt. Die Voraussetzung für eine erfolgreiche Chondrozytentransplantation ist eine ausreichende Zahl vitaler Zellen in einer die phänotypische Differenzierung fördernden Matrix.

Für die Kultivierung von Chondrozyten ist eine dreidimensionale Matrix notwendig, da nur so die phänotypische Stabilität der Zellen erhalten werden kann [6, 8]. Unterschiedliche Matrixsubstanzen, wie Agarosegel [16, 17], Kollagen [29, 53], Fibrin [43], Alginat [38, 39, 114, 74], Hyaluronsäure [100] und biodegradible Polymere wurden für die Kultivierung der Chondrozyten verwendet [19, 78, 95, 96, 97, 111].

Die optimale Matrix für die Zellkultivierung, insbesondere im Hinblick auf eine potentielle Implantation ist durch folgende Charakteristika gekennzeichnet:

Die Matrix dient dabei der mechanischen Stabilisierung, beeinflußt gleichzeitig jedoch die Zellproliferation, den zellulären Phänotyp und die Matrixsynthese durch die Bedingungen der zellulären Mikroumgebung [31, 63, 98, 121]. Sie ist somit für die Herstellung des Knorpeltransplantats, aber auch für die Handhabbarkeit zum Implantationszeitpunkt essentiell. Zudem werden allogene und xenogene Zellen bei der Transplantation vor immunologischen Reaktionen geschützt [1, 27].


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2.1 Perka, C., Spitzer, R.S., Lindenhayn, K., Sittinger, M., Schultz, O.: Matrix-mixed culture - a new methodology for chondrocyte culture and preparation of cartilage transplants. J. Biomed. Mater. Res. 2000; 49: 305-311

Die bisher verwendeten unterschiedlichen Matrixsubstanzen für die Kultivierung von Chondrozyten sind ein Hinweis darauf, daß eine optimale Verbindung bisher nicht gefunden wurde. Das häufig für die Kultivierung verwendete Alginat ist für den Erhalt der Differenzierung der Chondrozyten optimal, jedoch durch die fehlende Biodegradierbarkeit und eingeschränkte Biokompatibilität für die Knorpeltransplantation und damit die In-vivo-Anwendung nicht geeignet.

Alginat ist ein lineares Polysaccharid, welches aus Braunalgen isoliert wird. Dabei handelt es sich um ein Co-Polymer zweier Uronsäuren: L-Guluronic- und D-Mannuronicsäure, die durch Glycoside bei beta 1,4 und alpha 1,4 verbunden sind. In der Gegenwart von divalenten Kationen, wie z. B. Kalzium, geliert das Polymer sofort. Im Vergleich zu anderen Gelen kann jedoch durch die Herauslösung des Kalziums, z. B. durch Zitrat, das Polymer wieder in seine Monomere zerfallen.

Sinnvoll erschien es daher, das Alginat mit einer biodegradierbaren und biokompatiblen Substanz zu mischen, anschließend die Zellen in einem solchen Mischgel zu kultivieren, und unmittelbar vor dem Zeitpunkt der geplanten Transplantation das Alginat herauszulösen. Untersucht wurde die Kombination des Alginats mit Fibrin, da Fibrin als Komponente des Gewebeklebers den oben beschriebenen Anforderungen entspricht und ausreichende Erfahrungen über dessen klinischen und experimentellen Einsatz vorliegen [52, 89, 101]. Die alleinige Verwendung des Fibrins ist aufgrund der schnellen Dedifferenzierung der Chondrozyten nicht möglich [43].

Das Ergebnis der Arbeit zeigt, daß durch die Herstellung einer Matrixmischkultur die Vorteile zweier Substanzen verbunden werden können. Der Erhalt des chondrozytären Phänotyps ist auch bei Kultivierung der Zellen in einem Mischgel aus Alginat und Fibrin möglich. Die im Mischgel durch die Chondrozyten synthetisierten knorpelspezifischen Makromolekülen bilden ein semisolides Knorpelgewebe mit den spezifischen Zell-Matrix-


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Wechselwirkungen unter Erhalt des chondrozytären Phänotyps. Daher bleibt dieses Gel nach Herauslösung des Alginats ausreichend mechanisch stabil und ist für die nachfolgende Transplantation einfach handhabbar.


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2.2 Lindenhayn, K., Perka, C., Spitzer, R.S., Heilmann, H.H., Pommerening, K., Mennicke, J., Sittinger, M.: Retention of hyaluronic acid in alginate beads: Aspects for in vitro cartilage engineering. J. Biomed. Mater. Res. 1999; 44: 149-155

Chondrozyten sind durch die Sekretion knorpelspezifischer Moleküle, wie der Kollagentypen II, IX und XI [65], und von aggregierenden Proteoglycanen wie Aggrecan und Decorin, charakterisiert [56]. Nach Kultivierung im Monolayer verlieren Chondrozyten jedoch ihren spezifischen Phänotyp und dedifferenzieren mit der Folge, daß Moleküle synthetisiert werden, die sonst nur in Fibroblasten und Prächondrozyten gefunden werden. Typische Syntheseprodukte dieser Zellen sind die Kollagene I, III, V und das Proteoglycan Versican [124].

Nach Kultivierung solcher dedifferenzierten Zellen in Alginaten konnte gezeigt werden, daß eine Redifferenzierung zu Chondrozyten möglich ist [8]. Werden differenzierte Chondrozyten in Alginaten kultiviert, so behalten sie ihren chondrozytären Phänotyp [36] und exprimieren die Proteoglycane Aggrecan und Decorin [38], Kollagen II [104] und XI [60]. Alginate sind jedoch keine Bestandteile des natürlichen Knorpels. Aus diesem Grund supplementierten wir in der vorliegenden Arbeit das Alginat mit Hyaluronsäure, einem natürlichen Bestandteil der Knorpelgrundsubstanz, und untersuchten die Retention der Hyaluronsäure in unterschiedlichen Alginatgelen.

Die Arbeit belegt, das bei niedrigen Alginatkonzentrationen der größte Teil der neu synthetisierten Matrix in das Medium diffundiert. Die bisher angenommene Möglichkeit der In-vitro-Herstellung einer suffizienten hygroskopischen Knorpelgrundsubstanz ist in diesem System daher nur in sehr geringem Maße möglich. Eine suffiziente Retention der Hyaluronsäure konnte nur mit Alginatkonzentrationen über 1,2 % oder durch Zugabe von Fibrin erreicht werden.

Die Arbeit belegt, daß neben der üblichen Untersuchung des zellulären Phänotyps, der Zellproliferationsrate und der Synthese knorpelspezifischer Makromoleküle, die Akkumulation der neu gebildeten knorpelspezifischen Matrixmoleküle im Transplantat und die Degradation der zur Kultivierung eingesetzten Matrix essentielle Parameter der In-vitro-Untersuchungen zur Herstellung funktioneller Knorpeltransplantate sind.


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2.3 Haisch, A., Schultz, O., Perka, C., Jahnke, V., Burmester, G.R., Sittinger, M.: Tissue-engineering humanen Knorpelgewebes für die rekonstruktive Chirurgie unter Verwendung biokompatibler resorbierbarer Fibringel- und Polymervliesstrukturen. HNO 1996; 44: 624-629

Für die Herstellung von Knorpeltransplantaten ist die potentielle Implantierbarkeit von höchster Bedeutung. Aus klinischer Sicht sind gelartige oder feste Implantate besser handhabbar als flüssige. Bioresorbierbare Polymere entsprechen diesen Anforderungen und stellen ein supportives zelluläres Mikromilieu für die Chondrozytendifferenzierung dar [93-97, 111-113]. Außerdem erlauben sie eine hohe Formvariabilität der Transplantate sowie eine spezifische Modulation des Gewebsgenerationsprozesses durch die Zugabe von morphogenen Faktoren, wie TGF-beta (transforming growth factor-beta) und BMP‘s (bone morphogenetic protein).

Die Immobilisierung der Zellen im Polymer während der Phase der Kultivierung, ist jedoch nur durch Zugabe weiterer Substanzen zu erreichen. Die bisher am häufigsten verwendete Low-melting-Agarose ist für den klinischen Einsatz nicht geeignet. Subkutan in dieser Matrix transplantierte Chondrozyten degenerieren schnell [93].

Ziel der vorliegenden Untersuchung war daher, die Immobilisierung der Zellen im Polymer durch die Verwendung eines biokompatiblen Materials zu erreichen. Dazu wurden die Zellen innerhalb des Polymers mit Fibrin vernetzt. Wir konnten nachweisen, daß diese Matrix den Phänotyp der darin befindlichen Chondrozyten erhält. Die im Implantat befindlichen Zellen zeigten eine homogene Verteilung und synthetisieren knorpelspezifische Matrixmoleküle. Auf der Basis der vorliegenden Untersuchungen ist die Herstellung eines vollständig biokompatiblen und biodegradiblen Knorpeltransplantats mit semisolider Struktur und guter Handhabbarkeit bei der Implantation möglich.


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