Perka, Carsten: Die Rekonstruktion von Knorpel- und Knochendefekten Untersuchungen zu den strategischen Möglichkeiten des Tissue Engineering in der Orthopädie

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Kapitel 3. Dreidimensionale Systeme zur Kultivierung periostaler Zellen

Die Behandlung von Knochendefekten und Pseudarthrosen wird durch die teilweise unzureichenden therapeutischen Optionen limitiert. Der sogenannte "gold standard“ ist das autologe Knochentransplantat. Es besitzt eine optimale immunologische Toleranz und biologisch aktive Wachstumsfaktoren, welche die knöcherne Regeneration beschleunigen. Andererseits ist autologer Knochen nur begrenzt verfügbar. Zudem sind die Morbidität an der Entnahmestelle und die Devitalisierung des Transplantats, abgesehen von gefäßgestielten Knochenspänen zu berücksichtigen.

Dagegen sind allogene Knochenmaterialien ausreichend vorhanden und verursachen keine zusätzliche Morbidität an der Entnahmestelle. Die Nachteile dieser Transplantate sind in einem höheren Risiko der Infektionstransmission, der immunologischen Rejektion bzw. der infolge der vorangegangenen Temperaturbehandlung weitestgehenden Avitalität zu sehen. Der in vivo dann einsetzende Reparationsprozeß geht dadurch immer mit einer stabilitätsmindernden Resorption des Implantats einher. Der Zeitraum bis zur knöchernen Konsolidierung des Defektes erfordert so oftmals eine langdauernde Entlastung des betroffenen Körperteils.

Das Tissue Engineering von Knochen auf der Basis von mesenchymalen Stammzellen ist ein vielversprechender neuer Therapieansatz [46]. Der wesentliche Vorteil gezüchteter Knochentransplantate besteht darin, daß durch die Amplifikation und nachfolgende Kultivierung der Zellen ein autologes und auch vitales Transplantat zur Verfügung steht. Der Nachteil sonstiger autologer Knochentransplantate, die limitierte Verfügbarkeit, entfällt durch die Möglichkeit der Zellvermehrung in vitro. Auch die Morbidität an der Entnahmestelle kann weitestgehend vernachlässigt werden, da die Gewinnung der Zellen lediglich eines minimalen Zugangs bedarf.

Für die Herstellung gezüchteter Knorpeltransplantate sind mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks und des Periosts am besten geeignet. Dabei ist es das Ziel, die Heilungsprozesse des Knochens bei Frakturen nachzuahmen. So bilden bei der enchondralen Ossifikation pluripotente mesenchymale Zellen vor allem aus der Kambiumschicht des Periosts in Kombination mit Osteoblasten und der Matrix den initialen Frakturkallus [42, 109].


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3.1 Spitzer, R.S., Perka, C., Lindenhayn, K.: In vitro cultivation of rabbit and porcine periosteal cells in matrix-mixed cultures for bone replacement. In: H. Stein, Se-Il Suk, Ping-Chung Leung, K.-G. Thorngren, W. Akeson, ed., SIROT 99, Tel Aviv, Freund Publishing House Ltd., 1999

In verschiedenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß eine Modifikation des Kulturmediums selektiv die Expression des chondrogenen oder des osteogenen Phänotyps mesenchymaler Zellen begünstigt [76]. Eine chondrogene Differenzierung wird z. B. durch die Zugabe von TGF-beta [49, 68] gefördert. Stimulanzien für eine osteogene Differenzierung sind Prostaglandin-E2 [35], BMP2 [48], Dexamethason [59] und ß-Glycerophosphat [106].

Aufgrund ihrer osteokonduktiven Eigenschaften werden Trikalziumphosphate mit gutem klinischen Erfolg für den Ersatz von Knochendefekten in der Orthopädie verwendet [62]. Erste Untersuchungen in Zellkulturen zeigen, daß auch in vitro die Expression osteogener Marker gefördert wird [26]. Zudem besitzen Keramiken, wie für das Hydroxylapatit nachgewiesen, einen mitogenen Effekt [22].

Ziel der vorliegenden Untersuchung war festzustellen, inwieweit Fibrin als biokompatibles und biodegradibles Material als Trägersubstanz für periostale Zellen geeignet ist und diese unter den gegebenen Kulturbedingungen knochenspezifische Matrixprodukte bilden. Nachfolgend war dann, der Einfluß des Zusatzes von alpha-Trikalziumphosphat auf die Syntheserate dieser Moleküle zu untersuchen.

Die vorliegende Untersuchung zeigt, daß periostale Zellen in Fibrinbeads in vitro einen osteoblastischen Phänotyp ausbilden. Spezifische Marker wie die alkalische Phosphatase und das Osteocalcin konnten nachgewiesen werden. Nach dem Zusatz von alpha-Trikalziumphosphat wurde eine Steigerung des DNA-Gehalts der Kultur und der Osteocalcinsynthese beobachtet. Neben den gewählten osteogenen Kultivierungsfaktoren (Zusatz von Ascorbinsäure, Dexamethason und ß-Glycerophosphat) ist eine weitere Steigerung der Synthese knochenspezifischer Matrixmoleküle somit durch den Zusatz von alpha-Trikalziumphosphat möglich.


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3.2 Redlich, A., Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R.S., Häupl, T., Burmester, G.R., Sittinger, M.: Bone engineering on the basis of periosteal cells cultured in polymer fleeces. J. Mater. Sci.: Materials in Medicine 1999; 10: 767-772

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Technik der In-vitro-Herstellung eines präossären Gewebes aus periostalen Zellen in bioresorbierbaren Polymeren (Polyglycol-Polylactidsäure/Polydioxanon). Entsprechend der Kultivierung von Chondrozytentransplantaten ist die Möglichkeit, durch die Form der verwendeten bioresorbierbaren Polymere die äußere Gestalt des späteren Transplantats vorgeben zu können, für den späteren klinischen Einsatz von großer Bedeutung.

Für die Verwendung periostaler Zellen für das Bone Engineering sprechen mehrere Faktoren:

In Vorversuchen konnte nachgewiesen werden, daß periostale Zellen einfach und in ausreichender Menge auch bei älteren Patienten zu entnehmen sind. Dagegen ist die Gewinnung einer adäquaten Zahl von multipotenten mesenchymalen Zellen des Knochenmarks im höheren Spenderalter nur schwer zu realisieren. Insbesondere die zunehmende Zahl älterer Patienten, z. B. mit periprothetischen Knochendefekten um gelockerte Endoprothesen, bedarf jedoch einer effizienteren Strategie des Knochenersatzes.


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In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß periostale Zellen auf bioresorbierbaren Polymeren sehr gut für das Bone Engineering geeignet sind. Die immunhistochemische und die histologische Untersuchung weisen deutlich die Formation eines unkalzifizierten Knochengewebes nach. Daraus ist zu schlußfolgern, daß mit dem verwendeten Versuchsaufbau die Ex-vivo-Herstellung eines präossären Transplantats mit vielfältigen klinischen Einsatzmöglichkeiten realisierbar ist.

Abb. 1: Phasenkontrastmikroskopisches Bild periostaler Zellen in einer Alginat Fibrin-Matrix (x 100)


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