Perka, Carsten: Die Rekonstruktion von Knorpel- und Knochendefekten Untersuchungen zu den strategischen Möglichkeiten des Tissue Engineering in der Orthopädie

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Kapitel 8. Zusammenfassung

1. Strategien zur Gewebsreparatur durch Zelltransplantate erfordern erstens die Verfügbarkeit einer ausreichenden Menge von Zellen, die die Gewebsstruktur und -funktion regenerieren können; zweitens die Schaffung konduktiver Mikrokulturbedingungen für die Integration und die Entwicklung des Implantats; und drittens die Entwicklung einer einfachen sowie reproduzierbaren chirurgischen Technik für die klinische Anwendung des kultivierten Transplantats.

2. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Techniken der Chondrozytentransplantation entwickelt und tierexperimentell erprobt. Alle verwendeten Matrixstrukturen zur Transplantation von Chondrozyten, wie die bioresorbierbaren Polymere, das Kollagen-Fibrin-Gel und die Verwendung von Fibrinbeads nach Herauslösung des Alginats unmittelbar vor der Transplantation, besitzen gegenüber der gegenwärtig kommerziell genutzten Methode Vorteile. Das chirurgische Prozedere wurde erheblich vereinfacht, eine zusätzliche Traumatisierung des umgebenden Knorpels durch Nähte zur Fixation eines periostalen Lappens wird vermieden. Die Traumatisierung an der Entnahmestelle des Periosts entfällt ebenso wie die postoperative Möglichkeit der Ablösung des periostalen Lappens.

3. Alginat kann über einen langen Zeitraum den chondrozytären Phänotyp erhalten, ist jedoch für die Knorpeltransplantation aufgrund der fehlenden Biodegradierbarkeit nicht geeignet. Die in der vorliegenden Arbeit entwickelte neue Zellkulturtechnik beruht auf der sequentiellen Herstellung von Knorpeltransplantaten. Dabei wird zunächst ein Alginat-Fibrin-Träger erzeugt, welcher die initiale Zellproliferation und Synthese der extrazellulären Matrix ermöglicht. Die nachfolgende Herauslösung des Alginats unter Verwendung divalenter Kationen erlaubt dann die in-vivo-Transplantation eines stabilen Beads. Der optimale Kompromiß zwischen der Matrixstabilisierung und einer ausreichenden Diffusionskapazität für die Zellfunktion wurde bei einer Mischung aus 0,6 % Alginat und 4,5 % Fibrin gefunden.

4. Zellbeads, die in der beschriebenen Technik unter Verwendung einer Alginat-Fibrin-Mischkultur hergestellt wurden, stellen auch für die Transplantation periostaler Zellen ein


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stabiles Implantat zur Rekonstruktion von Gelenkknorpeldefekten dar. Die Beads haben eine ausreichende Steifigkeit und Elastizität für eine suffiziente Transplantatfixation.

5. Bei der in-vitro-Generation von Knorpeltransplantaten unter Verwendung von Alginat ist zu berücksichtigen, daß bei niedrigen Alginatkonzentrationen der größte Teil der durch die Chondrozyten neu synthetisierten Matrix in das Medium diffundiert. Die bisher angenommene Möglichkeit der in-vitro-Herstellung einer suffizienten hygroskopischen Knorpelgrundsubstanz mit Retention der knorpelspezifischen Matrixmoleküle wie der Hyaluronsäure, ist nur bei Alginatkonzentrationen über 1,2 % oder durch Zugabe von Fibrin erreichbar.

6. Fibrin-Kollagen-Gele erlauben eine stabile Fixation von kultivierten embryonalen Chondrozytentransplantaten und liefern adäquate Mikrokulturbedingungen für proliferierende Zellen zur Bildung hyalinartigen Knorpels in einem Knorpel-Knochen-Defekt. Die initial hohe Zelldichte des Implantats nimmt während des nachfolgenden Transplantatumbaus ab und entspricht nach 24 Wochen der der Umgebung.

7. Die bisher zur Immobilisierung von Chondrozyten in biodegradiblen Polymeren verwendete low-melting-Agarose kann bei der Herstellung von Knorpeltransplantaten durch Fibrin ersetzt werden. Der Erhalt des chondrozytären Phänotyps der Zellen konnte nachgewiesen werden. Der Vorteil des Fibrins beteht gegenüber der Agarose in einer deutlich besseren Biokompatibilität und Biodegradierbarkeit.

8. Biodegradible Polymere ermöglichen die In-vitro-Generation eines semisoliden Knorpeltransplantats und stellen ein geeignetes Trägermaterial für die Knorpeltransplantation dar. Die Transplantation der Chondrozyten erfolgt in der eigenen, in vitro synthetisierten Matrix, was die Vulnerabilität der Zellen gegenüber Einflüssen aus der Umgebung herabsetzt. In vivo liefern die Polymervliese ein adäquates Mikromilieu für die Bildung von hyalinem Knorpel, wobei eine Gleichverteilung der Zellen im Defekt, genau wie bei flüssigen Trägermaterialien, nachweisbar ist.

9. Die Kryokonservierung von Chondrozyten führt zu einer Reduktion des regenerativen Potentials. Dennoch hat auch die Transplantation kryokonservierter Chondrozyten die


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Bildung von hyalinartigem Knorpel zum Ergebnis, wobei gegenüber der Transplantation nicht kryokonservierter Chondrozyten jedoch größere zellarme Areale im Defekt beobachtet werden. Die Kryokonservierung stellt somit ein mögliches Verfahren dar, den Zeitraum zwischen Zellentnahme und Retransplantation beliebig zu wählen, bedarf jedoch weiterer Optimierungen.

10. Die Degradation von PGLA/Polydioxanon-Polymeren verläuft langsamer als die simultane Synthese knorpelspezifischer Matrixmoleküle, wodurch zu jedem Zeitpunkt nach der Transplantation eine ausreichende Transplantatintegrität resultiert.

11. Die histomorphologischen Veränderungen und die Entwicklung des Transplantats in vivo werden durch die spezifischen Bedingungen der Transplantatumgebung beeinflußt. Dabei ist ein vollständiges zonales und sequentielles Remodeling des Knorpeldefektes nur bei nicht ausdifferenzierten Zellen (embryonale Chondrozyten, periostale Zellen) zu erkennen. Transplantate unter Verwendung von Chondrozyten zeigen dagegen nur eine sehr geringe Rekonstruktion des subchondralen Knochens. Bei embryonalen Chondrozyten und periostalen Zellen ist dagegen eine differente Entwicklung des Implantats zu verfolgen. Die implantierten Zellen an der Oberfläche, die durch die Synovialflüssigkeit ernährt werden, entwickeln sich zu einem hyalinartigen Knorpel, wogegen unter dem Einfluß der Serumtranssudation des Blutes in den tieferen Zonen eine Knorpel-Knochen-Transformation beobachtet wird.

12. Die Transplantation embryonaler Chondrozyten ist ein Modell, obwohl aus ethischen Gründen so nicht in die Humanmedizin übertragbar, das geeignet ist, neue Erkenntnisse über die Transplantation und Differenzierung proliferierender Zellen zu erhalten. Dies ist insbesondere von Bedeutung, seitdem neue Strategien des Knochen- und Knorpelersatzes auf dem Einsatz mesenchymaler, multipotenter Zellen basieren.

13. Periost besitzt ein exzellentes chondrogenes und osteogenes Potential, ist mit einer minimalen Morbidität an der Entnahmestelle zu gewinnen und liefert eine ausreichende Menge von multipotenten Zellen. Diese Zellen können sowohl die Rekonstruktion des subchondralen Knochens als auch des Knorpels induzieren. Zudem sind periostale Zellen in vitro ohne Verlust des Phänotyps amplifizierbar und stellen daher eine optimale


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Zellquelle für das Tissue Engineering dar. Vergleichbare Eigenschaften sind sonst bisher nur bei embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Zellen des Knochenmarks beobachtet worden.

14. Der Einsatz von Wachstumsfaktoren und die zunehmenden Erkenntnisse zu den Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen für den Erhalt der Differenzierung der Gewebe und der Homöostase ermöglichen in vivo die Bildung ortsständigen Gewebes durch multipotente Zellen. Aufgrund der Möglichkeit der Differenzierung mesenchymaler Stammzellen in unterschiedliche Richtungen in Abhängigkeit von den nutritiven Faktoren, ist sowohl der Knochen als auch des Knorpel bei Gelenkdefekten mit Alteration des subchondralen Knochens vollständig ersetzbar.

15. Unter dem Einfluß von TGF-beta1 während der Kultivierung von periostalen Zellen kommt es zu einer signifikanten Reduktion der Anzahl von Zellen, welche einen chondrogenen Phänotyp besitzen. Die Folge ist einerseits eine Reduktion der Knorpelschicht im Transplantat. Andererseits konnte erstmals nach Transplantation dieser pluripotenten Zellen unter dem Einfluß von TGF-beta1 eine Architektur des neugebildeten Knorpels beobachtet werden, welche der von hyalinem Knorpel entsprach, was nach Defektfüllung mit differenzierten Chondrozyten in keinem Fall verifiziert wurde.

16. Periostale Zellen sind so kultivierbar, daß die Differenzierung in osteogener Richtung verläuft. Neben den bekannten, die osteogene Differenzierung fördernden Faktoren beta-Glycerophosphat, Ascorbinsäure und Dexamethason (Verkalkungsmedium) kann eine verstärkte Synthese knochenspezifischer Makromoleküle (alkalische Phosphatase, Osteocalcin) auch durch die Zugabe mikropartikulären alpha-Trikalziumphosphats erreicht werden.

17. Biodegradible Polymere aus PGLA/Polydioxanon sind für das Bone Engineering unter Verwendung periostaler Zellen besonders geeignet. Die immunhistochemische und die histologische Untersuchung weisen deutlich die Formation eines unkalzifizierten Knochengewebes ex vivo nach. Die Herstellung eines präossären Transplantats mit vielfältigen klinischen Einsatzmöglichkeiten ist somit realisierbar.


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18. Die Verwendung von Biomaterialien, wie Keramiken oder Biopolymeren zum Knochenersatz beruht auf deren osteokonduktiven und strukturellen Eigenschaften. Die Transplantation osteogener Zellen in solchen Trägersystemen ist ein neuer Weg zur Optimierung des Prozesses der knöchernen Rekonstruktion und des knöchernen Remodellings. Strategisch handelt es sich dabei um die Nutzung der Synergie von nicht immunogenen, einfach zu isolierenden Zellen mit hohem osteogenetischen Potential und einem biokompatiblen, osteokonduktiven, resorbierbaren Trägersystem, welches ein optimales Milieu für die Zellanheftung und die schnelle Vaskularisierung darstellt.

19. Bioresorbierbare Polymere erlauben eine adäquate Vaskularisierung, welche Voraussetzung für die Bildung von Knochen und die Verhinderung der Knorpelentstehung ist. Im Gegensatz dazu kommt es bei Verwendung von Fibrinträgern aufgrund der Sensitivität periostaler Zellen gegenüber dem Sauerstoffpartialdruck zur chondrogenen Differenzierung.

20. Die immer komplexere und umfassendere Wiederholung der sich in der Ontogenese abspielenden Vorgänge durch die Techniken des Tissue Engineering, ermöglicht die Schaffung therapeutischer Optionen zur Behandlung von Knochen- und Knorpeldefekten, wo bisher keine existierten oder nur unzulänglich vorhanden waren.


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