| Peters, Harm: Wirkungen der L-Arginingabe bei immun-vermittelter akuter und chronischer Glomerulofibrose |
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Alle Materialien wurden von Sigma-Aldrich geliefert. Ausnahmen hiervon waren:
(in alphabetischer Reihenfolge)
Albustix (Albuminteststreifen, Miles Scientific, Rockford, USA)
cDNA-Labeling Kit (Boehringer Biochemicals, Mannheim)
Diäten (Teklad Premier Laboratory Diets, Madison, USA),
Doppelstrang-DNS (Oncor, Heidelberg)
Fluorescin-konjugierter Anti-Mausantikörper (Dianova, Hamburg)
Kaninchen-Anti-Fibronektin-Antikörper (Upstate Biotech, USA)
Kaninchen-Anti-NOS II-Antikörper (Alexis Corporation, San Diego, USA)
Kaninchen-Anti-PAI-1-Antikörper (American Diagnostica, Sulzfeld)
Maus-Anti-ED-1-Antikörper (Serotec, Oxford, United Kingdom)
Nitrat-Reduktase (Boehringer Biochemicals, Mannheim)
OX-7 (European Collection of Animal Cell Culture, United Kingdom)
Peroxidase-konjungierter Schaff-Anti-Kaninchen-Antikörper (Dianova, Hamburg)
Protein-G-Säulen (Biorad, München)
QuantikineTM für TGF-ß1 (R&D Systems, Minneapolis, USA)
Ratten-PAI-1-Antigen (American Diagnostica, Sulzfeld)
Rhodamin-markierter Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove USA)
Trizol®-Reagenz (GibcoBRL, Berlin)
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Alle Tierversuche erfolgten im Einklang mit der Deklaration von Helsinki zur Durchführung von Tierversuchen und unter Einhaltung der lokal gültigen Tierschutzgesetze.
Die Anti-Thy1-Glomerulonephritis der Ratte ist ein Modell mit akuter, reversibler Matrixexpansion . Sie wird durch die Injektion von Anti-Thy1-Antikörpern (z.B. vom OX-7 Hybridom) induziert. Diese binden spezifisch an ein Thy-1-Epitop, das in der Niere nur von Mesangialzellen exprimiert wird. Die Anti-Thy1-Antikörper führen rasch und zeitlich begrenzt zur einer Komplement- und NO-vermittelten Mesangialzellyse (Schädigungsphase). In der Folge kommt es zu einer zeitlich relativ klar abgegrenzten Phase der Matrixexpansion im Glomerulum (Matrixexpansionsphase). Zwischengeschaltet sind Thrombozytenaggregation, moderate Monozyten/Makrophagen-Infiltration und deutlich gesteigerte Proliferation. Histologisch findet sich in der Phase der Matrixexpansion das Bild einer mesangioproliferativen Glomerulonephritis. Innerhalb von ca. 2 Monaten nach Induktion der Glomerulonephritis kommt es zu einer fast kompletten Normalisierung des histologischen Bildes (Ausheilungsphase).
Die Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus ist ein Modell der chronisch-fortschreitenden Matrixexpansion. Dieses Modell ist dem humanen Lupus erythematodes verwandt. MRL/lpr-Mäuse (lpr=lymphoproliferativ) entwickeln spontan große Mengen Autoantikörper (u. a. Anti-Nukleäre Antikörper, Einzelstrang- und Doppelstrang-DNS-Antikörper). Genetischer Hintergrund der Lupuserkrankung dieser Mäuse ist eine Mutation des im lpr-Genlocus gelegenen FAS-Gens, welches die Apoptose von aktivierten autoreaktiven Lymphozyten verhindert.
In Folge der ungezügelten Antikörperproduktion kommt es bei MRL/lpr-Mäusen zur Bildung von Immunkomplexen, die sich bevorzugt in den Nieren der Tiere ablagern und zu einer kontinuierlichen, inflammatorischen Schädigung der Niere führen. Der immunologische Nierenschaden wird im wesentlichen über die Produktion von
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zytotoxischen Mengen NO vermittelt. Erste Zeichen der Lupusnephritis (Proteinurie, histologische Veränderungen) sind ab ca. der 14. Lebenswoche nachweisbar. In Folge der fortwährenden Nierenschädigung kommt es zu einer chronisch-fortschreitenden Matrixvermehrung, die von einer zunehmenden Einschränkung der Nierenfunktion begleitet wird. Die Mäuse versterben schließlich an den Folgen der Urämie in ca. der 23./24. Lebenswoche.
Wie in der Einleitung beschrieben, sind TGF-ß-Überexpression und Matrixvermehrung von besonderer Bedeutung für den Funktionsverlust bei chronischen Nierenleiden. In den folgenden Versuchsprotokollen wurde daher die Wirkung der L-Arginingabe in erster Linie in Beziehung zur histologisch meßbaren Matrixexpansion und zu Markern der TGF-ß-Expression gesetzt. Neben der direkten Messung von TGF-ß-mRNA und Protein wurden dabei die Matrixproteine Fibronektin (Indikator der Matrixsynthese) und PAI-1 (Indikator der Matrixdegradation) als indirekte Parameter der in-vivo-Aktivität von TGF-ß verwandt.
Im folgenden sind zunächst die verschiedenen Versuchsprotokolle im Ablauf beschrieben. Die jeweils eingesetzten Methoden sind dann im Abschnitt 2.4 beschrieben.
Die Vorarbeiten dienten dazu, eine neue Meßmethodik für das Modell der Anti-Thy1-Glomerulonephritis zu entwickeln. Ziel war eine sensitive, objektivierbare und valide Methodik zur Messung der Fibroseaktivität mit möglichst großer Differenz zwischen normaler und pathologischer Matrixproteinexpression. Die folgenden Einzelpunkte wurden untersucht:
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Bei der Isolation von Glomeruli werden normalerweise die Nieren von 3-4 Ratten zusammengeführt, um ausreichende Materialmengen für weitere Untersuchungen zu erhalten. Ziel war hier die Isolation von Glomeruli einzelner Tiere. Hierzu bedienten wir uns 4 Metallsiebe (150, 125, 106 und 75 µ Mesh-Größe) mit einem Durchmesser von 10 cm. Glomeruli von je 4 normalen und nephritischen Tieren wurden isoliert. Zahl und Reinheitsgrad der Glomeruli wurden lichtmikroskopisch erfaßt.
In diesem Vorversuch wurde analysiert, über welchen Zeitraum die kultivierten Glomeruli konstant die Matrixproteine TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 in den Kulturüberstand abgeben. Glomeruli von 4 nephritischen Tieren (Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis) wurden von einzelnen Tieren isoliert und in einer Konzentration von 2000 Glomeruli pro ml in DMEM für 24, 48 und 72 Stunden bei 37 Grad und 5% CO2 kultiviert. Die Kulturlösung war Serum-frei und enthielt als Zusätze 0,1 U/ml Insulin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin. Im Überstand wurden dann die Matrixproteine TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 mittels ELISA gemessen.
Analog zu 2.3.1.2 untersuchten wir die NO-Synthese kultivierter Glomeruli im Zeitverlauf. Hierzu wurden Glomeruli von je 4 normalen und 4 nephritischen Tieren (6 Stunden nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis) isoliert und in phenolrotfreiem DMEM mit 0,1 U/ml Insulin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 Grad und 5% CO2 kultiviert. Nach 24, 48 und 72 h wurde im Überstand die Konzentration von Nitrit (Endprodukt von NO) mittels der Griess-Reaktion bestimmt.
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In diesem Versuch wurde die Matrixproteinsynthese in Kultur mit der tatsächlichen glomerulären Konzentration dieser Matrixproteine in-vivo verglichen. Glomeruli von jeweils 4 normalen und 4 nephritischen Tieren (Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis) wurden isoliert. Die Glomeruli wurden in einer Dichte von 2000/ml in DMEM mit 0,1 U/ml Insulin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml resuspendiert. Ein Teil wurde für 72 Stunden bei 37 Grad und 5% CO2 kultiviert, der andere direkt nach der Isolation mittels Ultraschall lysiert (3 Zyklen a 10 Sekunden auf Eis). Anschließend wurde die Konzentration von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 im Kultur- bzw. Lysatüberstand mittels ELISA ermittelt.
Um das Maximum der Matrixproteinexpression im Verlauf der Anti-Thy1-Glomerulonephritis zu ermitteln, wurden jeweils 4 Versuchstiere 6 und 12 Stunden und 1, 3, 6, 8, 10, 14 und 28 Tage nach Induktion der Glomerulonephritis untersucht. Die Glomeruli von Einzeltieren wurden isoliert und für 72 Stunden in DMEM mit 0,1 U/ml Insulin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei 37 Grad und 5% CO2 kultiviert. Im Kulturüberstand wurden die Matrixproteine TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 mittels ELISA gemessen.
Um zu ermitteln mit welcher Dosis des OX-7-Antikörpers die höchste Matrixproteinexpression bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis zu erzielen ist, wurden steigenden Dosen des Antikörpers (0,5 , 1, 1,5, 2 und 2,5 mg pro kg Körpergewicht) injiziert. Am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis wurde die glomeruläre Matrixakkumulation histologisch an PAS-Schnitten bestimmt sowie wurden Glomeruli isoliert und in DMEM mit 0,1 U/ml Insulin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml
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Streptomycin für 72 Stunden bei 37 Grad und 5% CO2 kultiviert. Im Kulturüberstand wurden die Matrixproteine TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 mittels ELISA gemessen.
In diesem Protokoll wurde die Wirkung der L-Arginingabe auf die Anti-Thy1-Antikörper-induzierte Mesangialzellyse der Anti-Thy1-Glomerulonephritis untersucht. Hierzu wurde den Versuchstieren für eine Woche vor Antikörperinjektion 1% L-Arginin im Trinkwasser gegeben. Ein Teil der Tiere wurde sechs Stunden nach Antikörperinjektion untersucht, um den Einfluß auf die Mesangialzellyse und auf Parameter des L-Arginin-NO-Stoffwechsels zu erfassen.
Bei dem anderen Teil der Tiere wurde die L-Arginingabe kurz nach Antikörperinjektion beendet. Am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis wurde untersucht, ob sich Effekte auf die Mesangialzellyse in einer veränderten Matrixexpansion und TGF-ß1-Expression im weiteren Verlauf der Glomerulonephritis widerspiegeln. Alle Tiere erhielten eine Diät mit normalen Proteingehalt (22% Kasein).
Drei Gruppen Sprague Dawley-Ratten (n=8 pro Gruppe) wurden gebildet:
Sechs Stunden nach Induktion der Glomerulonephritis wurden folgende Parameter bestimmt:
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Drei Gruppen mit je 8 Sprague Dawley-Ratten wurden gebildet:
Bei diesen Tieren wurde die L-Arginingabe 16 Stunden nach Antikörperinjektion beendet. Bis zum Versuchsende erhielten alle Tiere eine normale L-Argininzufuhr.
Im Verlauf des Experiments wurde ein 24-Stundenurin am Tag 8 und 1 vor, sowie am Tag 2 und 5 nach Induktion der Glomerulonephritis gesammelt.
Sechs Tage nach Induktion der Glomerulonephritis wurden folgende Untersuchungen durchgeführt:
In diesem Versuchsprotokoll wurde die Wirkung der L-Arginingabe auf die
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blutdruckunabhängige TGF-ß-Überexpression und Matrixakkumulation nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis untersucht. Hierzu wurde den Versuchstieren ab Tag 1 nach Antikörperinjektion, d. h. nach Ablauf der Mesangialzellyse, 1% L-Arginin ins Trinkwasser gegeben.
Neben Tieren mit normaler Proteinzufuhr (NP, 22% Kasein) wurde L-Arginin auch bei Tieren mit diätetischer Proteinrestriktion (LP, 6% Kasein) gegeben. Am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis wurde die Wirkung der L-Arginingabe auf die Marker der glomerulären Matrixexpansion untersucht und in Relation zu Parametern des endogenen L-Arginin-NO-Stoffwechsels gestellt.
Die folgenden Gruppen mit je 8 Sprague Dawley-Ratten wurden gebildet:
Fünf Tage nach Antikörperinjektion wurde der systolische Blutdruck schwanzplethysmographisch gemessen und eine 24-h-Urinsammlung begonnen.
Sechs Tage nach Induktion der Glomerulonephritis wurden folgende Parameter gemessen:
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In diesem Protokoll wurde die Wirkung der L-Arginingabe auf den Verlauf der Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus untersucht. L-Arginin wurde als 1%ige Lösung mit dem Trinkwasser gegeben. Wie in Protokoll 2 (2.3.3) wurde neben der Normalproteindiät auch wieder eine Niedrigproteindiät eingesetzt. Die Behandlungen wurden in Lupusmäusen mit manifester Nephritis (16. Lebenswoche) begonnen.
In Mäusen (n=18 je Gruppe) mit manifester Lupusnephritis wurden folgende Gruppen gebildet:
Als Versuchsende wurde der Zeitpunkt festgelegt, an dem in einer der 4 Gruppen 50% der Mäuse (9 von 18) gestorben sind. Dieses Vorgehen bietet zum einen ausreichend Daten für den statistischen Vergleich der Überlebenszeiten. Zum anderen können bei den noch lebenden Mäusen gleichzeitig relevante Marker für die Aktivität des Krankheitsgeschehens gemessen werden. Bei MRL/lpr-Mäusen mit normaler Proteinzufuhr sind in der Regel in der 23./24. Lebenswoche 50% der Tiere verstorben.
Am Versuchsende wurde ein 24-Stundenurin in metabolischen Käfigen gesammelt. Das Körpergewicht wurde wöchentlich bestimmt. Die Mäuse wurden täglich visiert. Tote Mäuse wurden aus den Käfigen entfernt und der Todeszeitpunkt dokumentiert.
Am Versuchsende wurden folgende Untersuchungen durchgeführt:
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Zwei Diäten wurden verwandt:
Die Diäten waren isokalorisch. Hierzu wurde der Zuckeranteil angepaßt. Als Protein wurde Kasein eingesetzt. Der Anteil an Fetten, Vitaminen und Spurenelementen war bei beiden Diäten identisch.
OX-7 wurde als Antikörper zur Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis verwandt. OX-7 ist ein monoklonaler IgG1 Anti-Thy1-Antikörper und wurde aus dem Kulturüberstand des Mäusehybridoms OX-7 hergestellt. Die IgG-Fraktion des Kulturüberstandes wurde mittels Protein-G-Säulen aufgetrennt. Nach mehrfacher Dialyse gegen PBS und spektographischer Konzentrationseinstellung (bei 280 nm auf 1 mg/ml) wurde der Antikörper bei -70 Grad gelagert.
Das Modell der akuten Anti-Thy1-Glomerulonephritis ist ausführlich unter 2.2.1 beschrieben. Die Anti-Thy1-Glomerulonephritis wurde in männlichen Sprague Dawley-Ratten (200-250g Körpergewicht) durch die einmalige i.v. Injektion des OX-7-Antikörpers (1,5 mg/ kg
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Körpergewicht) unter Methoxyflurannarkose induziert.
Der systolische Blutdruck wurde mittels Schwanzplethysmographie (Fa. Havard Apperatus, United Kingdom) bei wachen Tieren gemessen. Der Mittelwert aus drei Messungen wurde gebildet.
Die Proteinurie und Albuminurie wurde im 24-Stundenurin gemessen. Zur Sammlung des Urins wurden die Versuchstiere für 24 Stunden in Stoffwechselkäfigen gehalten. Bei den Sprague Dawley-Ratten wurde der Proteingehalt des Urin mittels der Bradtfordmethode bestimmt. Bei den Lupusmäusen wurde die Albuminurie mittels eines Albuminteststreifens (Albustix, Miles Scientific, Rockford, USA) bestimmt.
Die Entnahme der Nieren erfolgte unter tiefer Äthernarkose und nach in situ-Perfusion mit eiskalter PBS-Lösung (pH 7,4). Bei den MRL/lpr-Mäusen erfolgte die Blutentnahme und die anschließende Perfusion über den linken Ventrikel, bei den Sprague Dawley-Ratten über die Bauchaorta. Die entfernten Nieren wurden dann unmittelbar in eiskalte PBS-Lösung gebracht, und die Tiere mit einer Überdosis an Barbituraten getötet. Für die spätere histologische Aufarbeitung wurde je ein kleines Stück des Nierenkortex in 10%igem Formalin fixiert oder in Methylbutan eingebettet und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis wurden die Glomeruli je Einzeltier mittels einer abgestuften Siebtechnik (150, 125, 106 und 75 µm Mesh Porengröße) isoliert. Nach lichtmikroskopischer Kontrolle des Reinheitsgrades wurden die Glomeruli zu drei gleichen
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Teilen aufgeteilt. Ein Teil wurde in Serum-freiem DMEN mit 0.1 U/ml Insulin, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin in einer Dichte von 2000 Glomeruli/ml für 72 Stunden bei 37 Grad und 5% CO2 kultiviert. Der Kulturüberstand wurde für die späteren ELISA-Messungen bei -20 Grad eingefroren. Ein weiterer Teil wurde in 5 ml Trizol®-Reagenz (GibcoBRL) für die spätere RNA-Isolation homogenisiert und bei -70 Grad gelagert. Der Rest wurde für spätere Proteinanalysen unmittelbar bei -70 Grad eingefroren.
Bei der Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus sind sowohl die Glomeruli als auch das Tubulointerstitium erkrankt. Als Untersuchungsmaterial wurde daher Nierenkortexgewebe verwandt. Für die Proteinbestimmung von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 wurde kortikales Gewebe gewogen und in 2 ml PBS gegeben. Anschließend wurde das Material grob mit einem Gewebshomogenisator zerkleinert und dann 3 Mal für je 15 Sekunden mit Ultraschall lysiert. Der Überstand wurde bei -70 Grad gelagert.
Die Bestimmung von TGF-ß1-Protein aus dem Kulturüberstand oder Gewebslysat erfolgte mit einem kommerziellen Kit (R&D Systems, Minneapolis, USA) entsprechend den Vorgaben des Herstellers. Die Fibronektin- und PAI-1-Konzentration der Proben wurde mittels selbst entwickelter kompetitiver Inhibitions-ELISA-Systeme gemessen. Für den Fibronektin-ELISA wurde als Antigen Ratten-Fibronektin und als primärer Antikörper ein Kaninchen-Anti-Fibronektin-Antikörper verwandt{169}. Für den PAI-1-ELISA wurde als Antigen rekombinantes Ratten-PAI-1 und als primärer Antikörper ein Kaninchen-Anti-PAI-1-Antikörper eingesetzt. Bei beiden wurde ein Peroxidase-konjungierter Schaff-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper als sekundärer Antikörper verwandt. Nach Exposition mit o-Phenylenediamin-Dihydrochlorid wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. Die Konzentration der Matrixproteine wurde anhand spezifischer Standards ermittelt. Bei der glomerulären Kultur ist sie als ng/ml pro 2000 Glomeruli und bei dem kortikalen Gewebshomogenat als ng/mg Naßgewicht angegeben.
Die Bestimmung der TGF-ß1-, Fibronektin-, PAI-1- und NOS II-mRNA-Expression erfolgte mittels Northern Blotting. Hierzu wurde Gesamt-RNA von isolierten Glomeruli
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mittels dem Trizol®-Reagenz (GibcoBRL, Berlin) entsprechend der Anleitung des Herstellers isoliert. Für die Northern-Blot-Analyse wurden je 20 µg RNA mittels Gelelektrophorese (0.9% Agarose/2.2M Formaldehyd) mobilisiert und auf eine Nylonmembran transferiert. Es folgte Crosslinking mittels UV-Behandlung und Hybridisierung mit entsprechenden 32P-CTP-markierten cDNA-Proben. Murine TGF-ß1-, GAPDH- sowie Ratten-Fibronektin-, PAI-1- und NOS II-cDNA-Proben wurden verwandt.
Die spezifische Bindung der Proben wurde autoradiographisch unter Verwendung eines Densitometers erfaßt und in Relation zur Dichte der GADPH-Bande derselben RNA-Probe als “house-keeping enzyme“ gestellt.
Alle histologischen Untersuchungen wurden von “geblindeten“ Untersuchern durchgeführt.
Für die PAS-Färbung wurden 2 µm-Schnitte der in Paraffin eingebetteten Gewebsblöcke geschnitten und mit Perjodsäure-Schiff (PAS) und Hämatoxylin/Eosin (H&E) gefärbt. Zur Bestimmung der Mesangialzellyse wurde die Zahl der Zellkerne pro glomerulärer Schnittfläche (Größe 80-100 µm) von mindestens 30 Glomeruli pro Tier gezählt. Für den Matrixscore wurde die glomeruläre Fläche, die von Matrix eingenommen wird, wie folgt erfaßt: 0=0%, 1=25%, 3=75% und 4 = 100%. Mindestens 30 Glomeruli pro Tier wurden ausgewertet.
Bei den Lupusmäusen wurde die glomeruläre und tubulointerstitielle Matrixexpansion in Anlehnung an Berden und Mitarbeiter bestimmt. Die glomerulären Matrixablagerungen wurden wie folgt bewertet: 0=keine Veränderungen, 1= weniger als 25% des Glomerulums sind betroffen, 2=25-50% des Glomerulums sind betroffen, 3=mehr als 50% des Glomerulums sind betroffen. Mindestens 20 Glomeruli pro Tier wurden ausgewertet. Die tubulointerstitiellen Veränderungen (Fibrose und Inflammation) wurden wie folgt bewertet: 0=keine Veränderungen, 1=bis zu 25% der Fläche sind betroffen, 2=25-50% der Fläche sind betroffen, 3= mehr als 50% der Fläche sind betroffen. Mindestens 15 Felder pro Tier in niedriger Vergrößerung (10X) wurden ausgewertet. Zur Bestimmung des renalen Matrixscores wurden bei den Lupusmäusen die Werte von glomerulären und tubulointerstitiellen Scores addiert.
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Für die Immunfluoreszenz wurden 1 µm-Schnitte angefertigt. Für den Makrophagennachweis bei der Anti-Thy1-Glomerulonephrits wurde ein ED-1-Antikörper verwandt. Mindestens 20 Glomeruli pro Tier wurden ausgewertet. Die Färbung des NOS II-Proteins erfolgte mit einem primären Kaninchen-Antikörper. Als sekundärer Antikörper wurde ein Rhodamin-markierter Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper verwandt. Die Immunfluoreszenz-Intensität wurde mit einer 4-Gradskala wie folgt erfaßt: 0=keine Färbung, 1=schwache oder punktuelle Färbung, 2=moderate und segmentale Färbung, 3=stärkere segmentale oder diffuse Färbung und 4=starke über das ganze Glomerulum verteilte Färbung.
Für die Bestimmung der L-Argininkonzentration im Plasma wurde ein Standard-Aminosäure-Analysator mit HPLC-Technik verwandt.
Die Bestimmung der Antikörper gegen dsDNS erfolgte mittels ELISA-Technik. Für diesen ELISA wurden 96-well-Mikrotiterplatten mit dsDNS beschichtet und dann mit 1:10 verdünnten Plasma-Proben der Lupusmäuse inkubiert. Der Überstand wurde nach 2 Stunden verworfen und ein Peroxidase-konjungierter Schaff-Anti-Maus-IgG-Antikörper zugegeben. Nach Exposition mit o-Phenylenediamin-Dihydrochlorid wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt. Der relative Titer an Anti-dsDNS-Antikörper wurde als die im ELISA erreichte relative optische Dichte dargestellt.
Beides sind End-Produkte der NO-Synthese. Sie wurden im Plasma, Urin und Kulturüberstand mittels der Griess-Reaktion{168} nach Nitrat-Reduktase-Behandlung bestimmt.
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Alle Daten sind als Mittelwert±Standardfehler des Mittelwertes(MW±SEM) angegeben. Der statistische Vergleich zwischen den Gruppe erfolgte mittels ANOVA und nachfolgender t-Testung mit Bonferroni-Korrektur für Mehrfachtestung. Die Überlebensanalysen bei den Lupusmäuse erfolgte nach Kaplan-Meier.
Ein p-Wert kleiner 0,05 wurde als signifikant unterschiedlich bewertet.
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HTML - Version erstellt am: Wed Feb 21 16:04:03 2001 |