| Peters, Harm: Wirkungen der L-Arginingabe bei immun-vermittelter akuter und chronischer Glomerulofibrose |
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Die Vorarbeiten dienten dazu, eine neue sensitive, objektivierbare und valide Methodik zur Messung der „Fibroseaktivität“ bei der akuten Anti-Thy1-Glomerulonephritis zu entwickeln. In den Vorversuchen waren die Fallzahl pro Gruppe relativ klein, so daß keine statistische Analyse vorgenommen wurde.
Wie im Kapitel 2 „Material und Methoden“ beschrieben, wurden dabei folgende Neuerungen bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis entwickelt und validiert:
Um zu ermitteln, mit welcher Ausbeute bei der Isolation von Glomeruli einzelner Tiere zu rechnen ist, wurden die Glomeruli von 4 normalen und 4 nephritischen Tieren (Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis) mit unserem neuen Siebverfahren isoliert.
Wie in der Tab. 1. zu sehen ist, wurden bei den normalen Tieren im Durchschnitt 34600 Glomeruli pro Tier gewonnen. Bei den nephritischen Tieren waren es im Durchschnitt 51200 Glomeruli pro Tier. Die Reinheit der Glomeruli wurde lichtmikroskopisch erfaßt und lag in allen Fällen über 90% (Daten nicht gezeigt). Bei den normalen Tieren konnte die Zahl der gewonnenen Glomeruli nicht durch Verwendung feinerer Auffangsiebe (52 µ oder 63 µ anstelle des 75 µ Mesh) erhöht werden. Da die Glomeruli normaler Tiere eine sehr homogene Population darstellen, dürfte sich die geringere Ausbeute bei den gesunden Kontrollen in den folgenden Messungen nicht auswirken.
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Tab. 1: Zahl der Glomeruli, die pro Tier geerntet wurden. Isoliert wurden jeweils die Glomeruli von 4 normalen und 4 nephritischen Tieren. Bei den nephritischen Tieren wurden die Glomeruli 6 Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis geerntet. Die Zahl der Glomeruli pro Tier war ausreichend für die glomeruläre Kultur (Bedarf 5 x 2000 Glomeruli) und für die Bestimmung des in-vivo-Gehalts an Matrixproteinen (5 x 2000 Glomeruli). Für die Isolation von mRNA war die Zahl der verbleibenden Glomeruli pro Tier jedoch nicht ausreichend (ca. 5-10 µg pro Tier), so daß hier weiter Glomeruli von 3-4 Tieren gepoolt werden mußten.
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Gruppe |
Zahl der Glomeruli (MW +SEM) |
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Normale Kontrollen |
34600+3600 |
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Anti- Thy 1-Glomerulonephritis |
51200+5200 |
In diesem Vorversuch wurde analysiert, über welchen Zeitraum die Matrixproteine TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 konstant von Glomeruli in den Kulturüberstand sezerniert werden.
Wie in Abb. 3 zu sehen ist, wird TGF-ß1 über drei Tage mit relativ konstanter Rate von den Glomeruli in den Überstand abgegeben. Nach 24 Stunden Kultur fand sich 611±52 pg/ml TGF-ß1 im Überstand. Nach 48 Stunden stieg die Konzentration auf 1007±74 pg/ml und nach 72 Stunden auf 1187±68 pg/ml im Kulturmedium an.
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Abb. 3: Produktion von TGF-ß1 in Kultur im Zeitverlauf. Jeweils 2000 Glomeruli pro ml Kulturmedium von 4 nephritischen Tieren wurden für 24, 48 und 72 Stunden kultiviert. Die Konzentration von TGF-ß1 im Kulturüberstand wurde mittels ELISA gemessen. Die Glomeruli wurden sechs Tage nach Induktion der Glomerulonephritis isoliert.
Für die Matrixproteine Fibronektin und PAI-1 (Abb. 4) konnten vergleichbare Zeitverläufe dokumentiert werden. Die Menge Fibronektin stieg von 1083±149 ng/ml nach 24 Stunden, über 1654±172 ng/ml nach 48 Stunden auf 2344±291 ng/ml nach 72 Stunden stetig an. Für PAI-1 fanden sich entsprechend 33±5, 39±11 bzw. 59±16 ng/ml nach 24, 48 und 72 Stunden im Kulturüberstand.
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Abb. 4: Produktion von Fibronektin und PAI-1 in Kultur im Zeitverlauf. Jeweils 2000 Glomeruli pro ml Kulturmedium von 4 nephritischen Tieren wurden für 24, 48 und 72 Stunden kultiviert. Fibronektin und PAI-1 wurde mittels ELISA gemessen. Die Glomeruli wurden 6 Tage nach Induktion der Glomerulonephritis isoliert.
Vergleichbar zu der Fragestellung in 3.1.1 haben wir die NO-Synthese von Glomeruli in Kultur über die Zeit untersucht. Verwandt wurden jeweils Glomeruli von 4 normalen und 4 nephritischen Tieren. Bei den nephritischen Tieren wurden die Glomeruli sechs Stunden nach Induktion der Glomerulonephritis isoliert. Bei den normalen Tieren entspricht die NO-Produktion der Aktivität der endothelialen NOS III, bei den nephritischen Tieren der induzierbaren NOS II.
Wie in Abb. 5 zu sehen ist, gaben die normalen und nephritischen Glomeruli NO über insgesamt 72 Stunden mit relativ konstanter Rate in den Kulturüberstand ab. Bei den Glomeruli von normalen Tieren war die NO-Produktion relativ gering. Nach 24
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Stunden fanden sich 0,6±0,2 nmol/ml Nitrit im Überstand. Nach 48 Stunden waren es 1,2±0,1 nmol/ml und nach 72 Stunden 1,7 nmol/ml Nitrit im Überstand. Bei den nephritischen Glomeruli war die NO-Produktion deutlich höher. Hier fanden sich 4,2±1,4 nmol/ml Nitrit nach 24 Stunden, 8,6±3,5 nmol/ml nach 48 Stunden und 11,2±4,8 nmol/ml nach 72 Stunden im Kulturüberstand.
Abb. 5: Produktion von Nitrit(Abbauprodukt von NO=NOx) in Kultur im Zeitverlauf. Jeweils 2000 Glomeruli pro ml Kulturmedium von 4 normalen und 4 nephritischen Tieren wurden für 24, 48 und 72 Stunden kultiviert. Die Glomeruli der nephritischen Tiere wurden sechs Stunden nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis isoliert. Nitrit wurde mit der Griess-Reaktion gemessen.
Aus dem Vorversuch 3.1.1 und 3.1.2 leiteten wir ab, daß Glomeruli über mindestens 72 Stunden in Kultur vital bleiben.
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In diesem Versuch wurde die Frage untersucht, ob die Matrixproteinsynthese in Kultur der tatsächlichen in-vivo-Konzentration dieser Matrixproteine entspricht. Zur Beantwortung dieser Frage wurden von jeweils 4 normalen und 4 nephritischen Tieren die Glomeruli isoliert. Ein Teil wurde für 72 Stunden kultiviert, der andere direkt nach der Isolation mittels Ultraschall lysiert. Anschließend wurde die Konzentration von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 im Kultur- bzw. Lysatüberstand verglichen.
Wie in Abb. 6 dargestellt, findet sich bei Glomeruli von normalen Tieren in-vivo und im Kulturüberstand nur eine geringe Konzentration von TGF-ß1. Im Lysat wurden 81±10 pg/ml TGF-ß1 und im Kulturüberstand 117±11 pg/ml TGF-ß1 gemessen. Die Glomeruli
Abb. 6: Konzentration von TGF-ß1 im Kulturüberstand nach 72 h oder im direkt gewonnenen Lysat (in-vivo-Gehalt). Die Glomeruli wurden jeweils in einer Konzentration von 2000 pro ml eingesetzt. Untersucht wurden die Glomeruli von jeweils 4 normalen und 4 nephritischen Tieren (Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis).von nephritischen Tieren zeigten deutliche höhere TGF-ß1-Werte. Im Lysat wurden 347±30 pg/ml TGF-ß1 und im Kulturüberstand 948 pg/ml TGF-ß1 gemessen. Vergleicht man den relativen Anstieg von normaler zu nephritischer TGF-ß1-Konzentration, ist der Unterschied im Lysat 428% und im Kulturüberstand 810%.
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Vergleichbare Daten wurden für die Matrixproteine Fibronektin und PAI-1 gefunden (Abb.7). Bei den normalen Tieren fand sich 168±16 ng/ml Fibronektin im Lysat und 463±47 ng/ml Fibronektin im Kulturüberstand. Bei den nephritischen Tieren wurden entsprechend 988±207 ng/ml und 4132±356 ng/ml Fibronektin gemessen. Hieraus ergibt sich eine relative Differenz von normaler zu nephritischer Fibronektin-Konzentration von 588% im Lysat und von 892% im Kulturüberstand.
Abb. 7: Konzentration von Fibronektin und PAI-1 im Kulturüberstand nach 72 h oder im direkt gewonnenen Lysat (in-vivo-Gehalt). Die Glomeruli wurden jeweils in einer Konzentration von 2000 pro ml eingesetzt. Untersucht wurden die Glomeruli von jeweils 4 normalen und 4 nephritischen Tieren (Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis).
Für PAI-1 fanden sich bei den normalen Tieren 11±5 pg/ml im Lysat und 16±7 pg/ml im Kulturüberstand (Abb. 7). Bei dem nephritischen Tieren stieg die PAI-1 Konzentration auf 45±10 pg/ml im Lysat und auf 212±33 pg/ml im Kulturüberstand an. Dieses ergibt einen relativen Unterschied von normaler zu nephritischer PAI-1-Konzentration von 409% im Lysat und von 1325%, wenn der Kulturüberstand gemessen wurde.
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Die Daten aus 3.2.3 zeigen somit, 2) daß die Matrixproteinproduktion in den Kulturüberstand der tatsächlichen Konzentration dieser Matrixproteine in-vivo entspricht; 2) daß die Glomeruli in Kultur Matrixproteine in einer Menge produzieren, die der in-vivo-Situation entspricht, aus der heraus sie isoliert wurden; und 3) daß bei der Messung der Matrixproteine im glomerulären Kulturüberstand weitaus größere Unterschiede zwischen normaler und nephritischer Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAi-1 zu finden sind.
Um den Zeitpunkt mit der größten Differenz zwischen normaler und maximaler Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 zu ermitteln, wurden jeweils 4 Versuchstiere 6 und 12 Stunden sowie 1, 3, 6, 8, 10, 14 und 28 Tage nach Induktion der Glomerulonephritis untersucht. Die Matrixproteine wurden im Kulturüberstand gemessen.
Wie in Abb. 8 dargestellt, zeigte die TGF-ß1-Expression im Verlauf der Anti-Thy1-Glomerulonephritis einen biphasischen Verlauf. Bei den normalen Tieren wurde 224±42 pg/ml TGF-ß1 im Kulturüberstand gemessen. Am Tag 1 nach Glomerulonephritis-Induktion stieg die TGF-ß1-Expression auf 935 pg/ml, fiel am Tag 3 auf 473±48 pg/ml, um dann am Tag 6 wieder auf 767 pg/ml anzusteigen. Im weiteren Verlauf fielen die TGF-ß1-Werte allmählich wieder ab und waren am Tag 28 bei 155±59 pg/ml.
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Abb. 8: Expression von TGF-ß1 im Zeitverlauf der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Glomeruli einzelner Tiere wurden zu den angegebenen Zeitpunkten isoliert. Die Konzentration von TGF-ß1 wurde mittels ELISA im Überstand nach 72stündiger Kultur gemessen.
Die Fibronektin- und PAI-1-Expression zeigte einen ähnlichen Verlauf. Fibronektin stieg innerhalb der ersten 24 Stunden rasch von 852±160 ng/ml auf 3207±657 ng/ml an (Abb. 9). Das Maximum fand sich am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis mit 4617±496 ng/ml im Kulturüberstand. Im weiteren Verlauf fiel die Fibronektin-Expression dann stetig auf fast normale Werte am Tag 28 (1422±282 ng/ml) wieder ab.
PAI-1 zeigte den stärksten Anstieg innerhalb der ersten 24 Stunden (Abb. 9). Die PAI-1-Expression stieg von 20±6 ng/ml bei normalen Glomeruli auf 218±47 ng/ml an. Nach einen Abfall bis zum Tag 3 (62±11 ng/ml) wurde am Tag 6 nach Induktion der
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Glomerulonephritis ein zweiter Gipfel mit 123±30 ng/ml beobachtet. Im weiteren Verlauf fiel die PAI-1-Expression wieder ab, ohne jedoch bis zum Tag 28 (58±13 ng/ml) wieder normale Werte zu erreichen.
Abb. 9: Expression von Fibronektin und PAI-1 im Zeitverlauf der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Glomeruli einzelner Tiere wurden zu den angegebenen Zeitpunkten isoliert. Die Konzentration von Fibronektin wurde mittels ELISA im Überstand nach 72stündiger Kultur gemessen.
Aus diesem Versuch ergibt sich, daß die höchste Produktion von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 sechs Tage nach Induktion der Glomerulonephritis zu finden ist. Der Anstieg der Matrixproteine in den ersten 24 Stunden ist wahrscheinlich Folge der abgelaufenen Mesangialzellyse und nicht Ausdruck einer gesteigerten glomerulären Synthese. In den folgenden Experimenten zur Matrixexpansionsphase der akuten Anti-Thy1-Glomerulonephritis wurde die Messung der „Fibroseaktivität“ immer am Tag 6 vorgenommen.
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Im Modell der akuten Anti-Thy1-Glomerulonephritis entspricht der Grad der glomerulären Matrixakkumulation dem Ausmaß der vorangegangenen Mesangialzellyse. Um auch hier eine möglichst große Differenz zwischen normaler und nephritischer Matrixproteinexpression zu erzielen, wurden Versuchstieren steigende Dosen des Anti-Thy1-Antikörpers OX-7 injiziert. Am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis wurde die Matrixakkumulation histologisch erfaßt sowie die Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 im Kulturüberstand bestimmt.
Bei der glomerulären Matrixakkumulation fand sich erwartungsgemäß ein Dosis-abhängiger Effekt (Abb. 10). Mit der geringsten Dosis OX-7 wurde ein PAS-Score von 2,49±0,29 erzielt. Der maximaler Effekt wurde bei 1,5 mg/kg KG OX-7 beobachtet (2,83±0,11). Bei der höchsten OX-7-Dosis nahm die glomeruläre Matrixexpansion wieder ab (1,88±0,12).
Abb. 10: Glomeruläre Matrixakkumulation sechs Tage nach Induktion der Glomerulonephritis. Injiziert wurden steigende Dosen des Antikörpers OX-7.
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Wie in Abb. 11 dargestellt, zeigte die TGF-ß1-Expression einen angedeutet Dosis-abhängigen Verlauf. Mit der geringsten OX-7-Dosis wurde nur eine moderate TGF-ß-Überexpression erzielt. Ein maximaler Effekt wurde ab 1 mg/kg KG beobachtet. Die Varianz zwischen den Einzeltieren war bei 1,5 mg/kg KG am geringsten. Bei der höchsten OX-7-Konzentration nahm die TGF-ß1-Expression wieder ab.
Abb. 11: Expression von TGF-ß1 im glomerulären Kulturüberstand sechs Tage nach Induktion der Glomerulonephritis. Injiziert wurden steigende Dosen des Antikörpers OX-7.
Vergleichbare Ergebnisse wurden für die Fibronektin- und PAI-1-Expression (Abb. 12) beobachtet. Hier fand sich eine maximale Induktion der Synthese ab 1 mg/ kg KG OX-7 und die geringste Streuung der Einzelwerte bei 1,5 mg/kg KG OX-7.
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Abb. 12: Expression von Fibronektin im glomerulären Kulturüberstand sechs Tage nach Induktion der Glomerulonephritis. Injiziert wurden steigende Dosen des Antikörpers OX-7.
Zusammenfassend zeigt dieser Vorversuch, daß die höchste Expression der Matrixproteine TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 mit dem OX-7-Antikörper in einer Dosis von 1 bis 2 mg pro kg KG erzielen ist. Da die Standardabweichung zwischen den einzelnen Tieren am geringsten in der Gruppe mit 1,5 mg OX-7 pro kg KG war, wurde in den folgenden Versuchen diese Konzentration für die Induktion der Anti-Thy1-Glmerulonephritis gewählt.
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Die Gabe von 1% L-Arginin im Trinkwasser führte zu einer ca. 4-fachen Erhöhung der L-Argininzufuhr (614±46 mg/Tag) im Vergleich zu Tieren mit normalen Trinkwasser (Norm 158±13 mg/Tag, GN mit normalem Trinkwasser 153±18 mg/Tag) (Abb. 14). Futterverbrauch und Gewichtszunahme zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen (Daten nicht gezeigt).
Abb. 14: L-Argininzufuhr in den einzelnen Versuchstiergruppen. Angegeben ist jeweils die mittlere L-Argininzufuhr pro Tag und Tier. L-Arginin wurde im Trinkwasser (1%) gegeben.
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Die Injektion von Anti-Thy1-Antikörpern führte erwartungsgemäß zu einer starken Abnahme der glomerulären Zellzahl sechs Stunden nach Induktion der Glomerulonephritis (Abb. 15). In den normalen Kontrolltieren fanden sich im Mittel 64,2±0,1 Zellen pro Glomerulum. Bei den Tieren mit Anti-Thy1-Antikörper-Injektion verringerte sich die Zellzahl pro Glomerulum auf 53,4±0,7 (p<0,01 vs. Norm). Dieses entspricht einem Mesangialzellverlust von 11,8±0,7 pro Glomerulum. In den Tieren mit L-Argininvorbehandlung war die Zellzahl noch weiter auf 50,8±0,7 pro Glomerulum gesunken. Dieses entspricht einem Mesangialzellverlust von 13,6±0,7 (p<0,05 vs. GN). Diese Daten zeigen, daß die L-Arginingabe zu einer leichten, aber signifikanten Zunahme der glomerulären Mesangialzellyse geführt hat.
Abb. 15: Mesangialzellyse sechs Stunden nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (GN). Dargestellt ist die glomeruläre Zellzahl. Die normalen Kontrolltiere (Norm) wurden mit PBS injiziert. L-Arginin wurde im Trinkwasser (1%) beginnend 7 Tage vor Antikörperinjektion gegeben (* p<0,01 vs. Norm, ‚# p<0,05 vs. GN).
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Im Vergleich zu den normalen Kontrolltieren (0,6 ±0,2) nahm die Zahl der Makrophagen pro Glomerulum in den GN-Tieren mit normaler L-Argininzufuhr signifikant zu (5,1±0,6, p<0,01 vs. Norm) (Abb. 16). In den nephritischen Tieren, die mit L-Arginin vorbehandelt waren, war die Zahl ED-1-positiver Zellen hiervon statistisch nicht signifikant unterschiedlich (5,8±0,5, p= NS vs. GN, p<0,01 vs. Norm). Die L-Arginingabe hatte also keinen bedeutsamen Einfluß auf die Makrophageninfiltration.
Abb. 16: Glomeruläre Monozyten-/Makrophageninfiltration sechs Stunden nach Induktion der akuten Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Dargestellt ist die Anzahl der ED-1-positiven Zellen pro Glomerulum (* p<0,01 vs. Norm)
Im Vergleich zu den Kontrollen fand sich bei den nephritischen Tieren mit normaler L-Argininzufuhr ein ca. 104-facherAnstieg der NOS II-mRNA-Expression (104±24 vs.
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1±0, p< 0,001 GN vs. Norm) im Northern-Blot sechs Stunden nach Gabe des Anti-Thy1-Antikörpers (Abb. 17). In der Immunhistologie wurde ein ca. 9-facher Anstieg der NOS II-Proteinexpression (1,7±0,2 vs. 0,2±0,1, p<0,001, GN vs. Norm) gemessen (Abb. 18). Die Vorbehandlung mit L-Arginin hatte keinen weiteren Einfluß auf das Ausmaß der NOS II mRNA-Expression (104±19 vs. 1±0, p<0,001 vs. Norm, p=NS vs. GN) und der NOS II-Proteinexpression (1,6±0,3 vs. 0,2±0,1, p<0,001 vs. Norm, p=NS vs. GN) (Abb. 17 und 18)
Abb. 17: Glomeruläre NOS II-mRNA-Expression sechs Stunden nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Dargestellt ist A) ein repräsentativer Northern-Blot für NOS II und GAPDH sowie B) die quantitative Auswertung der glomerulären NOS II-mRNA-Expression in Relation zur GAPDH-Expression (* p<0,001 vs. Norm).
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Abb. 18: Glomeruläre NOS II-Proteinexpression sechs Stunden nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Mit Hilfe eines semiquantitativen Scoresystems (0-4) wurde die relative Färbeintensität der NOS II-Protein-Immunfluoreszenz ermittelt (* p <0,001 vs. Norm).
Zusammengefaßt zeigen diese Daten, daß die Gabe von L-Arginin die Makrophageninfiltration und NOS II-Expression bei Anti-Thy1-Glomerulonephritis nicht bedeutsam beeinflußt. Die Ursache für die ungünstige Wirkung von L-Arginin auf die Mesangialzellyse mußte also in einem höherem Substratangebot mit verstärkter NO-Bildung vermutet werden. Um dieses zu prüfen, wurden im folgenden die Veränderungen der Plasma-L-Arginin- und NOx-Spiegel sowie der Einfluß der extrazellulären L-Argininkonzentration auf die NO-Produktion nephritischer Glomeruli untersucht.
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In den Tieren mit normaler L-Argininzufuhr fand sich sechs Stunden nach Gabe des Anti-Thy1-Antikörpers ein starker Abfall der Plasma-L-Argininspiegel. Im Vergleich zu normalen Kontrollen wurde der L-Argininspiegel von 121±9 auf 84±13 nmol/ml (p< 0,05) vermindert (Abb. 19). Dieses ist als verstärkter Verbrauch von L-Arginin im Rahmen der Glomerulonephritis-Induktion zu interpretieren. Die Vorbehandlung mit L-Arginin verhinderte komplett diesen Abfall. In diesen Tieren war der L-Argininspiegel 37% höher als bei den normalen Kontrolltieren (166±12 vs. 121±9 nmol/ml, p<0,05) und 198% höher bei den GN-Tieren ohne L-Arginingabe (166±12 vs. 84±13 nmol/ml, p< 0,001).
Abb. 19: L-Argininkonzentration im Plasma sechs Stunden nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (GN). Alle Gruppen erhielten eine Diät mit normalen Proteinanteil (22% Kasein). Das Trinkwasser in Gruppe GN+ARG wurde mit 1% L-Arginin supplementiert (* p<0,05 vs. Norm, \|[PSgr ]\| p < 0,001 vs. GN).
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Bei den GN-Tieren mit normaler L-Argininzufuhr fand sich ein signifikanter Anstieg der Plasma-NOx-Konzentration (31±1.3 vs. 25,7±1,3 nmol/ml, p<0.01, GN vs. Norm) sechs Stunden nach Antikörperinjektion (Abb. 20). Dieses ist als Ausdruck einer verstärkten endogenen NO-Produktion im Rahmen der Induktion der Glomerulonephritis zu deuten. Bei den nephritischen Tieren, die mit L-Arginin vorbehandelt waren, fand sich ein weiterer signifikanter Anstieg der NOx-Konzentration (35,7±1,1 nmol/ml, p<0,05 vs. GN, p<0,01 vs. Norm), so daß hier von einer noch höheren endogenen NOx-Produktion auszugehen ist.
Abb. 20: NOx-Konzentration im Plasma sechs Stunden nach Induktion der Glomerulonephritis. Alle Gruppen erhielten eine Diät mit normalen Proteinanteil (22% Kasein). Das Trinkwasser in Gruppe GN+ARG wurde mit 1% L-Arginin supplementiert (* p<0,05 vs. Norm, # p< 0,05 vs. GN).
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In diesem Experiment wurden normale und nephritische Glomeruli mit steigenden L-Argininkonzentrationen inkubiert und nach 48 h die NOx-Konzentration im Überstand bestimmt. In Voruntersuchungen konnten wir zeigen, daß die NOx-Produktion nephritischer Glomeruli von Tieren mit und ohne L-Arginingabe nahezu gleich war. In diesem Experiment ist daher die NOx-Produktion von normalen und nephritischen Glomeruli einander gegenübergestellt.
Die NOx-Produktion in L-Arginin-freiem Kulturmedium war bei nephritischen Glomeruli leicht aber signifikant höher als bei den normalen Glomeruli (0,0 nmol/ml Arginin: 2,1±0,3 vs. 1,4 ±0,1 nmol/ml, p<0,05 GN vs. Norm) (Abb. 21). Die Zunahme der L-Argininkonzentration führte bei den normalen Glomeruli zu keiner signifikanten Änderung der NOx-Synthese (L-Argininkonzentration max. 1000 nmol/ml, NOx max. 1,4±0,1 nmol/ml, p=NS). Bei den nephritischen Glomeruli mit induzierter NOS II zeigte sich hingegen, daß deren NOx-Produktion sehr stark von dem extrazellulären L-Argininangebot abhängig war. Eine deutliche Zunahme der NOx-Produktion (2,8±0,1 nmol/l) wurde ab 50 nmol/ml L-Arginin im Kulturmedium beobachtet. Das Maximum der NOx-Synthese mit 4,4±0,2 nmol/ml wurde bei einer L-Argininkonzentration von 500 nmol/ml gemessen.
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Abb. 21: NO-Produktion in Abhängigkeit von der L-Argininkonzentration im Kulturmedium. Untersucht wurden die Glomeruli von 4 normalen und 4 nephritischen Tieren. Die Glomeruli der nephritischen Tiere wurden sechs Stunden nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis isoliert. Die Bildung von Nitrit als Endprodukt von NO diente als Maß für die NO-Synthese.
Die Daten des L-Arginin-NO-Stoffwechsels zeigen somit, daß die negative Wirkung der L-Arginingabe auf die Mesangialzellyse wahrscheinlich über ein verstärktes Substratangebot für die NOS II vermittelt wird.
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Im Vergleich zu den normalen Kontrollen führte die Induktion der Glomerulonephritis zu einer signifikanten Zunahme der Proteinausscheidung am Tag 2 und Tag 5 nach Antikörpergabe (Abb. 22). Bei den Tieren, die L-Arginin bis 16 Stunden nach Induktion der Glomerulonephritis erhielten, war am Tag 2 die Proteinurie jedoch signifikant höher als bei den Tieren mit normaler L-Argininzufuhr (127±8 vs. 102±16 mg/24h, p<0,05 GN+Arg vs. GN). Am Tag 5 war die Proteinurie zwischen beiden nephritischen Gruppen wieder nahezu gleich (49±13 vs. 50±5 mg/24h, p=NS GN+Arg vs. GN).
Abb. 22: Zeitverlauf der Proteinurie bei normalen und nephritischen Tieren (GN). Bei der Gruppe GN+Arg wurde 1% L-Arginin im Trinkwasser beginnend 7 Tage vor und bis 16 h nach Injektion der Anti-Thy1-Antikörper gegeben. An den Untersuchungszeitpunkten wurde jeweils ein 24-h-Urin mittels metabolischer Käfige gesammelt (* p<0,05 vs. GN).
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Im Vergleich zu den mit PBS-injizierten Kontrolltieren bewirkte die Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis bei den Tieren mit normaler Argininzufuhr erwartungsgemäß eine deutliche Zunahme der Matrixakkumulation (2,35±0,06 vs. 1,16±0,05, GN vs. Norm p<0,001) am Tag 6 (Abb. 23). Gleichermaßen fand sich auch eine stark erhöhte glomeruläre Synthese von TGF-ß1 (608±34 vs. 142±24 pg/ml, p<0,001, GN vs. Norm) (Abb. 24), Fibronektin (2369±245 vs. 511±76 ng/ml, p<0,001, GN vs. Norm) und PAI-1 (160±14 vs. 20±4 ng/ml, p<0,001, GN vs. Norm) (Abb. 25).
Abb.23: Wirkung der L-Arginingabe auf die Mesangialzellyse gemessen anhand der nachfolgenden glomerulären Matrixakkumulation am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis. In den Tieren mit L-Arginingabe wurde 1 % L-Arginin im Trinkwasser für 7 Tage vor und bis 16 h nach Antikörperinjektion gegeben. In der weiteren Zeit hatten die Tiere eine normale L-Argininzufuhr (* p<0,001 vs. Norm, # p <0,05 vs. GN).
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Im Vergleich zu den nephritischen Tieren mit normaler L-Argininzufuhr bewirkte die L-Arginingabe vor und während der Mesangialzellyse eine moderate, aber signifikante Zunahme der glomerulären Matrixakkumulation (2,57±0,07 vs. 2,35±0,06, p<0,05 GN+Arg vs. GN) (Abb. 23) und der glomerulären Produktion von TGF-ß1 (748±43 vs. 608±34 pg/ml, p<0,05 GN+Arg vs. GN) (Abb. 24), Fibronektin (2985±211 vs. 2369±245 ng/ml, p<0,05 GN+Arg vs. GN) und PAI-1 (222±26 vs. 160±14 ng/ml, p<0,05 GN+Arg vs. GN) (Abb. 25).Abb. 24: Wirkung der L-Arginingabe (1% im Trinkwasser) auf die Mesangialzellyse gemessen anhand der nachfolgenden TGF-ß1-Expression am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis. Die TGF-ß1-Proteinexpression wurde aus dem Überstand von kultivierten Glomeruli mittels ELISA gemessen(* p<0,001 vs. Norm, # p <0,05 vs. GN).
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Abb. 25: Wirkung der L-Arginingabe (1% im Trinkwasser) auf die Mesangialzellyse gemessen anhand der nachfolgenden Fibronektin- und PAI-1-Expression am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis. Die Fibronektin- und PAI-1-Expression wurde aus dem Überstand von kultivierten Glomeruli mittels ELISA gemessen(* p<0,001 vs. Norm, # p <0,05 vs. GN).
Zusammenfassend zeigen die Daten der histologischen Matrixexpansion und der Matrixproteinexpression übereinstimmend, daß die verstärkte Mesangialzellyse durch L-Arginingabe von einer ausgeprägteren Fibrosereaktion gefolgt wird.
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Die Fütterung von Normal- und Niedrigproteindiät mit und ohne L-Arginin im Trinkwasser führte erwartungsgemäß zu deutlichen Unterschieden in der L-Argininzufuhr zwischen den einzelnen Gruppen (Abb. 26). Die mittlere L-Argininzufuhr war 160 mg pro Tag in den normalen Kontrolltieren und 155 mg in den unbehandelten GN-Tieren mit Normalproteindiät. Die Fütterung der Niedrigproteindiät verminderte die L-Argininzufuhr ca. 3.5-fach auf 45 mg pro Tag. Die Gabe von 1% L-Arginin im Trinkwasser erhöhte die tägliche L-Argininaufnahme auf 580 mg in den Normalproteintieren und auf 350 mg in den Niedrigproteintieren. Dieses entspricht einer relativen Zunahme des 3,6- und 7,7-fachen innerhalb der gleichen Futtergruppe.
Der Futter- und Wasserkonsum zwischen den Tiergruppen war statistisch nicht signifikant unterschiedlich. Das Körpergewicht zwischen den Tiergruppen zeigte ebenfalls keine signifikanten Unterschiede (Daten nicht gezeigt).
Abb. 26: Erreichte L-Argininzufuhr je Behandlungsgruppe. Die Tiere erhielten entweder eine Diät mit normalem oder erniedrigtem Proteingehalt (NP, 22% Kasein vs. LP, 6% Kasein). L-Arginin wurde im Trinkwasser als 1%igte Lösung gegeben. Angegeben ist jeweils die mittlere Argininzufuhr in mg pro Tag.
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Im Vergleich zu den normalen Kontrolltieren (115±14 mmol/ml) führte die Glomerulonephritis zu einer signifikanten Verringerung der Plasma-L-Arginin-Spiegel (Abb. 27). Dieses wurde sowohl bei den Tieren mit Normalproteindiät (GN-NP 52±9 mmol/ml) als auch bei den Tieren mit Niedrigproteindiät (GN-LP 77±5 mmol/ml) beobachtet. Dieser Abfall ist Ausdruck eines verstärkten L-Argininumsatzes. Die L-Arginingabe führte zu einer deutlichen Zunahme der Plasma-L-Arginin-Spiegel. In den nephritischen Tieren mit normaler Proteinzufuhr waren diese 232% (GN-NP+Arg 176±18 mmol/ml) und in den Tieren mit beschränkter Proteinzufuhr 338% (GN-LP+Arg 174±13 mmol/ml) höher als in den korrespondierenden Tieren ohne L-Arginingabe.
Abb. 27: Plasma-L-Argininspiegel sechs Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (GN). Die Tiere erhielten entweder eine Diät mit normalem oder erniedrigtem Proteingehalt (NP, 22% Kasein vs. LP, 6% Kasein). L-Arginin wurde im Trinkwasser als 1%ige Lösung gegeben (* p <0,05 vs. Norm).
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Die Gabe von L-Arginin hatte keinen Einfluß auf den systolischen Blutdruck der Tiere (Abb. 32). Es wurden 111±8 mm Hg bei den normalen Kontrollen, 110±6 mm Hg bei den GN+NP-, 113±3 mm Hg bei den GN-NP+Arg-, 114±6 mm Hg bei den GN+LP- und 111±7 mm Hg bei den GN-LP+Arg-Tieren gemessen.
Abb. 28: Systolischer Blutdruck je Behandlungsgruppe fünf Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (GN). Der Blutdruck wurde bei wachen Tieren mittels Schwanzplethysmographie ermittelt.
Die Induktion der Glomerulonephritis bewirkte eine signifikante Zunahme der Proteinurie im Vergleich zu den normalen Kontrollen (16±2 mg/24h) (Abb. 29). In den GN-Tieren mit normaler L-Argininzufuhr stieg sie auf 52±10 mg/24h. Im Vergleich
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dazu bewirkte die Fütterung der Niedrigproteindiät einen signifikanten Abfall der Proteinausscheidung (GN-LP 14±5 mg/24h, p< 0,01). In beiden Fütterungsgruppen bewirkte die Zugabe von L-Arginin keine signifikante Änderung der Proteinausscheidung (GN-NP+Arg 60±12 mg/24h, GN-LP+Arg 10±4 mg/24h). Zusammenfassend zeigte sich also, daß die Proteinurie durch die Proteinzufuhr nicht aber durch die L-Argininmenge beeinflußt wird.
Abb. 29: Wirkung der L-Arginingabe auf die Proteinurie sechs Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (GN). Die Sammlung des 24-h-Urins erfolgte in metabolischen Käfigen vom Tag 5 zum Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis (* p<0,01 vs. Norm).
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Die Induktion der Glomerulonephritis bewirkte erwartungsgemäß eine deutliche Zunahme der Matrixmenge im Glomerulum (Norm 1,12±0,03 vs. GN-NP 2,58±0,04, P< 0,001) (Abb. 30). Sowohl die L-Arginingabe als auch die Niedrigproteindiät führten beide zu einer signifikanten Abnahme der Matrixexpansion (GN-NP+Arg 2,13±0,06, GN-LP 2,09±0,04, beide p<0.05 vs. GN). Der Unterschied zwischen beiden Gruppen war statistisch nicht signifikant.
Abb. 30: Wirkung der L-Arginingabe auf die glomeruläre Matrixexpansion sechs Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (GN). Die Tiere erhielten eine Diät mit normalem Proteingehalt (NP, 22% Kasein) oder erniedrigtem Proteingehalt (LP, 6% Kasein) (* p<0,01 vs. GN-NP, # p<0,05 vs. GN-NP+Arg oder GN-LP).
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Im Vergleich zu den normalen Kontrollen führte die GN-Induktion zu einer 8,9-fachen Zunahme der TGF-ß1-Synthese, einer 15-fachen Zunahme der Fibronektin-Synthese und einer 25-fachen Zunahme der PAI-1-Synthese (Abb. 31 und 32).
Beide Ansätze, die alleinige L-Arginingabe und die alleinige Proteinrestriktion, führten zu einer signifikanten Reduktion der Fibroseparameter. Im Vergleich zu den unbehandelten GN-Tieren (GN-NP 912±39 pg/ml) bewirkte die L-Arginingabe (GN-NP+Arg) eine Verminderung der TGF-ß1-Expression auf 551±87 pg/ml (-40%) (Abb. 31). Die glomeruläre Fibronektin-Produktion verminderte sich von 3801±160 ng/ml (GN-NP) auf 2266±287 ng/ml (-41%) (Abb. 32). Die PAI-1-Produktion sank von 178±18 ng/ml auf 78±12 ng/ml (-50%) (Abb. 32). Die alleinige Proteinrestriktion verminderte diese Parameter in vergleichbarem Umfang: TGF-ß1 510±71 pg/ml (-44%), Fibronektin 1884±206 ng/ml (-50%) und PAI-1 71±7 ng/ml (-60%) (Abb. 31 und 32). Die Unterschiede zwischen beiden Gruppen waren sehr gering und statistisch nicht signifikant.
Abb. 31: Wirkung der L-Arginingabe auf die Proteinexpression von TGF-ß1 sechs Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Die Expression von TGF-ß1 wurde im Überstand von kultivierten Glomeruli mittels ELISA gemessen (* p<0,01 vs. GN-NP, # p<0,05 vs. GN-NP+Arg oder GN-LP).
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Abb. 32: Wirkung der L-Arginingabe auf die Proteinexpression von Fibronektin und PAI-1 sechs Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Die Expression von Fibronektin und PAI-1 wurde im Überstand von kultivierten Glomeruli mittels ELISA gemessen (* p<0,01 vs. GN-NP, # p<0,05 vs. GN-NP+Arg oder GN-LP).
In Abb. 33 ist ein repräsentativer Northern-Blot dargestellt. Die Induktion der Glomerulonephritis (GN-NP) bewirkte einen 3,7-fachen Anstieg der TGF-ß1-mRNA, einen 35-fachen Anstieg der Fibronektin-mRNA und einen 63-fachen Anstieg der PAI-1-mRNA (Abb. 34 und 35).
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Abb. 33: Wirkung der L-Arginingabe auf die mRNA-Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 in Relation zur GAPDH-Expression sechs Tage nach Induktion der Glomerulonephritis. Abgebildet ist ein repräsentativer Northern-Blot.
Die L-Arginingabe und Proteinrestriktion zeigten auch auf mRNA-Ebene vergleichbar günstige Effekte (Abb. 34 und 35). Die L-Arginingabe senkte die TGF-ß1-Expression auf 2,46±0,11 (-34%), die Fibronektin-Expression auf 13,85±3,49 (-62%) und die PAI-1-Expression auf 25,78±7,18 (-60%). Mit der Niedrigproteindiät wurden vergleichbare Reduktionen erzielt: TGF-ß1 2,31±0,15 (-38%), Fibronektin 12,68±2,64 (-64%) und PAI-1 25,91±9,57 (-58%). Die Unterschiede zwischen beiden Gruppen waren nicht signifikant.
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Abb. 34: Wirkung der L-Arginingabe auf die relative mRNA-Expression von TGF-ß1 im Vergleich zur Expression von GAPDH sechs Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (* p<0,01 vs. GN-NP).
Abb. 35: Wirkung der L-Arginingabe auf die relative mRNA-Expression von Fibronektin und PAI-1 im Vergleich zur Expression von GAPDH sechs Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (* p<0,01 vs. GN-NP).
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Bei allen untersuchten Parametern, mit Ausnahme der Proteinurie, fanden sich bei der Kombination von L-Arginingabe und Proteinbeschränkung günstigere Effekte als bei alleiniger Therapie. So verminderten L-Arginin und Proteinrestriktion zusammen die Matrixakkumulation auf 1,89±0,04 (p<0,05 vs. GN-NP+Arg und GN-LP). Auf Proteinebene nahm die TGF-ß1-Expression auf insgesamt 284±26 pg/ml ab (p<0,05 vs. GN-NP+Arg und GN-LP). Im Vergleich zu den nephritischen Tieren ohne Behandlung wurde damit eine Reduktion um 69% erreicht. Die glomeruläre Fibronektin-Produktion nahm auf insgesamt 1086±76 ng/ml ab (p<0,05 vs. GN-NP+Arg und GN-LP, Gesamtreduktion -71%), die PAI-1-Produktion sank auf 36±5 ng/ml ab (p<0,05 vs. GN-NP+Arg und GN-LP, Gesamtreduktion -79%).
Auf mRNA-Ebene wurden für TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 von der Tendenz her vergleichbare Ergebnisse erzielt. Eine statistische Signifikanz wurde jedoch nicht erreicht. Die TGF-ß1-Expression wurde auf insgesamt 1,78±0,28 (p=NS vs. GN-NP+Arg und GN-LP) vermindert. Die glomeruläre Fibronektin-mRNA-Expression nahm auf insgesamt 6,54±1,93 (p=NS vs. GN-NP+Arg und GN-LP) und die PAI-1-mRNA-Expression auf insgesamt 14,83±5,12 ab (p=NS vs. GN-NP+Arg und GN-LP).
Zusammenfassend zeigen die Daten zur Matrixproteinexpression, daß 1) die L-Arginingabe auch in Abwesenheit von erhöhtem Blutdruck einen günstigen Einfluß auf die renale Matrixvermehrung nimmt, 2) die L-Arginingabe additiv günstig zur Eiweißrestriktion ist, und 3) die antifibrotische Wirkung der L-Arginingabe über eine Abnahme der TGF-ß-Expression vermittelt zu sein scheint.
Die Wirkung der L-Arginingabe und der Proteinbeschränkung auf die NO-Synthese wurde anhand der Messung von Nitrat/Nitrat(NOx) im Plasma, Urin und im Überstand kultivierter Glomeruli ermittelt.
Im Plasma ging weder die Induktion der Glomerulonephritis, noch die L-Arginingabe oder die Proteinrestriktion mit einer signifikanten Veränderungen der NOx-
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Konzentration einher (Abb. 36). Gemessen wurden 28±3 nmol/ml NOx in den normalen Kontrolltieren, 27±2 nmol/ml in den nephritischen Tieren ohne Behandlung, 26±5 nmol/ml in den Tieren mit normaler Proteinzufuhr und Gabe von L-Arginin, 28±2 nmol/ml in der Gruppe mit Proteinrestriktion, sowie 29±3 nmol/ml in der Gruppe mit Proteinrestriktion und Gabe von L-Arginin.
Abb. 36: Wirkung der L-Arginingabe auf die NOx-Spiegel im Plasma am Tag sechs nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Gemessen wurden Nitrit und Nitrat als Endprodukte des NO-Stoffwechsels.
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Signifikante Unterschiede wurden in der NOx-Ausscheidung am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis zwischen den Gruppen gefunden (Abb. 37). Im Urin der normalen Kontrolltiere wurde 3152±291 nmol/24h NOx gemessen. Weder die Glomerulonephritis (GN-NP 2563±553 nmol/24h) noch die L-Arginingabe (GN-NP+Arg, 3003±482 nmol/24h) zeigte einen signifikanten Einfluß auf die NOx-Ausscheidung. Die Reduktion der Proteinzufuhr hingegen führte in beiden Gruppen zu einer signifikanten Abnahme der NOx-Ausscheidung, ohne das jedoch die L-Arginingabe einen eigenen Einfluß zeigte (GN-LP 1651±162 nmol/24h, GN-LP+Arg 1163±387 nmol/24h, beide p< 0,05 vs. Norm, GN-NP und GN-NP+Arg).
Abb. 37: Wirkung der L-Arginingabe auf die NOx-Ausscheidung am Tag sechs nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Gemessen wurden Nitrit und Nitrat als Endprodukte des NO-Stoffwechsels (# p<0,05 vs NP).
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Auch bei der glomerulären NOx-Synthese fanden sich signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (Abb. 38). Im Vergleich zu den normalen Kontrolltieren (0,6±0,1 nmol/ml) bewirkte die Glomerulonephritis eine deutliche Zunahme der glomerulären NO-Synthese (GN-NP 3,4±0,5 nmol/ml). Die L-Arginingabe hatte in den nephritischen Tieren mit normaler Proteinzufuhr keinen weiteren Einfluß (3,4±0,8 nmol/ml). Die Reduktion der Proteinzufuhr bewirkte in beiden Gruppen wiederum eine deutliche Abnahme der glomerulären NOx-Produktion, ohne das jedoch wieder normale Werte erreicht wurden. Gemessen wurden 1,3±0,3 nmol/ml in der GN-LP-Gruppe und 1,3±0,3 nmol/ml in der GN-LP+Arg-Gruppe. Auch hier zeigte die L-Arginingabe keinen eigenen Einfluß auf die glomeruläre NOx-Produktion
Abb. 38: Wirkung der L-Arginingabe auf die glomeruläre NOx-Produktion kultivierter Glomeruli sechs Tage nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Gemessen wurde Nitrit als Endprodukt des NO-Stoffwechsels (* p<0,01 vs. Norm, # p<0,05 vs. Norm, GN-NP und GN-NP+Arg).
Zusammenfassend zeigen die Daten des NO-Stoffwechsels, daß die Gabe von L-Arginin keinen signifikanten Einfluß auf die gemessenen Parameter der NO-Synthese hatte. Die Unterschiede, die beobachtet wurden, folgten vielmehr der jeweiligen Proteinzufuhr.
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Futter- und Trinkwasserverbrauch waren zwischen den Gruppen nicht signifikant unterschiedlich (Daten nicht gezeigt). Die erreichte mittlere L-Argininzufuhr in den verschiedenen Versuchsgruppen ist in der Abb. 39 dargestellt. Gezeigt sind exemplarisch die Daten, die in der zweiten Versuchswoche erhoben wurden. In den Lupusmäusen mit normaler Proteinzufuhr wurden im Mittel 31,4±1,8 mg L-Arginin pro Tag zugeführt. In den Tieren mit zusätzlich 1% L-Arginin im Trinkwasser waren es 102,8±1,9 mg pro Tag. Die Reduktion der Proteinmenge im Futter verringerte die L-Argininzufuhr auf 9,7±0,1 mg pro Tag (LN-LP). Wurde zusätzlich 1% L-Arginin im Trinkwasser gegeben, erreichte die tägliche L-Argininzufuhr 73,6±6,4 mg (LN-LP+Arg).
Abb. 39: L-Argininzufuhr in Lupusmäusen mit normaler Proteinzufuhr (NP, 22% Kasein) oder beschränkter Proteinzufuhr (LP, 6% Kasein). In Subgruppen wurde 1% L-Arginin(+Arg) im Trinkwasser gegeben. Exemplarisch für den Versuch sind Daten aus der zweiten Versuchswoche dargestellt.
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Der Verlauf des Körpergewichts in den Versuchsgruppen ist in Abb. 40 dargestellt. Zu Versuchsbeginn (16. Lebenswoche) wogen die Lupusmäuse ca. 40 g. Zwischen den Versuchsgruppen bestand kein signifikanter Unterschied. Das mittlere Startgewicht war 40,8±0,8 g in der LN-NP-Gruppe, 39,3±1,4 g in der LN-LP+Arg-Gruppe, 41,2±0,8 g in der LN-LP-Gruppe und 38,2±0,7 g in der LN-LP-Gruppe. Im Versuchsverlauf änderte sich das Gewicht in den verschiedenen Gruppen nicht signifikant. Am Versuchsende wogen die LN-NP-Tiere im Mittel 40,9±1,4 g, die LN-NP+Arg-Tiere 38,6±1,5 g, die LN-LP-Tiere 41,8±1,0 g und die LN-LP+Arg-Tiere 39,5±1,5 g. Diese Daten belegen, daß die erreichte Gesamtkalorienzufuhr in den verschiedenen Versuchsgruppen vergleichbar war und die im folgenden beschriebenen Veränderungen der Krankheitsaktivität nicht als Folge unterschiedlichen Freßverhaltens der Mäuse zu interpretieren sind.
Abb. 40: Verlauf des mittleren Körpergewichts in Lupusmäusen mit normaler Proteinzufuhr (22% Kasein) oder beschränkter Proteinzufuhr (6% Kasein). In Subgruppen wurde 1% L-Arginin(+Arg) im Trinkwasser gegeben. Beginn des Versuchs war die 16. Lebenswoche (Beginn). Ende war die 21. Lebenswoche (Ende).
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In Abb. 41 ist die Albuminausscheidung im 24-Stundenurin am Versuchsende (21. Lebenswoche) dargestellt. In der LN-NP-Gruppe wurden im Mittel 4,5±1,0 mg/24h Albumin im 24-Urin gemessen. Die Gabe von 1% L-Arginin im Trinkwasser verdoppelte die Albuminurie (LN-NP+ARG 8,9±2,7 mg/24h). Aufgrund der hohen Streuung verfehlte dieser Unterschied die statistische Signifikanz (p=0,14). Die Fütterung der Niedrigproteindiät verringerte signifikant die Albuminurie (LN-LP 0,3±0,1 mg/24h, p<0,001 vs. LN-NP). Die zusätzliche L-Arginingabe führte wieder zu einer signifikanten Zunahme der Albuminausscheidung (LN-LP+Arg 3,6±0,8 mg/24h, p< 0,05 vs. LN-LP).
Abb. 41: Albuminausscheidung im 24-Stundenurin am Versuchsende (21. Lebenswoche). Gruppen von Lupusmäusen wurde eine Diät mit normalem (22% Kasein) oder verringertem Proteinanteil (6% Kasein) gefüttert. In Subgruppen wurde 1% L-Arginin(+Arg) im Trinkwasser gegeben. Der Urin wurde in Stoffwechselkäfigen gesammelt.:
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Die Gabe von L-Arginin hatte einen deutlichen Einfluß auf die Überlebensrate der Lupusmäuse. In der Gruppe mit normaler Proteinzufuhr waren nach 39 Versuchstagen (21. Lebenswoche) 50% der Mäuse verstorben, so daß, wie geplant, die verbliebenen Tiere aller Versuchsgruppen zur Materialgewinnung getötet wurden.
In Abb. 40 sind die Überlebensdaten der MRL/lpr-Mäuse dargestellt. Dabei wurden die beiden Basisdiäten (22% und 6% Kasein) zusammengefaßt und die Tiere nur danach unterschieden, ob L-Arginin gegeben wurde oder nicht. Hiernach waren am Versuchsende 14 von 36 Tieren mit L-Arginingabe verstorben. Bei den Tieren ohne L-Arginingabe waren es nur 4 von 36 Tieren. Dieser Unterschied war hochsignifikant (p=0,008). In den Untergruppen zeigte sich, daß in der Gruppe mit normaler Protein-
Abb. 42: Überlebensanalyse der Lupusmäuse. Ab der 16. Lebenswoche wurde 36 MRL/lpr-Mäusen 1% L-Arginin im Trinkwasser gegeben, 36 Lupusmäuse ohne L-Arginingabe dienten als Kontrollen. Die Basisdiät bestand zu gleichen Teilen aus 22% oder 6% Proteinzufuhr 9 von 18 Tieren mit L-Arginingabe und 4 von 18 Tieren ohne L-Arginingabe gestorben waren (p=0,09). In der Gruppe mit Proteinrestriktion waren es 5 von 18 Tieren mit L-Arginin und keines der Tiere ohne L-Arginin (p=0,01). Der Unterschied zwischen der LN-NP-Gruppe (4 von 18 Tiere) und der LN-LP-Gruppe (0 von 18 Tieren) war ebenfalls signifikant (p<0,05).
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In den am Versuchsende getöteten Tieren wurde die Wirkung der L-Arginingabe auf die renale Matrixexpansion untersucht. In der Abb. 43 sind die Daten der histologischen Auswertung dargestellt. Dabei wurde die glomeruläre und tubulointerstitielle Matrixakkumulation zu einem gemeinsamen Score zusammengefaßt. In beiden Diätgruppen konnte ein ungünstiger Effekt von L-Arginin nachgewiesen werden. In Lupusmäusen mit normaler Proteinzufuhr fand sich ein renaler Matrixscore von 3,7±0,3. Die L-Arginingabe führte zu einer signifikanten Zunahme der Matrixakkumulation auf 4,5±0,4 (p<0,05). In den Tieren mit der Niedrigproteindiät wurde ein geringerer Matrixscore als in der Normalproteingruppe gemessen (2,3±0,3). Auch in dieser Diätgruppe führte die L-Arginingabe zu einer signifikanten Zunahme des Matrixscores (3,0±0,4, p<0,05).
Abb. 43: Renale Matrixexpansion am Versuchsende. Die glomeruläre und tubulointerstitielle Matrixvermehrung wurde semiquantitativ bestimmt und zu einem gemeinsamen Matrixscore zusammengefaßt (* P< 0,05 ohne Arg vs. mit Arg).
Die Proteinexpression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 wurde in homogenisiertem Kortexgewebe untersucht. Die Meßergebnisse wurden jeweils auf 100 mg Naßgewicht
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Nierenkortex bezogen. Wie in Abb. 44 zu sehen ist, führte die L-Arginingabe in beiden Diätgruppen zu einer signifikant höheren TGF-ß1-Expression. In den Tieren mit normaler Proteinzufuhr stieg die TGF-ß1-Expression von 182±8 pg (LN-NP) auf 236±11 pg (LN-NP+Arg, p<0,01). In den Tieren mit verminderter Proteinzufuhr stieg sie von 141±8 pg (LN-LP) auf 187±11 pg (LN-LP+Arg, p<0,01). Im Vergleich zu den Tieren mit normaler Proteindiät führte die Proteinrestriktion zu einer signifikanten Verminderung der TGF-ß1-Expression (182±8 pg versus 141±8 pg, p<0,01).
Abb. 44: Proteinexpression von TGF-ß1 im homogenisierten Nierenkortex von Lupusmäusen (LP) am Versuchsende. Die Tiere erhielten entweder eine Diät mit normalem (NP, 22 % Kasein) oder vermindertem Proteinanteil (LP, 6 % Kasein). In Subgruppen wurde 1% L-Arginin im Trinkwasser (+Arg) gegeben. Die TGF-ß1-Expression wurde mittels ELISA gemessen und ist bezogen auf 100 mg Naßgewicht Nierengewebe (* p< 0,05 vs. LN-NP, # p<0,05 vs. LN-NP).
Für die Expression von Fibronektin und PAI-1 wurden vergleichbare Daten erhoben, obgleich nicht alle Unterschiede immer statistische Signifikanz erreichten. Die Gabe von L-Arginin erhöhte in der Normalprotein-Gruppe die Fibronektin-Expression von
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895±74 ng (LN-NP) auf 1092±66 ng (LN-NP+Arg, p=0,06) (Abb. 45). In der Niedrigprotein-Gruppe stieg sie von 768±34 ng (LN-LP) auf 949±66 ng (LN-LP+Arg, p<0,05). Die Expression von PAI-1 wurde in der Normalprotein-Gruppe durch L-Arginin von 27,7±2,5 ng (LN-NP) auf 29,6±3,6 ng (LN-NP+Arg, p=0,66) erhöht (Abb. 45). In der Niedrigprotein-Gruppe stieg sie von 19,8±1,5 ng (LN-LP) auf 24,2±1,7 ng (LN-LP+Arg, p<0,05). Der Unterschied zwischen der LN-NP- und der LN-LP-Gruppe war ebenfalls signifikant (27,7±2,5 ng vs. 19,8±1,5 ng, p<0,01).
Abb. 45: Proteinexpression von Fibronektin und PAI-1 im homogenisierten Nierenkortex von Lupusmäusen (LP) am Versuchsende. Die Tiere erhielten entweder eine Diät mit normalem (NP, 22 % Kasein) oder vermindertem Proteinanteil (LP, 6 % Kasein). In Subgruppen wurde 1% L-Arginin im Trinkwasser (+Arg) gegeben. Die Fibronektin- und PAI-1-Expression wurde mittels ELISA gemessen und ist bezogen auf 100 mg Naßgewicht Nierengewebe (# p<0,05 vs LN-LP, * p<0,05 vs. LN-NP).
Die Bildung von dsDNS-Autoantikörpern ist ein wichtiges Kennzeichen für die Überaktivität des Immunsystems bei der Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus. Da die
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bisher beschriebenen Effekte über eine vermehrte bzw. verminderte Bildung von Auto-Antikörpern vermittelt sein könnte, untersuchten wir die Plasma-Titer der dsDNS-Antikörper in den einzelnen Versuchsgruppen am Versuchsende.
Wie in Abb. 46 dargestellt, hatten L-Arginingabe und Proteinrestriktion nur geringe, nicht signifikante Wirkungen auf die dsDNS-Antikörpertiter (ANOVA p=0,92). Die relative Menge der Antikörper ist dargestellt als die optische Dichte (OD), die im ELISA zur Messung der dsDNS-Antikörper gemessen wurde. In den Tieren mit normaler Proteinzufuhr war der Antikörpertiter zwischen den Tieren mit und ohne L-Arginin fast gleich (LN-NP 0,382±0,06 OD vs. LN-NP+Arg 0,399±0,05 OD, p=0,84). Die Fütterung der Niedrigproteindiät verminderte tendenziell die Antikörpermenge (LN-LP 0,335±0,05 OD, p=0,57). Wurde zusätzlich L-Arginin gegeben, stieg der Antikörper-Titer leicht an (LN-LP+Arg 0,382±0,89, p=0,64)
Abb. 46: Relative Titer von dsDNS-Antikörpern im Plasma von Lupusmäusen (LN) am Versuchsende. Die Tiere erhielten eine Normalprotein (NP)- oder Niedrigproteindiät (LP) ohne oder mit 1% L-Arginin im Trinkwasser (+ARG). Die Titerhöhe ist dargestellt als die relative OD, die im ELISA gemessen wurde.
Diese Daten zeigen somit, daß die Wirkungen der L-Arginingabe und der Proteinrestriktion nicht oder nur unwesentlich über eine Beeinflussung der Antikörperproduktion vermittelt werden.
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Als Indikator für die endogene NO-Synthese wurde bei den Lupusmäusen der NOx-Gehalt des Blutes gemessen. Hier zeigte sich, daß die L-Arginingabe in beiden Diätgruppen mit einer signifikant höheren NO-Synthese einher ging. In den Lupustieren mit normaler Proteinzufuhr stieg der Plasma-NOx-Spiegel von 69±4 nmol/ml auf 103±12 nmol/ml (p<0,05). In den Tieren mit Proteinrestriktion wurde im Plasma ein Anstieg von 79±6 nmol NOx/ml auf und 98±4 nmol NOx/ml gemessen (p<0,05).
Abb. 47: Konzentration von Nitrit/Nitrat (NOx, beides Endprodukte von NO) im Plasma von Lupusmäusen (LN) am Versuchsende. Die Tiere erhielten eine Normalprotein (NP)- oder Niedrigproteindiät (LP) ohne oder mit 1% L-Arginin im Trinkwasser (+ARG). NOx wurde nach Nitratreduktasebehandlung mittels der Griess-Reaktion gemessen (* p< 0,05 vs. LN-NP und LN-LP).
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Zusammenfassend zeigen diese Daten, daß die L-Arginingabe bei der Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus mit einer deutlich höheren NO-Synthese einher geht. Mit Blick auf die Schlüsselrolle, die die NOS II für die Nierenschädigung in diesem Modell spielt, lassen diese Daten vermuten, daß die negative Wirkung der L-Arginingabe über eine vermehrte, destruktive NO-Synthese vermittelt wurde.
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