Kapitel 4. Diskussion

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß die Gabe von L-Arginin deutliche und pathophysiologisch wichtige Wirkungen auf die Matrixvermehrung bei akuter und chronischer Glomerulonephritis/Glomerulosklerose ausübt. In den drei Versuchsprotokollen konnten dabei sowohl günstige als auch ungünstige Effekte von L-Arginin auf die renale Matrixexpansion charakterisiert und voneinander abgegrenzt werden. Bevor die Daten im einzelnen besprochen und interpretiert werden, sollen zunächst die Vor- und Nachteile der verwandten Methodik diskutiert werden.

4.1 Methodenkritik

4.1.1 Tiermodelle

In dieser Arbeit wurde die Anti-Thy1-Glomerulonephritis der Ratte und die Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus verwandt, um die potentielle Bedeutung der L-Arginingabe für die Behandlung der Glomerulonephritis/Glomerulosklerose beim Menschen zu explorieren. Beide experimentellen Formen der Glomerulonephritis sind gut etablierte und charakterisierte Modelle humaner Erkrankungen. Die Anti-Thy1-Glomerulonephritis zeigt viele Parallelen zur IgA-Nephropathie. Die Nephritis der MRL/lpr-Maus ist der humanen Lupusnephritis nahe verwandt.

Die Anti-Thy1-Glomerulonephritis ist ein Modell der akuten renalen Matrixvermehrung. Ein wesentlicher Vorteil dieses Modells ist die relativ klare zeitliche Staffelung der Wundheilungssequenz und damit die Möglichkeit, spezifisch Untersuchungen zur Schädigungs- und Matrixexpansionsphase vornehmen zu können. Die Schädigungsphase der Anti-Thy1-Glomerulonephritis ist charakterisiert durch eine kurze, NO-vermittelte Lyse von Mesangialzellen. In vergleichbarer Weise wird die Nierenschädigung bei der Lupusnephritis und der akuten Tubulusnekrose durch zytotoxische Mengen NO vermittelt. Die folgende Phase der Matrixexpansion ist gekennzeichnet durch die Proliferation von Mesangialzellen und zunehmender Matrixexpansion im Glomerulum. Histologisch entspricht die Anti-Thy1-Glomerulonephritis in dieser Phase dem Bild der humanen mesangioproliferativen Glomerulonephritis und der IgA-Nephropathie. Die

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Die Anti-Thy1-Glomerulonephritis ist spontan reversibel, d. h. sie heilt auch ohne Therapie von selbst wieder aus. Es ist daher wiederholt die Frage gestellt worden, ob eine akut reversible Form der Matrixvermehrung überhaupt von Bedeutung für chronisch-fortschreitende Nierenfibrose sein kann. Obgleich diese Frage nicht eindeutig zu beantworten ist, gibt es eine Reihe von Argumenten, die für eine Relevanz der Anti-Thy1-Glomerulonephritis sprechen. Wie bereits in der Einleitung dargelegt, sind die molekularen Mechanismen bei akuter und chronischer Matrixvermehrung im Prinzip gleich. Zentrale Kennzeichen beider Formen der Matrixakkumulation sind TGF-ß-Überexpression, vermehrte Matrixsynthese und gehemmter Matrixabbau. Der Grund dafür, daß einige Nierenerkrankungen akut und andere chronisch verlaufen, scheint vielmehr darin zu liegen, daß die schädigende Ursache bei akuten Krankheiten nur kurz und bei chronischen über einen längeren Zeitraum auf die Niere einwirkt. Im Einklang mit diesem Konzept ist die Beobachtung, daß die akute Anti-Thy1-Glomerulonephritis durch wiederholte Antikörperinjektion in eine chronische Form überführt werden kann. Ein weiteres, wichtiges Argument für die Relevanz der Anti-Thy1-Glomerulonephritis ergibt sich aus der Beobachtung, daß wirksame Therapien bei chronischer Nierenfibrose sich gleichermaßen günstig auf die Matrixexpansion bei akut-reversiblen Erkrankungen auswirken. Um der potentiellen Limitierung des Anti-Thy1-Modells jedoch zu begegnen, wurde in dieser Arbeit die Wirkung von L-Arginin auch in einem renalen Modell der chronisch-fortschreitenden Matrixvermehrung geprüft.

Die Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus ist ein Modell für eine chronisch-fortschreitende Form der renalen Matrixexpansion. Wie die humane Lupusnephritis ist die Nephritis der MRL/lpr-Maus eine Immunkomplexnephritis. Der immunologische Nierenschaden wird im wesentlichen über die Produktion von zytotoxischen Mengen NO vermittelt. Die fortschreitende Matrixexpansion bei der Lupusnephritis führt zu einer progressiven Einschränkung der Nierenfunktion und die Mäuse versterben schließlich an den Folgen der Urämie.

Obgleich Tiermodelle, wie die Anti-Thy1-Glomerulonephritis und die MRL/lpr-Lupusnephritis, Einblicke in die Pathogenese und Therapie von humaner Glomerulonephritis geben können, muß in jedem Einzelfall geprüft werden, in welchem Maß die experimentellen Daten tatsächlich auf die humane Situation übertragen werden dürfen. Für die Fragestellung dieser Arbeit soll dieses im letzten Teil der Diskussion erfolgen. Grundsätzlich muß hervorgehoben werden, daß der

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Die Entstehung von Nierenerkrankungen und ihr Fortschreiten zur Nierenfibrose ist ein sehr komplexer Vorgang. Er beruht auf dem wechselseitigen Zusammenwirken von verschiedenen Nierenzellen (Endothelzellen, Podozyten, Mesangialzellen, Fibroblasten, Tubulusepithelien) und unterschiedlichen Blutzellen (Makrophagen, Lymphozyten, Thrombozyten) und systemischen Faktoren (Antikörper, Blutdruck, Substratangebot). Die Interaktionen zwischen diesen Faktoren sind sehr vielschichtig. In Zellkultur kann die Komplexität der in-vivo-Situation nur ungenügend nachgeahmt werden. Zellkulturarbeiten haben daher nur sehr begrenzte Einblicke in die Pathogenese von Nierenerkrankungen erlaubt. Tierexperimentelles Arbeiten hat hingegen den Vorteil, daß zumindest im Prinzip alle für die Entstehung und den Verlauf von Nierenkrankheiten wichtigen Faktoren vorhanden und wirksam sind. Tiermodelle bieten zudem die Möglichkeit, daß Krankheiten in verschiedenen Phasen, insbesondere auch der Frühphase, umfassend untersucht werden können. Weiterhin können neue Behandlungsansätze in Tiermodellen identifiziert und geprüft werden. Eine wesentliche Aufgabe von Tierversuchen besteht darin, neue Fragestellungen zu entwickeln und so einzugrenzen, daß sie an dem nur begrenzt zur Verfügung stehendem menschlichen Material zielgerichtet beantwortet werden können.

4.1.2 Messung der Fibroseaktivität bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis

Die Anti-Thy1-Glomerulonephritis ist eine rein glomeruläre Erkrankung. Da Glomeruli nur ca. 3% der Gesamtmasse des Nierenkortex ausmachen, müssen sie mittels eines besonderen, abgestuften Siebverfahrens isoliert und angereichert werden. Die Vorarbeiten dieser Arbeit dienten u. a. dazu, eine neue sensitive und objektivierbare Methodik zur Messung der „Fibroseaktivität“ bei der akuten Anti-Thy1-Glomerulonephritis zu entwickeln und zu validieren. Vor dem Beginn unser Untersuchungen war eine Analyse der „Fibroseaktivität“ einzelner Tiere nur mittels subjektiver histologischer Methoden möglich. Eine objektive Messung der Fibroseaktivität war andererseits nur mittels Western- oder Northern-Blot-Messung erreichbar. Aufgrund des hohen Materialbedarfs müssen für diese Methoden aber die Glomeruli von 3-4 Tieren gepoolt werden.

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Bei normalen und nephritischen Tieren konnten genügend Glomeruli isoliert werden, um im glomerulären Lysat und im glomerulären Kulturüberstand die Matrixproteine TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 sensitiv und reproduzierbar zu messen. Die weiteren Ergebnisse zur Etablierung und Validierung der ELISA-Meßmethodik sind in den folgenden Abschnitten diskutiert.

4.1.3 Maximierung der Differenz zwischen normaler und nephritischer Matrixproteinexpression

Ein wesentliches Ziel der Vorversuche war es, bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis die Versuchsbedingungen so zu optimieren, daß eine möglichst große Differenz zwischen normaler und pathologischer Matrixproteinexpression erreicht wird. Dieses Ziel wurde verfolgt, um 1) möglichst sensitiv antifibrotische Effekte zu erfassen und 2) die therapeutische Wirksamkeit von unterschiedlichen Therapien möglichst genau untereinander vergleichen zu können. In den Vorversuchen konnten zusammenfassend dann die folgenden Ergebnisse festgehalten werden:

1. Die Glomeruli normaler und nephritischer Tiere sind über mindestens 3 Tage vital und produzieren mit relativ konstanter Rate die Matrixproteine TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 in den Kulturüberstand.

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2. Die Matrixproteinsynthese in Kultur korreliert eng mit der Konzentration dieser Matrixproteine in-vivo.
3. Die Messung der Matrixproteine im glomerulären Kulturüberstand hat den Vorteil, daß hier viel größere Unterschiede zwischen normaler und nephritischer Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 zu finden sind als im glomerulären Lysat.
4. Die höchste Produktion von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 fand sich am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis. Der Anstieg der Matrixproteine in den ersten 24 Stunden ist wahrscheinlich Folge der abgelaufenen Mesangialzellyse und nicht Ausdruck einer gesteigerten glomerulären Synthese.
5. Die Injektion von 1,5 mg OX-7 pro kg Körpergewicht führt zu einer hohen und relativ homogenen Induktion der Matrixproteinproduktion am Tag 6 nach Induktion der Glomerulonephritis.

Mit diesem optimiertem und objektivierbarem Meßsystem wurde dann die Wirkung der L-Arginingabe bei Anti-Thy1-Glomerulonephritis untersucht. Dabei wurden die Vorteile unserer neuen Vorgehensweise insbesondere in Protokoll 2 sichtbar. Während mit der neuen Meßmethodik ein additiv-günstiger Effekt von L-Arginin und Proteinrestriktion zu dokumentieren war, war diese Wirkung mit der herkömmlichen Meßmethodik (Northern-Blotting) nicht möglich. Für diesem Unterschied spielt neben der ausgesprochenen Sensitivität und der hohen Reproduzierbarkeit bei der ELISA-Messung sicherlich auch die größere Probenzahl (8 Einzeltiere vs. 3 Messungen aus 2 gepoolten RNA-Proben) eine große Rolle.

4.1.4 Expression von TGF-ß1 als zentraler Meßparameter

In dieser Arbeit wurde der Expression von TGF-ß1 eine zentrale Rolle bei der Messung von pro- und antifibrotischen Wirkungen eingeräumt. Dieses ergibt sich im wesentlichen aus der Schlüsselrolle, die der Überexpression von TGF-ß für die renale Matrixvermehrung zugeschrieben wird. In unseren Versuchen wurden zusätzlich Fibronektin als Marker für die Matrixproteinsynthese und PAI-1 als Marker für den Matrixproteinabbau gemessen. Diese Messungen dienten u. a. dazu, TGF-ß-unabhängige Effekte von L-Arginin auf die Matrixexpansion zu erfassen. Die drei molekularen Parameter der Fibroseaktivität wurden zudem in Beziehung zur histologisch meßbaren Matrixexpansion gesetzt.

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4.2 Wirkung der L-Arginingabe bei immun-vermittelter akuter und chronischer Glomerulofibrose

Ziel dieser Habilitationsarbeit war es, das therapeutische Potential und die proinflammatorischen Risiken der L-Arginingabe bei immun-vermittelter Glomerulonephritis/Glomerulosklerose zu charakterisieren. Im folgenden werden die Ergebnisse der drei durchgeführten Versuchsprotokolle diskutiert.

4.2.1 Wirkung der L-Arginingabe auf die Mesangialzellschädigung bei akuter Anti-Thy1-Glomerulonephritis (Protokoll 1)

In diesem Versuchsprotokoll wurde gefragt, ob die Gabe von L-Arginin die kurzzeitige, NO-vermittelte Mesangialzellschädigung der Anti-Thy1-Glomerulonephritis verstärkt oder abschwächt und über welchen Mechanismus dieser Effekt vermittelt wird?. Darüber hinaus wurde gefragt, ob sich im weiteren Verlauf der Erkrankung die Veränderungen in der Mesangialzellyse in einer verstärkten oder verminderten Matrixexpansion widerspiegeln?

Wie im Ergebnisteil unter 3.2.2 dargestellt, führte die Gabe von L-Arginin vor und während der Induktion der Glomerulonephritis zu einer moderaten, aber signifikant stärkeren Mesangialzellyse. Dieses Ergebnis ist von zentraler Bedeutung für die Fragestellung von Protokoll 1. Sein Stellenwert wird jedoch dadurch geschmälert, daß es nur auf einem subjektiv bestimmbaren Parameter beruht. Einen objektiv meßbaren

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Als nächstes wurde gefragt, ob die ungünstige Wirkung von L-Arginin auf die Mesangialzellschädigung von einer stärkeren NO-Synthese begleitet bzw. durch diese bedingt ist? Zur Messung der in-vivo-NO-Synthese wurde die NOx-Konzentration im Plasma der Tiere sechs Stunden nach Induktion der Glomerulonephritis gemessen. Wie in Abb. 20 dargestellt, fand sich bei den nephritischen Tieren mit normaler L-Argininzufuhr ein signifikanter Anstieg der Plasma-NOx-Spiegel als Ausdruck einer höheren körpereigenen NO-Synthese. In den mit L-Arginin vorbehandelten Tieren wurde ein weiterer signifikanter Anstieg der Plasma-NOx-Konzentrationen gemessen, was auf eine noch höhere endogene NO-Synthese infolge der L-Arginingabe hinweist.

Der Anstieg der NO-Synthese bei den nephritischen Tieren mit L-Arginin konnte im Prinzip durch zwei Mechanismen erklärt sein. Zum einen konnte er Folge einer verstärkten Inflammationsantwort mit größerer Expression der NOS II sein. Zum anderen war vorstellbar, daß für die im Glomerulum exprimierten NOS II-Enzyme mehr Substrat zur Produktion von NO zur Verfügung stand. Beide Möglichkeiten wurden untersucht.

Wie in den Abb. 16-18 gezeigt, hatte die Gabe von L-Arginin keinen Einfluß auf den Grad der NOS II-Expression nach Injektion von Anti-Thy1-Antikörpern. Die Zahl der Makrophagen als Hauptträger der NOS II unterschied sich nicht signifikant zwischen nephritischen Tieren mit und ohne L-Arginingabe. Gleichermaßen fanden sich auch keine signifikanten Unterschiede bei der direkten Messung der NOS II-Expression auf Protein- und mRNA-Ebene. Die Daten zur Makrophagen-Infiltration stehen im

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Die Untersuchung der Plasma-L-Argininspiegel und der NO-Produktion nephritischer Glomeruli erbrachte deutliche Hinweise, daß die ungünstige Wirkung von L-Arginin über ein verstärktes Substratangebot vermittelt wurde. So führte die Induktion der Glomerulonephritis in den Tieren mit normaler L-Argininzufuhr zu einer signifikanten Abnahme der L-Argininkonzentration im Plasma. Im Vergleich dazu waren die L-Argininspiegel in den Tieren mit L-Arginingabe fast doppelt so hoch. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, daß die NO-Produktion nephritischer Glomeruli stark von dem extrazellulären L-Argininangebot abhängig ist. Ein deutlicher Anstieg der NO-Synthese wurde zwischen den L-Argininkonzentrationen beobachtet, die im Plasma von nephritischen Tieren mit und ohne L-Arginingabe gemessen wurden.

Aus den Daten zur Wirkung der L-Arginingabe auf die Mesangialzellyse der Anti-Thy1-Glomerulonephritis können zwei weitere wichtige Schlußfolgerungen abgeleitet werden:

1. Die Daten untermauern das in der Einleitung entwickelte Konzept, daß das Ausmaß der renalen Matrixexpansion den Grad des voran gegangenen Gewebsschadens widerspiegelt.
2. Die nur moderate Verstärkung der Zellyse und der nachfolgenden Matrixvermehrung durch L-Arginin ist wahrscheinlich Folge der nur kurzzeitigen Expression der NOS II bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis. Hieraus ergibt sich die Hypothese, daß die L-Arginingabe bei fortwährender NOS II-abhängiger Schädigung (z. B. wie bei der Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus) zu einem stetigen Fortschreiten der renalen Matrixexpansion führen sollte. Diese Hypothese wurde in Protokoll 3 geprüft.

Zusammenfassend zeigen die Daten des 1. Versuchsprotokolls, daß die Gabe von L-Arginin die Anti-Thy1-induzierte Mesangialzellschädigung über ein erhöhtes Substratangebot moderat verstärkt. Als Folge kommt es zu einer mäßig verstärkten TGF-ß-Überexpression und Matrixexpansion. Diese Daten zeigen ein bedeutsames proinflammatorisches und profibrotisches Risiko der L-Arginingabe auf.

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4.2.2 Wirkung der L-Arginingabe auf die TGF-ß1-Expression und Matrixexpansion nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis (Protokoll 2)

In diesem Versuchsprotokoll wurde gefragt, ob die Gabe von L-Arginin die blutdruckunabhängige, immunologisch-induzierte Matrixexpansion bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis verstärkt oder vermindert und über welchen L-Argininmetaboliten dieser Effekt vermittelt wird? Darüber hinaus wurde gefragt, welche Rolle spielt die Expression von TGF-ß als Mediator für pro- bzw. antifibrotische Effekte und wie ist die Wirkung von L-Arginin im Vergleich zum Therapiestandard Proteinrestriktion?

In diesem Protokoll wurde L-Arginin beginnend 24 Stunden nach Induktion der Glomerulonephritis gegeben. Zu diesem Zeitpunkt ist die Mesangialzellyse bereits nahezu komplett abgelaufen. Nach fünf Tagen L-Arginingabe wurden histologische und molekulare Fibrosemarker gemessen. Wie in der Abb. 30 dargestellt, war in den nephritischen Tieren mit L-Arginin histologisch deutlich weniger Matrix nachweisbar als in den Tieren mit normaler L-Argininzufuhr. Im Einklang mit diesem Ergebnis ging die Gabe von L-Arginin auch mit einer geringeren Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 einher. Dieses konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene belegt werden.

Als nächstes wurde gefragt, wie groß ist das antifibrotische Potential von L-Arginin im Vergleich zur bekannten Wirksamkeit der diätetischen Proteinrestriktion und können beide Ansätze zusammen sich ergänzen? Hierzu wurden beide Therapien allein und in Kombination direkt miteinander verglichen. Wie in der Abb. 33 gezeigt, war der Grad der antifibrotischen Wirkung von L-Arginin im Kern dem einer diätetischen Proteinrestriktion vergleichbar. Dieses zeigte sich sowohl in der histologischen Matrixakkumulation als auch für die Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1 auf mRNA- und Proteinebene. Die kombinierte Behandlung mit L-Arginin und Proteinrestriktion zeigte signifikante, additive Wirkungen. Additive Effekte fanden sich in der Histologie und auf Proteinebene für die TGF-ß1-, Fibronektin- und PAI-1-Expression.

Im Protokoll 2, wie schon zuvor im Protokoll 1, ging die Abnahme der histologisch meßbaren Matrixmenge immer mit gleichsinnigen Veränderungen der TGF-ß1-Expression einher. Die Veränderungen der TGF-ß1-Expression gingen wiederum mit relativ gleich starken Veränderungen der Matrixsynthese (als Marker hier Fibronektin) und eines weniger gebremsten Matrixabbaus (als Marker hier PAI-1) einher. Angesichts der zentralen Rolle, die TGF-ß für die Matrixakkumulation spielt, ist daher

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Die akute Anti-Thy1-Glomerulonephritis ist ein Modell mit normalem systemischen Blutdruck (siehe Abb. 28). Wie unter 3.2.2 gezeigt, verminderte L-Arginin die renale Matrixexpansion ohne meßbaren Einfluß auf den systolischen Blutdruck. Dieses ist ein wichtiger Befund. Er erweitert die Untersuchungen, die bisher einen günstigen Effekt von L-Arginin nur bei hypertensiver Nierenkrankheit nachweisen konnten. Die renoprotektive Wirkung von L-Arginin scheint damit, ähnlich wie die der Angiotensin II-Blockade, auch durch eine unmittelbare Interaktion mit der Gewebsreparatur vermittelt zu sein.

Im Gegensatz zu den Parametern der Matrixexpansion zeigte die L-Arginingabe keinen Einfluß auf die Proteinurie der nephritischen Tiere. Dieses ist im Prinzip ein überraschender Befund, da in der Regel die renale Matrixakkumulation und Proteinausscheidung miteinander assoziiert sind. Die Gründe für diesen Befund sind unklar. Es könnte jedoch von Bedeutung sein, daß die Proteinurie im Anti-Thy1-Modell nicht immer das Ausmaß der Fibroseaktivität reflektiert (Wayne Border, persönliche Mitteilung). Einige Rattenstämme zeigen z. B. sich trotz starker histologischer Veränderungen keine oder nur eine geringe Proteinausscheidung im Urin.

Von besonderer Bedeutung sind auch die Veränderungen der Plasma-L-Argininspiegel nach Induktion der Glomerulonephritis. In Protokoll 1 und 2 wurde jeweils ein deutlicher Abfall der L-Argininkonzentration im Blut von nephritischen Tieren mit normaler L-Argininzufuhr beobachtet. Dieser Abfall zeigt zum einen, daß im Rahmen der renalen Wundheilung L-Arginin verstärkt verbraucht wird. Zum anderen unterstreichen diese Daten die essentielle Bedeutung der L-Argininzufuhr bei aktiver Glomerulonephritis. Dabei ist die Abnahme der L-Argininspiegel lokal in der Niere wahrscheinlich noch deutlicher stärker ausgeprägt als die Blutspiegel dieses vermuten lassen. Dermale Wundheilungsstudien haben gezeigt, daß L-Arginin nur in sehr geringer Konzentration lokal in der Wundflüssigkeit nachweisbar ist. Wie bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis ist bei dermaler Wundheilung die anfängliche inflammatorischen Phase durch eine Aktivierung des L-Arginin-NO-Stoffwechselweges charakterisiert. Mit Beginn der Matrixexpansionsphase kommt es zu einem Überwiegen des L-Arginin-L-Ornithin-Stoffwechselweges. Untersuchungen von Ketteler und Mitarbeitern haben belegt, daß bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis die L-Argininstoffwechselwege in ähnlicher Weise sequentiell aktiviert sind.

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In hypertensiven Modellen renaler Erkrankungen konnte darüber hinaus belegt werden, daß die protektive Wirkung der L-Arginingabe über eine gesteigerte endotheliale NO-Synthese vermittelt wird. Bei Ratten mit salz-sensitivem Hypertonus und obstruktiver Nephropathie ging darüber hinaus die verstärkte NOS III-Aktivität mit einer Abnahme des systemischen Blutdrucks einher. Bei Tieren mit 5/6-Nephrektomie führte sie zur Normalisierung des intraglomerulären Drucks.

In unserem System hatte die L-Arginingabe keinen meßbaren Effekt auf die NOx-Konzentrationen im Plasma, Urin oder Überstand kultivierter Glomeruli. Als Erklärung hierfür muß angenommen werden, daß wahrscheinlich die eingesetzte Methodik nicht sensitiv genug ist, um unter normotensiven Bedingungen Änderungen der NOS III-Aktivität sicher zu erfassen. Zur Beantwortung der Frage, ob die günstige Wirkung von L-Arginin tatsächlich durch NO vermittelt wird, sind wahrscheinlich empfindlichere Untersuchungsstrategien (begleitende Hemmung der NO-Synthese, alleinige NO-Donation) notwendig.

Wie die L-Arginingabe die Aktivität der endothelialen NOS III stimuliert, ist nach wie vor ein unverstandenes Paradox. Auf der einen Seite senkt L-Arginin den systemischen und renalen Blutdruck bei humaner und experimenteller Hypertonie . Dieses geht auch nachweislich mit verstärkter NO- und L-Citrullin-Synthese einher. Auf der anderen Seite sollte die Aktivität der endothelialen NOS III angesichts der relativ niedrigen KM für L-Arginin (ca. 1-10 µM) und deutlich darüber liegenden Plasma- und Gewebsspiegeln nicht von einem verstärkten Substratangebot abhängig sein. Dieses Paradox gilt auch für die antifibrotische Wirkung von L-Arginin bei hypertensiver und, wie hier gezeigt, bei immunologisch-induzierter Nierenfibrose.

Von potentieller Bedeutung für die renale Matrixexpansion könnten auch die L-Argininmetabolite Polyamine, L-Prolin und Agmatin sein. Polyamine und L-Prolin werden über L-Ornithin als Zwischenstufe aus L-Arginin gebildet. Beide werden mit

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Über die Bedeutung von Agmatin für die renale Physiologie und Pathophysiologie ist bislang nur wenig bekannt. In-vitro-Daten belegen, daß Agmatin die NOS II und die Polyaminsynthese hemmt. Beides könnte sich potentiell günstig auf die Matrixexpansion auswirken. In einer kürzlich durchgeführten Untersuchung wurde die Wirkung von L-Arginin direkt mit der Wirkung von Agmatin auf die Phase der Matrixexpansion bei Anti-Thy1-Glomerulonephritis verglichen. Hierbei zeigte die Gabe von L-Arginin deutliche antifibrotische Wirkungen, während die Gabe von Agmatin keinen Einfluß auf die Matrixakkumulation hatte. Aus diesem Versuch ergibt sich, daß Agmatin als Mediator für die günstigen Effekte der L-Arginingabe ebenfalls nicht in Frage kommen dürfte.

Während die NOS II mit Gewebsdestruktion und die NOS III mit Gewebsprotektion verbunden ist, gibt es nur wenig Daten zur Rolle der in der Makula Densa lokalisierten neuronalen NOS I. Bei Maastrichter Lewis-Ratten geht der persistierende Verlauf der Anti-Thy1-Glomerulonephritis mit konstitutiv erhöhter NOS I-Expression und Renin-Produktion einher. Dieses könnte mit profibrotischen Wirkungen in Verbindung stehen. Eine Veränderung der NOS I-Aktivität durch vermehrte oder verminderter L-Argininzufuhr ist jedoch nicht belegt.

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Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse des 2. Versuchsprotokolls, daß die L-Arginingabe blutdruckunabhängig und wahrscheinlich vermittelt durch Abnahme von TGF-ß-Expression die Matrixexpansion nach Induktion der Anti-Thy1-Glomerulonephritis vermindert. Das antifibrotische Potential der L-Arginingabe war im Kern der Proteinrestriktion vergleichbar. L-Arginingabe und Proteinrestriktion zusammen verminderten additiv die TGF-ß-Expression und Matrixakkumulation.

4.2.3 Wirkung der L-Arginingabe auf den Verlauf der Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus (Protokoll 3)

In diesem Versuchsprotokoll wurde gefragt, wie sich die Gabe von L-Arginin bei fortwährender NOS II-Expression auf die renale Matrixexpansion auswirkt. Untersucht wurde diese Frage bei MRL/lpr-Mäusen mit manifester Lupusnephritis. Ähnlich wie bei humaner Glomerulonephritis laufen bei der MRL/lpr-Maus die Sequenzen der renalen Wundheilung kontinuierlich und parallel zu einander ab. In der zeitlich gestaffelten Wundheilungssequenz der Anti-Thy1-Glomerulonephritis konnten wir profibrotische Wirkungen von L-Arginin auf die Phase der Schädigung und antifibrotische Wirkungen von L-Arginin auf die Phase der Matrixexpansion identifizieren. Das Modell der Lupusnephritis erlaubt nun eine Antwort auf die Frage, welcher von beiden Effekten der L-Arginingabe bei fortwährender immun-vermittelter Glomerulonephritis/ Glomerulosklerose überwiegt.

L-Arginin wurde den MRL/lpr-Mäusen ab der 16. Lebenswoche gegeben. Wie im Protokoll 2 wurde der Effekt der L-Arginingabe direkt mit der Wirkung einer Proteinrestriktion als etabliertem Therapiestandard verglichen. Wie im Ergebnisteil unter 3.4.2 gezeigt, hatte die Gabe von L-Arginin deutliche Effekte auf die Albuminurie. In den Mäusen mit Normalproteindiät bewirkte die Gabe von L-Arginin einen deutlichen Anstieg der Albuminausscheidung. Die Proteinrestriktion hingegen verminderte erwartungsgemäß die Albuminurie. Wurde 1% L-Arginin im Trinkwasser zur Niedrigproteindiät gegeben, kam es wieder zu einer deutlichen Zunahme der Eiweißausscheidung. Anders als im Anti-Thy1-Modell ist die Proteinausscheidung bei der Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus ein valider Indikator für den Grad der glomerulären Schädigung. Diese Daten zeigen somit, daß die L-Arginingabe den glomerulären Schaden verstärkt, während die Proteinrestriktion protektiv ist.

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Die negative Wirkung von L-Arginin auf das Überleben der MRL/lpr-Mäuse ging mit verstärkter renaler Matrixexpansion in der Histologie und höherer Expression von TGF-ß1-, Fibronektin- und PAI-1-Protein einher. Die Proteinrestriktion hingegen wirkte sich günstig auf diese Fibrosezeichen aus. Wurde 1% L-Arginin im Trinkwasser zur Niedrigproteindiät zugegeben, fand sich wieder eine Zunahme der Matrixvermehrung in der Histologie und der Proteinexpression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1. Die Übereinstimmung zwischen den Daten zur renalen Matrixakkumulation und zum Überleben der Mäuse ist von großer Bedeutung. Sie bestätigt das in dieser Arbeit vertretene Konzept, daß dem renalen Funktionsverlust eine fortschreitende Matrixexpansion zugrunde liegt.

Die Daten des 3. Versuchsprotokolls zeigen somit übereinstimmend eine ungünstige Wirkung der L-Arginingabe bei fortwährender NOS II-Expression. Zur Beantwortung der Frage nach dem Mediator bzw. dem Mechanismus dieser Wirkung wurde im Blut die NOx-Konzentration bestimmt. Dabei zeigte sich, daß die L-Arginingabe mit einer signifikant höheren endogenen NO-Produktion einher ging. Diese Daten lassen vermuten, daß die negative Wirkung von L-Arginin bei Lupusnephritis über eine stärkere destruktive NO-Synthese vermittelt wird.

Im 1. und 3. Versuchsprotokoll wurden somit einheitlich proinflammatorische und profibrotische Wirkungen der L-Arginingabe bei Glomerulonephritis nachgewiesen. Vergleichbare Ergebnisse wurden in den letzten Jahren auch in verschiedenen anderen inflammatorischen Krankheitsmodellen aufgezeigt. Hierzu gehören u. a. Modelle der immun-vermittelten Hautvaskulitis, des hypoxischen Lungenschadens, der toxischen Kolitis sowie der zerebralen Ischämie-Reperfusion. Wie bei der Anti-Thy1-Glomerulonephritis und der Lupusnephritis zeigen alle diese Modelle eine starke Expression der NOS II. Es ist daher zu vermuten, daß die L-Arginingabe in diesem Modellen auch über ein höheres Substratangebot den Gewebsschaden

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Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse des 3. Versuchsprotokolls, daß die L-Arginingabe den ungünstigen Verlauf der Lupusnephritis der MRL/lpr-Maus beschleunigt, zu mehr Nierenfibrose führt und schließlich die Lebensspanne der Tiere verkürzt. Die negative Wirkung von L-Arginin scheint durch eine verstärkte destruktive NO-Synthese vermittelt zu sein.

4.3 Bedeutung der experimentellen Ergebnisse für humane Nierenerkrankungen

Die Bedeutung der induzierbaren NOS II für die Immunabwehr, Tumorelimination und Autoimmunität des Menschen ist nicht unumstritten. Während bei Nagetieren die Expression der NOS II und eine hohe NO-Synthese vielfach belegt werden konnte, gestaltete sich der Nachweis beim Menschen schwieriger. Unterhalten wurde diese Diskussion insbesondere durch in-vitro-Beobachtungen. Bei Nagetiergeweben ist die NOS II relativ leicht und stark durch LPS oder -Interferon zu induzieren, während z. B. menschliche Makrophagen in Kultur keine oder nur eine minimale NO-Produktion auf diese Stimulation hin zeigen. Diese Ergebnisse führten zu dem verfrühten Schluß, daß die NOS II beim Menschen nicht aktiv ist. Diese Auffassung ist in den letzten Jahren jedoch durch eine Reihe von Untersuchungen widerlegt worden. Es konnte gezeigt werden, daß bei einer Reihe von humanen Erkrankungen die NOS II sehr wohl in-vivo exprimiert und funktionell aktiv ist. Dabei ist klar geworden, daß die humane NOS II sehr spezifische Stimuli benötigt, die in-vitro nicht hinreichend simuliert werden können.

Die Expression und Aktivität der NOS II konnte bei renalen und nicht-renalen humanen Erkrankungen dokumentiert werden. Kashem und Mitarbeiter haben gezeigt, daß NOS II-mRNA und Protein bei einem Großteil von Patienten mit mesangioproliferativer Glomerulonephritis, in der Regel IgA-Nephropathie, exprimiert wird. Dabei war die NOS II-Expression nicht nur mit Makrophagen co-lokalisiert, sondern auch in ortsständigen Nierenzellen nachweisbar. Interessanterweise korrelierte die Expression der NOS II eng mit dem Grad der renalen Nierenschädigung und der Verschlechterung der Nierenfunktion. In weiteren

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Bei den nicht-renalen humanen Erkrankungen wurde aktives NOS II-Enzym u. a. in Makrophagen von Patienten mit Tuberkulose, in neutrophilen Granulozyten im Urin von Patienten mit Harnwegsinfekt und im Gelenksmaterial von Patienten mit Arthritis dokumentiert. Bei der HIV-1 Enzephalitis wurde die Induktion der NOS II in Astrozyten belegt. Dabei scheint die NOS II unmittelbar durch das HIV-Protein gP41 induziert werden zu können. Die Zytotoxizität von sogenannten natürlichen Killerzellen scheint zum Teil durch zytotoxische NO-Produktion vermittelt zu sein. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß die Abtötung von Leishmanie major beim Menschen über NO vermittelt wird.

Weitere Hinweise für die Aktivität der NOS II bei humanen Erkrankungen ergeben sich aus dem histologischen Nachweis von Nitrotyrosinen. Nitrotyrosine entstehen durch die Reaktion von dem Radikal Peroxynitrit mit der proteingebundenen Aminosäure Tyrosin. Wie unter 1.2.1.1 dargelegt, ist Peroxynitrit ein wichtiger Mediator der zytotoxischen NO-Wirkung. Nitrotyrosine als Zeichen der in-vivo-NOS II-Aktivität wurden bei Patienten mit Nierentransplantatversagen, Herzmuskelischämie, aktiver Artherosklerose, Colitis ulcerosa und septischem Lungenversagen nachgewiesen.

Aus diesen Daten ergibt sich, daß die hier vorgelegten Ergebnisse zur Wirkung der L-Arginingabe bei experimenteller Glomerulonephritis/Glomerulosklerose wahrscheinlich von großer Relevanz für die Behandlung von Patienten mit aktiver Glomerulonephritis und möglicherweise auch des Nierentransplantatversagens sind. Diese Sichtweise wird durch die Ergebnisse von zwei jüngst veröffentlichten klinischen Studien unterstrichen. De Nicola und Mitarbeiter untersuchten in einer Studie die Wirkung der L-Arginingabe bei Patienten mit chronischer Glomerulonephritis. Eisenberger und Mitarbeiter prüften die L-Arginingabe bei Patienten mit Transplantatnephropathie. In beiden Studien hatte ein Großteil der Patienten auch einen arteriellen Hypertonus, so das sich L-Arginin über eine Verminderung des hypertensiven Nierenschadens potentiell hätte positiv auswirken müssen. De Nicola und Eisenberger konnten jedoch keinen günstigen Effekt der L-Arginingabe nachweisen. Diese Ergebnisse sind in Anbetracht der Daten dieser Arbeit nicht unerwartet. So besteht bei Patienten mit chronischer Glomerulonephritis und transplantierter Niere ein nicht unerhebliches Risiko, daß im Rahmen von Inflammationsvorgängen die NOS II exprimiert ist. Es ist daher zu erwarten, daß sich die Gabe von L-Arginin bei diesen Patientengruppen

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