3 Labordiagnostische Maßnahmen zur Erhöhung der viralen Transplantatsicherheit

Gemäß den einschlägigen Richtlinien und Empfehlungen zur allogenen Knochentransplantation (siehe 1.1) sowie den Vorgaben des BfArM im Rahmen der Arzneimittelzulassung von Gewebetransplantaten sind als Mindestanforderungen an die labormedizinische Diagnostik des Gewebespenders folgende Parameter zu bestimmen: Antikörper gegen HIV-1/2, Antikörper gegen HCV, Antikörper gegen das Core-Protein des HBV (anti-HBc), HBsAg, Antikörper gegen Treponema pallidum (TPHA), ALAT (nur bei Lebendspendern). Hämodilutionseffekte durch vorhergehende Infusionen bzw. Transfusionen sind wegen möglicherweise falsch-negativer Ergebnisse zu beachteten [EATB/EAMST, 1997]. Auch die Möglichkeit falsch positiver Resultate (z.B. Anti-HBc nach Immunglobulingaben bzw. Transfusionen) muss in die Bewertung der Befunde einbezogen werden.

In Anbetracht der eingeschränkten Möglichkeiten, eine umfassende Anamnese bzw. klinische Untersuchungen durchzuführen und damit gezielt Gewebespender mit niedrigem Risiko für parenterale Infektionen zu selektieren, müssen bei Multiorgan- bzw. Leichenspendern zusätzlich Untersuchungen zum Nachweis von HIV-, HBV-, und HCV-Genom mittels geeigneter Nukleinsäure-Amplifikationstechniken (NAT, z.B. polymerase chain reaction, PCR) durchgeführt werden. Durch NAT-Untersuchungen wird das ´diagnostische Fenster´ bis zu einem positiven Antikörper- bzw. Antigentest deutlich reduziert (siehe Tabelle 2). Wegen des grundsätzlich ´elektiven´ Charakters der Knochentransplantation ist auch bei den NAT-Testungen eine größtmögliche Sicherheit zu fordern. Hierzu gehört, die Gewebespender-NAT-Untersuchung ausschließlich an der Einzelspenderprobe durchzuführen und nicht an Pools aus zahlreichen Spenden, wie dies im Blutspendewesen üblich ist. In einem mathematischen Modell [Weusten et al., 2002] führt die Testung an der Einzelspende anstelle der Testung an einem 96er Pool zu folgender Verringerung des Risikos einer Virusübertragung/10 Millionen Erythrozytenkonzentrat-Transfusionen: HIV: 0.47-0.62 auf 0.010-0.045; HBV: 11-13 auf 3.3-5.1; HCV: 1.7-2.0 auf 0.5-0.8.


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Tabelle 2. Serokonversionen und diagnostische Fenster: Anti-HIV, Anti-HCV und HBsAg [Müller-Breitkreuz, 2000; Busch 2003]

 

Anti-HIV

Anti-HCV

HBsAg

Serokonversionen

(in 4,8 Millionen Blutspendern/1997)

23

49

37

Diagnostisches Fenster

Serologie (Tage)

22 (6-38)

66 (38-94)

56 (25-109)

Wahrscheinlichkeit einer ´Fensterphasen´-Spende / 107Spenden

4,3

16

25

Diagnostisches Fenster

NAT-Testung

(Tage)

8-10

6-9

30-66

Untersuchungen zur Frage der infektiösen Dosis zeigten, dass bereits geringste Virusmengen ausreichen, um eine Infektion zu erzeugen. So wird die 50%-Infektionsrate für HBV und HCV mit 10 (1-100) viralen Genomäquivalenten (geq) und für HIV mit 1.000 (100-10.000) viralen Genomäquivalenten angegeben [Weusten et al., 2002].

Um die Wertigkeit der NAT-Untersuchungen, insbesondere in Anbetracht von Virusvaliderungsstudien, einzustufen, müssen die aktuellen Nachweisgrenzen (´detection limits´) der Einzel-NAT für HIV, HCV, HBV und für das jeweils untersuchte Material definiert werden. Einen Vergleich der derzeit verwendeten NAT-Techniken und deren Nachweisgrenzen hinsichtlich der drei relevanten Viren zeigt Tabelle 3. In-house-NAT sind teilweise deutlich weniger empfindlich (´detection limit´, z.B. nur 600 Genomäquivalente (geq)/ml). Neben den für die individuelle NAT-Nachweisgrenze relevanten Kriterien der jeweiligen Extraktion, reversen Transkriptase und Transkription, stellt insbesondere das eingesetzte Probenvolumen eine absolute Limitierung der PCR dar, da im getesteten Material mindestens 1 geq vorhanden sein muss, um ein positives PCR-Ergebnis zu erhalten. Insofern wird eine sehr hohe Sensitivität letztlich nur mit höheren Probenvolumina erwirkt. Schließlich sollte in der Validierung beachtet werden, dass die PCR auch die Breite der jeweils bekannten Virusgenotypen mit annähernd gleicher Sensitivität nachweisen kann. Erste Ergebnisse der Validierung von postmortal gewonnenem Blut für die NAT liegen bereits vor. Eine grundsätzliche Eignung dieses Probenmaterials ist gegeben, jedoch müssen Inhibitionseffekte beachtet werden [Anderson et al., 2003; Strong, 2003].

Dass auch bei negativem HCV-PCR-Ergebnis keine absolute Infektionssicherheit besteht, zeigt ein vor kurzem publizierter Fall einer HCV-Übertragung durch ein Thrombozytenkonzentrat [Schüttler et al., 2000].


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Tabelle 3. Serokonversionen und diagnostische Fenster: Anti-HIV, Anti-HCV und HBsAg [Müller-Breitkreuz, 2000; Busch 2003]

Virus

Assay

50% detection limit

95% detection limit

HIV

AmpliScreen 1.5*

7.1 (4.7-10.7)

126 (67-311)

RNA genotyp B

Gen-Probe TMA#

3.6 (2.6-5.0)

31 (20-52)

 

NucliSens-AmpliScreen 1.5§

4.6 (3.2-6.7)

37 (23-69)

 

Cobas AmpliScreen 1.5

6.6 (4.4-10.1)

92 (49-238)

HCV

AmpliScreen 2.0*

14 (11-19)

126 (83-225)

RNA genotyp 1

Gen-Probe TMA#

7.9 (6.3-9.9)

85 (64-118)

 

NucliSens-AmpliScreen 2.0§

4.3 (3.1-5.9)

21 (13-44)

 

Quiagen-HCV-Amplicor 2.0

18 (10-32)

144 (74-402)

HBV**

AmpliScreen 2.0*

14

126

 

Gen-Probe TMA#

7.9

85

 

NucliSens-AmpliScreen 2.0§

4.3

21

*Roche, Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA, #Gen-Probe, San Diego, CA, USA, §Roche-Kit kombiniert mit Extractor-Kit von bioMérieux, **Vorläufige Daten weisen auf eine Vergleichbarkeit zur HCV-PCR-Technik hin. Die In-house-PCR des Institutes für Virologie der Charité besitzt für HBV ein ´detection limit´ von 268 geq/ml.

Durch die infektionsserologischen bzw. molekulargenetischen Untersuchungen auf HIV, HBV und HCV ist die Menge der ggf. nicht erfassten Viren in potenziell infektiösen Spendergeweben bereits deutlich nach oben begrenzt worden. Der Anspruch an Virusinaktivierungsverfahren besteht nun darin, die verbleibende Viruslast sicher zu beseitigen.


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15.02.2005