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6  Zusammenfassung mit Diskussion der Ergebnisse

Die allogene Knochentransplantation ist ein weltweit anerkanntes Verfahren zur Deckung von Defekten des Skelettsystems. Es wird eine Vielzahl verschiedener Transplantate eingesetzt, deren Spektrum von massiven Allografts (komplette Extremitätenknochen, halbe Beckenknochen) über verschieden präparierte Diaphysen bzw. Spongiosablöcke bis hin zu demineralisierten Knochengranula reicht.

Die schwerwiegendste unerwünschte Begleiterscheinung der allogenen Knochentransplantation ist die Übertragung von viralen bzw. nicht-viralen Infektionserregern. Neben der Beurteilung der Spenderanamnese sowie der ausführlichen klinischen Untersuchung bzw. Inspektion des Leichnams stellen labormedizinische Untersuchungen ein zentrales Kriterium der Transplantatsicherheit dar. Sie dienen vor allem der Erfassung viraler Infektionen und umfassen primär infektionsserologische Parameter (Anti-HIV, Anti-HCV, Anti-HBc, HBsAg, TPHA, ALAT). Bei Multiorgan- bzw. Leichenspendern werden ergänzend die Testungen auf HIV-, HBV- und HCV-Genom aus der Einzelspenderprobe mittels validierter Nukleinsäure-Amplifikationstechniken gefordert. Um das bestehende Restrisiko (u.a. Nachweisgrenzen der NAT) weiter zu vermindern und gleichzeitig eine Reduktion von im Gewebe potenziell vorhandener anderer viraler und nicht-viraler Erreger zu erreichen, sollten allogene Knochentransplantate pathogeninaktiviert werden. Die gemäß den ´Richtlinien zum Führen einer Knochenbank´ alternativ empfohlene Quarantänelagerung des Spendergewebes mit einer nachfolgenden erneuten Testung von Infektionsparametern reduziert nur das Risiko einer HIV-, HBV- bzw. HCV-Infektion.

Die derzeit in Knochenbanken verwendeten Inaktivierungsverfahren (Peressigsäure/Ethanol, Gammabestrahlung, feuchte Hitze) wurden bisher nicht unter standardisierten Bedingungen geprüft. Der Stand des Wissens bezieht sich auf wenige Publikationen sowie nicht systematisch erfasste Erfahrungswerte der einzelnen Anwender. Um einen Qualitätsstandard definieren zu können, wurde in den vorliegenden Studien geprüft, welche Inaktivierungsleistung diese Methoden hinsichtlich klinisch relevanter viraler und nicht-viraler Erreger besitzen. Das Ziel war dabei der Nachweis einer Virusabreicherung um mindestens 4 log10 TCID50/ml bzw. einer Keimreduktion nicht-viraler Erreger um mindestens 5 log10 cfu/ml.

Die zuerst geprüfte Peressigsäure/Ethanol-Behandlung (Peressigsäure 2%, Ethanol 96%, Aqua ad iniectabilia, 2:1:1, 4 Stunden, 200 mbar, Agitation) führte in den Suspensionsversuchen innerhalb kürzester Zeit zur Inaktivierung einer Reihe von Viren (Pseudorabiesvirus, Poliovirus, Bovine Virus Diarrhoe Virus). Ein Reduktionsfaktor von > 4 log10 wurde bereits nach 5-minütiger [Seite 32↓]Behandlung erreicht. Auch HIV-2 wurde innerhalb von 5 Minuten unter die Nachweisgrenze von ≤ 1,9 log10 inaktiviert, jedoch ergab sich durch den niedrigen Ausgangstiter von 4,44 log10 ein Reduktionsfaktor von nur ≥ 2,54 log10 TCID50/ml. Beim Porcinen Parvovirus wurde der Reduktionstiter von > 4 log10 TCID50/ml erst nach 4 Stunden erreicht. Die genannten Befunde konnten im Carriertest (kontaminierte Spongiosawürfel als ´worst case´) bestätigt werden. Das Hepatitis A-Virus wurde sowohl im Suspensionstest als auch im Carriertest nach 4 Stunden nur um 3,7 log10 bzw. 2,87 log10 abgereichert. Diese relativ hohe Resistenz von HAV gegen Peressigsäure war nicht zu erwarten. Die daraufhin durchgeführte Validierung eines vorgeschalteten Verfahrensschrittes (Chloroform/Methanol-Entfettung der Spongiosa) mit zell-assoziiertem HAV zeigte eine Reduktion des HAV-Virustiters um 7,0 log10 in den kontaminierten Spongiosawürfeln, die durch Spüleffekte und möglicherweise auch durch eine Inaktivierung durch Chloroform erzielt wird. In den Untersuchungen mit den nicht-viralen Erregern wurden alle Testkeime vollständig und um mehr als 5 log10-Stufen (cfu/ml) inaktiviert. Lediglich bei Aspergillus niger konnte, durch den niedrigen Ausgangstiter bedingt, nur eine Abreicherung um 4-5 log10-Stufen nachgewiesen werden.

Als zweites Verfahren wurde die Gammabestrahlung geprüft. Der Parameter für die Quantifizierung der Wirkung ist der D10-Wert. Dieser beschreibt die notwendige Bestrahlungsdosis für die Abreicherung der Pathogene um eine log10-Stufe. Die in den Kinetikversuchen (Bestrahlungsgut: -30°C, Co-60-Quelle) ermittelten D10-Werte (BPV 7,3 kGy, HIV-2 7,1 kGy, PV-1 7,1 kGy, HAV 5,3 kGy, PRV 5,3 kGy, BVDV <3,0 kGy) entsprachen bisherigen Literaturangaben. Die hohe Strahlenresistenz des Bovinen Parvovirus (BPV) war nicht überraschend, da es sich um ein sehr kleines nicht-umhülltes Virus handelt. Um die größtmögliche Sicherheit zu gewährleisten, wurde eine Dosis von 34 kGy für allogene Knochentransplantate empfohlen. Hierbei wurde die Größe des BPV und die stärkere Strahlenabsorption des Knochengewebes (Versuchsmodell: Femurdiaphysen) berücksichtigt. Vergleichbare Dosen werden seit Jahren erfolgreich in den Gewebebanken der Republik Polen eingesetzt, ohne dass über biomechanische Alterationen berichtet wurde.

Als drittes Verfahren wurde das Marburger Knochenbanksystem ´Lobator sd-2´ (thermische Desinfektion, wirksame Phase mindestens 82,5°C über mindestens 15 Minuten) anhand zentral kontaminierter Femurköpfe getestet. Alle Viren wurden vollständig inaktiviert und um mehr als 4 log10-Stufen abgereichert. Für HIV-2 konnte in einem Versuch trotz vollständiger Inaktivierung unter 1,49 log10 aufgrund eines geringen Ausgangstiters von 5,0 log10 nur eine Abreicherung von ≥ 3,51 log10 TCID50/ml nachgewiesen werden. Die vegetativen Bakterien und Pilze wurden ebenfalls vollständig inaktiviert (≥ 6 log10 im Überstand). Sporen und Sporenbildner wurden erwartungsgemäß nicht ausreichend bzw. nicht inaktiviert (Abreicherung unter 2 log10 cfu/ml). Letzteres kann im normalen ´Lobator sd-2´-Verfahren nach eigener Erfahrung jedoch vernachlässigt [Seite 33↓]werden, da die Femurköpfe unter sterilen Bedingungen im Operationssaal gewonnen werden und der (aseptische) Herstellungsprozess eine sekundäre Sporen-Kontamination ausschließt. Schließlich sichert eine Sterilkontrolle nach Abschluss des Desinfektionsprozesses die Wirkung des Verfahrens.

In den vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die drei getesteten Verfahren für die untersuchten Viren eine Inaktivierung gemäß den durch die zuständigen Bundesoberbehörden (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, Paul-Ehrlich-Institut) empfohlenen Vorgaben garantieren. Die Inaktivierung ist aufgrund der Ergebnisse auch dann angezeigt, wenn die vorgeschriebenen anamnestischen Befragungen und klinischen Untersuchungen/Inspektionen sowie die erforderlichen labordiagnostischen Tests auf Infektionsmarker vorgenommen worden sind. Schließlich bieten die drei Verfahren zusätzliche Sicherheit durch eine umfassende Inaktivierung nicht-viraler Erreger.

Die vorliegende Arbeit soll dem ´Tissue Banker´ wissenschaftlich gesicherte Hinweise geben, seine eigenen Herstellungsprozesse unter Berücksichtigung der Transplantatsicherheit kritisch zu prüfen. Die Vorstellung und Diskussion der Ergebnisse auf internationalen Kongressen führte unter anderem dazu, dass Studien zur Pathogeninaktivierung durch die größte Gewebebank der USA, die ´Musculoskeletal Transplant Foundation´ (Edison, New Jersey) auf der Grundlage der in dieser Schrift vorgestellten Methodik durchgeführt wurden. Die Ergebnisse zur Gammabestrahlung wurden auch in den ´IAEA-Guidelines zur Strahlensterilisation von Geweben´ berücksichtigt.


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15.02.2005