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1.  Einführung in die Thematik

1.1. Restriktionsendonukleasen und DNA-Methyltransferasen _ korrespondierende Enzyme, die in Bakterienzellen für die begrenzte Aufnahme fremder DNA sorgen

Restriktions- und Modifikationssysteme (R/M-Systeme) werden in vielen Bakterienspezies gefunden. Sie dienen den Bakterienzellen als Abwehrsysteme gegen fremde, in die Zelle gelangende DNA (Arber, 1979).

Die Entdeckung der R/M-Systeme geht auf die Beobachtung zurück, dass λ-Phagen, die auf einem E. coli C- oder B-Stamm vermehrt worden waren, auf einem anderen Stamm E. coli K-12 nur schlecht vermehrt werden konnten (Bertani und Weigle, 1953). Dieser Effekt wurde Restriktion genannt. Die Bakterienviren, die der Restriktion entgingen, produzierten Nachkommen, die sich auf E. coli K-12 vermehren konnten. Die überlebenden λ-Phagen waren keine Wirtsbereichsmutanten, weil sie nach einem weiteren Vermehrungszyklus auf E. coli C wieder sensitiv für die Restriktion auf E. coli K-12 wurden. Die Viren waren offensichtlich transient verändert, modifiziert worden. Erst viel später konnte bewiesen werden, dass die Vermehrung von λ⋅C in E. coli K-12 durch eine Restriktionsendonuklease, die fremde DNA zerstört, verhindert wird (Zusammenfassungen bei Meselson and Yuan, 1968; Linn and Arber, 1969). Die Bakterienviren, die der Restriktion entgehen, erhalten, wie das Bakterienchromosom, eine schützende Modifizierung durch ein spezifisches Modifikationsenzym, eine Methyltransferase, die definierte Basen innerhalb einer DNA-Erkennungssequenz methyliert (Arber and Dussoix, 1962; Smith et al., 1972). An dieser sequenz-spezifischen Methylierung, die nichts anderes als eine epigenetische Markierung darstellt, erkennt man die Herkunft einer DNA.

In der Regel bildet ein Restriktionsenzym gemeinsam mit einem Modifikationsenzym gleicher DNA-Spezifität ein R/M-System, das die DNA-Aufnahme aus anderen Zellen oder der Umgebung limitiert und auf diesem Wege die genetische Stabilität der Zelle gewährleistet (Arber, 1979). Wenn auch schwer zu prüfen, erscheint eine Rolle der R/M-Systeme als primitives Immun- oder Abwehrsystem der Bakterien realistisch, nicht zuletzt weil Viren und konjugative Plasmide vielfältige Mechanismen entwickelt haben, ihre genetische Information vor der zerstörerischen Wirkung der Restriktionsendonukleasen ihrer Wirtszellen zu schützen (Zusammenfassung bei Krüger and Bickle, 1983). Dennoch wird seit einigen Jahren über weitere Funktionen der R/M-[Seite 5↓]Systeme spekuliert, die erklären sollen, warum diese Enzyme während der Evolution so zahlreich und in ihrer Vielfalt erhalten geblieben sind. Eine Hypothese geht davon aus, dass R/M-Systeme die Zelle nicht vor genetischen Parasiten schützen, sondern dass sie, im Gegenteil, selbst „egoistische“ genetische Parasiten sind, die nur auf ihr Überleben innerhalb einer Population ausgerichtet sind. Dieser Schlussfolgerung liegt die Beobachtung zugrunde, dass Bakterienzellen, die ihre R/M-codierenden Gene verlieren, sterben (Naito et al., 1995). Das beruht auf der Tatsache, dass eine DNA-Methyltransferase jeden Ort in einer DNA methylieren muß, um sie zu schützen, während schon ein einziger DNA-Doppelstrang-Bruch durch eine Restriktionsendonuklease genügt, um ein Genom zu zerstören. Es wird argumentiert, dass das bakterielle Genom durch die verbleibenden, sich mit der Zell-Vermehrung verdünnenden, Methyltransferase-Moleküle nicht mehr vollständig methyliert werden kann und durch die restlichen in der Zelle vorhandenen Restriktionsendonuklease-Moleküle endonukleolytisch abgebaut wird (für eine Übersicht s. Kobayashi, 2001). Dass sich bakterielle Genome vor R/M-Genen in gewisser Weise schützen, könnte auch aus Arbeiten von Rocha et al. (2000) interpretiert werden. Die Autoren analysierten, in welchem Maße, kurze palindrome Sequenzen in Virusgenomen und in den Genomen ihrer Wirtszellen vorkommen. Der Vergleich zeigte, dass wider Erwarten die stärkere Kontraselektion gegen Palindrome in den meisten Fällen in den Genomen der Bakterien und nicht in denen der Viren stattgefunden hat. Das Ergebnis könnte für den invasiven Charakter der R/M-Systeme und den dadurch entstehenden evolutionären Druck auf die Bakteriengenome sprechen.

In den letzten Jahren haben Analysen der Nukleotidsequenzen bakterieller Genome gezeigt, dass R/M-Systeme unter Prokaryoten deutlich weiter verbreitet sind als erwartet, wenngleich sie nicht immer in ihren Wirtszellen exprimiert werden. Mehr als 80 % der vollständig sequenzierten bakteriellen Genome codieren mindestens ein R/M-System. Es ist bemerkenswert, dass in Bakterien, die außergewöhnliche Lebensräume besiedeln, z.B. solche, die parasitär in eukaryotischen Zellen oder aber unter extrem hohen Temperaturen leben, offene Leserahmen für R/M-Systeme eher selten gefunden wurden (Murray, 2001). In Helicobacter pylori-Stämmen wiederum, die als eine der wenigen Bakterienspezies den menschlichen Magen besiedeln können und mit der Entstehung von Magengeschwüren und -Karzinomen assoziiert sind, wurden 14 bzw. 15 potentielle R/M-Systeme (entspricht etwa 1 % des Genoms) identifiziert (Tomb et al., 1997; Alm et al.,1999). In diesem Zusammenhang ist es besonders überraschend, dass nur ein Virus, das [Seite 6↓] Helicobacter-Stämme infiziert, bekannt ist (Kong et al., 2000). Andererseits entwickelt Helicobacter eine natürliche Kompetenz für die Aufnahme von chromosomaler und Plasmid-DNA, so dass eine biologische Rolle dieser R/M-Systeme tatsächlich in der Barrierefunktion gegen DNA-Austausch zwischen verschiedenen Bakterienspezies liegen könnte (Ando et al., 2000). In jedem der bisher analysierten Genome von Neisseria gonorrhoeae-Stämmen sind mehr als 20 verschiedene R/M-Gene identifiziert worden (Roberts, 1998). Es ist schwer vorstellbar, dass diese Bakterien so viele R/M-Systeme brauchen, ausschließlich um fremde DNA abzuwehren. Es ist denkbar, dass neue biologische Funktionen von R/M-Systemen, gerade in den beschriebenen humanpathogenen Bakterienspezies, gefunden werden, die mit der Pathogenität des Erregers in Verbindung stehen. Kürzlich wurde der Zusammenhang zwischen der Expression des R/M-Systems NmeSI und der Hypervirulenz eines Neisseria meningitidis-Stammes beschrieben (Bart et al., 2001).

Der Vergleich von genomischen Sequenzen, GC-Gehalten und Codon-Nutzung ergab verschiedene Hinweise darauf, dass R/M-Gene häufig innerhalb eines Genoms und zwischen verschiedenen Genomen horizontal transferiert werden, und dass sie dabei DNA-Umbauten bewirken können (Stein et al., 1998; Chinen et al., 2000; Xu et al., 2000; Kobayashi, 2001; Lin et al. 2001). Für die Mobilität von R/M-Genen spricht auch die Flankierung durch direkte oder invertierte repetitive Sequenzen (Gunn and Stein, 1997; Kobayashi et al., 1999), ihre Lokalisierung auf Transposon-ähnlichen Elementen (Rochepeau et al., 1997) oder ihre Nähe zu Sequenzen, die Transposasen und Rekombinasen codieren (für eine Übersicht siehe Kobayashi, 2001).

Ähnlich wie der horizontale Gentransfer von R/M-Genen könnte ihre Wirkung als „Evolutionsgene“ (Arber, 2000) zur Variabilität der prokaryotischen Genomorganisation beitragen. Bei der Spaltung fremder DNA durch Restriktionsendonukleasen werden DNA-Fragmente produziert, die gleichzeitig einen Pool potentiell rekombinationsfähiger DNA darstellen und über illegitime Rekombination ins zelluläre Genom aufgenommen werden können.

Ob nun das Abwehrprinzip, das Wirken als „egoistische“ molekulare Parasiten oder das Genomvariationsprinzip oder aber ihre Kombination die Evolution der R/M-Gene vorantreiben, bleibt zu beweisen. Möglicherweise bringen weitere Sequenzdaten bakterieller Genome und Strukturaufklärungen verschiedenster pro- und eukaryotischer Enzyme neue Ansatzpunkte zur Klärung dieser Frage.


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1.2.  Die Diversität der TypII-Restriktionsendonukleasen

Drei verschiedene, gut charakterisierte Typen von Restriktionsendonukleasen (I, II und III) sind gefunden worden, die von R/M-Systemen codiert und entsprechend ihrer Zusammensetzung aus Proteinuntereinheiten, der Art ihrer DNA-Erkennungssequenz, ihrer Kofaktoren und ihres Wirkungsmechanismus klassifiziert wurden (1).

Die TypII-Restriktionsendonukleasen machen mit 3333 von insgesamt 3392 bekannten Restriktionsendonukleasen und 200 von insgesamt 228 verschiedenen DNA-Spezifitäten die größte Gruppe aus (Roberts and Macelis, 2001). Der gegenwärtige Stand des Wissens über Struktur und Funktion dieser Enzyme ist von Pingoud and Jeltsch (2001) umfassend und detailliert dargestellt worden. Die orthodoxen TypII-Restriktionsendonukleasen sind im Allgemeinen als Homodimere aktive Enzyme, die in Anwesenheit von Mg2+ beide Stränge der DNA in einer koordinierten Aktion innerhalb einer, meist palindromen DNA-Erkennungssequenz spezifisch spalten. Die dazugehörenden Modifikationsenzyme sind separate Proteinmoleküle und, entsprechend ihrer Funktion neu replizierte DNA zu methylieren, als Monomere aktiv. Zahlreiche Untersuchungen zur Struktur und Funktion von TypII-Restriktionsendonukleasen in den letzten zehn Jahren haben gezeigt, dass eine Reihe von Enzymen von der bis dahin engen Definition der TypII-Enzyme abweichen. Sie sind deshalb in verschiedenen Subtypen klassifiziert worden (Pingoud and Jeltsch, 2001). Im Subtyp IIE sind Enzyme zusammengefaßt, die mit zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz wechselwirken müssen, wobei die eine Erkennungssequenz als Substrat, die andere als Effektor wirkt (z. B. EcoRII, NaeI). Die Enzyme des Subtyps IIF sind dem Subtyp IIE ähnlich, da sie auch mit zwei Erkennungssequenzen interagieren. Sie spalten allerdings beide Erkennungsorte in einer konzertierten Aktion (SfiI, NgoMIV). Der Subtyp IIS umfaßt Restriktionsendonukleasen, die asymmetrische Erkennungssequenzen erkennen und in definiertem Abstand außerhalb der Erkennungssequenz spalten (z. B. FokI, HphI). Andere Restriktionsendonukleasen spalten die DNA an beiden Seiten ihrer Erkennungssequenz (Subtyp IIB), erkennen nur methylierte Erkennungssequenzen (Subtyp IIM), sind aus verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt (Subtyp IIT) oder vereinen Restriktions- und Modifikationsaktivität in einem einzigen Polypeptid (Subtyp IIG). Die einzelnen Enzyme können dabei durchaus Merkmale verschiedener Subtypen tragen, so dass eine Zuordnung zu verschiedenen Subtypen denkbar wäre. Obwohl diese künstliche Klassifizierung der TypII-[Seite 8↓]Restriktionsendonukleasen sicher nur von begrenzter praktischer Bedeutung ist, demonstriert sie doch eindrucksvoll, dass die Gruppe der TypII-Restriktionsendonukleasen weitaus heterogener ist als bisher vermutet.

Die Entdeckung der Restriktionsendonukleasen und ihrer Fähigkeit zur sequenz-spezifischen DNA-Spaltung war eine methodische Voraussetzung für die Entwicklung der Molekularbiologie. Heute sind diese Enzyme, insbesondere die TypII-Restriktionsendonukleasen, unentbehrliche Werkzeuge für Genanalysen und Klonierungsexperimente. Trotz der gegenwärtig verfügbaren Vielfalt an TypII-Restriktionsendonukleasen geht die Suche nach immer neuen DNA-Spezifitäten weiter. Ein erklärtes und von vielen Forschern verfolgtes Ziel ist es, Regeln der molekularen DNA-Erkennung dieser Enzyme aufzudecken, um mit dieser Kenntnis deren DNA-Spezifität gezielt zu verändern. Wegen der Komplexität dieser Erkennungsprozesse sind Fortschritte bei der Veränderung der DNA-Spezifität von Restriktionsendonukleasen sehr selten (Lanio et al., 2000; Lukacs et al., 2000).

TypII-Restriktionsendonukleasen bilden eine der größten Gruppen funktionell ähnlicher Enzyme mit verschiedenen DNA-Bindungsspezifitäten – Eigenschaften, die sie zu idealen Modellen für das Studium molekularer Erkennungsprozesse machen. Mit Ausnahme einiger eng verwandter Isoschizomere zeigen TypII-Restriktionsendonukleasen keine Sequenzhomologie, was dazu führte, dass sie für evolutionär nicht verwandt gehalten wurden. Alle bisher analysierten Kristallstrukturen offenbarten aber ein sehr ähnliches katalytisches „Core“, das aus einem 5-strängigen β-Faltblatt, flankiert von α-Helices, besteht. Das „Core“ enthält das katalytische Zentrum und bringt zwei Carboxylatreste, meistens einen Aspartat- und einen Glutamat- oder Aspartatrest, in räumliche Nähe zueinander (Pingoud and Jeltsch, 2001). Diese Struktur ist interessanterweise auch in anderen Proteinen mit Endonukleasefunktion nachgewiesen worden: der λ-Exonuklease (Kovall and Matthews, 1998), dem MutH-Protein (Ban and Yang, 1998), der Vsr (very short patch)-Reparaturendonuklease (Tsutakawa et al., 1999) und einer Transposase-Untereinheit des Transposons Tn7 (Hickman et al., 2000). Sequenzvergleiche und Strukturvorhersagen haben darüber hinaus eine evolutionäre Verwandtschaft von TypII-Restriktionsendonukleasen mit ortsspezifischen Rekombinasen (Topal and Conrad, 1993; Nunes-Düby et al., 1998), der Hjc-Resolvase, einem Rekombinationsenzym aus Archaebakterien (Daiyasu et al., 2000), der Endonuklease VII, einem Reparaturenzym des Bakterienvirus T4 (Aravind et al., 2000) und den [Seite 9↓]Homing-Endonukleasen (Bujnicki et al., 2001) herausgearbeitet. Diese Ähnlichkeiten sprechen dafür, dass sich die Evolution der TypII-Restriktionsendonukleasen sehr wahrscheinlich divergent von einem oder wenigen gemeinsamen Vorläuferprotein(en) vollzogen hat.

1.3. Die Restriktionsendonuklease EcoRII

Das EcoRII-R/M-System wurde bei der Untersuchung klinischer Escherichia-coli-Isolate auf ihre Fähigkeit zur Restriktion von λ-Phagen gefunden (Bannister and Glover, 1968; Yoshimori et al., 1972). Die EcoRII-Restriktionsendonuklease erkennt die DNA-Sequenz 5'CC(A/T)GG und spaltet die Phosphodiesterbindung vor dem ersten Cytidin der unmethylierten Sequenz. Dabei entstehen kohäsive DNA-Spaltenden mit Überhängen von 5 Nukleotiden. Ihr GC-Gehalt von 80% ist wahrscheinlich für die besondere Neigung zur Reassoziation verantwortlich (Boyer et al., 1973). Die korrespondierende Methyltransferase schützt den Erkennungsort vor endonukleolytischem Abbau, indem sie die C-5 Position des zweiten Cytidins methyliert (Boyer et al., 1973; Buryanov et al., 1978). Die Gene für das EcoRII-R/M-System wurden kloniert (Kosykh et al., 1980) und die Nukleotidsequenzen bestimmt. Die Gene des EcoRII-R/M-Systems werden von verschiedenen Strängen in konvergenter Richtung transkribiert. Der offene Leserahmen der Restriktionsendonuklease codiert für ein 45,6 kDa großes Protein (Som et al., 1987; Kosykh et al., 1989; Bhagwat et al., 1990).

Aus Untersuchungen zum Einfluß von modifizierten Nukleotiden innerhalb und in der Nähe der Erkennungssequenz sowie von veränderten Internukleotidbindungen auf die Wechselwirkung der EcoRII-Restriktionsendonuklease mit ihrem Substrat geht hervor, dass das zentrale A/T-Paar in der Erkennungssequenz eine Rolle bei der Interaktion mit EcoRII spielt. EcoRII wechselwirkt gleichzeitig mit beiden Strängen des Substrates, spaltet sie aber unabhängig voneinander in einem Bindungsereignis (Yolov et al.,1985; Petrauskene et al., 1998). EcoRII reagiert im Vergleich zu MvaI, einem isoschizomeren Enzym, wesentlich empfindlicher auf Strukturveränderungen in der DNA-Erkennungssequenz (Cech et al., 1988).

Untersuchungen zur Wirkung von EcoRII in vivo sind nur in geringem Umfang durchgeführt worden. Die nahe verwandten Bakteriophagen f1, fd und M13 werden in vivo in EcoRII-exprimierenden Wirtsstämmen nicht restringiert, die isolierten replikativen Formen der Phagengenome werden, trotz vorhandener Erkennungsorte, nur partiell gespalten (Vovis et al., [Seite 10↓]1975). Hattman et al. (1979) konnten Φx174 DNA, trotz fehlender Methylierung, nur dann mit EcoRII spalten, wenn unspezifische heterologe DNA zugesetzt wurde. Das Phänomen wurde von den Autoren nicht näher untersucht.

Bei der Untersuchung verschiedener R/M-Systeme auf die Vermehrungsfähigkeit der virulenten Bakterienviren T3 und T7 machten wir ähnliche Beobachtungen. Beide Viren wurden in EcoRII-codierenden Wirtszellen nicht restringiert, obwohl in beiden Virusgenomen Erkennungsstellen für EcoRII vorhanden sind. Auch in vitro ist keine Spaltung der DNA durch EcoRII zu erreichen. Die isoschizomeren Enzyme BstNI und MvaI spalten dagegen T3- und T7-DNA. Die Ursache der Resistenz gegenüber EcoRII ist nicht in einer Methylierung der DNA zu suchen, da wir nachweisen konnten, dass das T3-Genom vollständig unmethyliert ist (2). Auffällig war lediglich eine starke Kontraselektion gegen EcoRII-Erkennungsorte im Genom beider Viren (Schroeder et al., 1986).

Wir haben daraufhin versucht, systematisch nach Ursachen für die Resistenz der EcoRII-Erkennungsorte in den Virusgenomen zu suchen und sind dabei auf den bemerkenswerten Reaktionsmechanismus der Restriktionsendonuklease EcoRII gestoßen.


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10.06.2005