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2.  Zusammenfassung der Ergebnisse

2.1. EcoRII als Prototyp der TypIIE-Restriktionsendonukleasen (3-10)

2.1.1. EcoRII braucht die Interaktion mit zwei Kopien seiner Erkennungssequenz zur enzymatischen Aktivität

Die Resistenz der sehr selten vorkommenden EcoRII-spezifischen Erkennungsorte in den Genomen der eng verwandten Viren T3 und T7 gegen EcoRII-Spaltung warf zunächst die Frage nach dem möglichen Einfluß von Nachbarschaftsbasen auf. Nach Klonierung eines EcoRII-Erkennungsortes einschließlich der 5‘- und 3‘-benachbarten Sequenzen aus dem T7-Genom in einen an sich durch EcoRII spaltbaren Vektor, wurde auch der aus T7 stammende EcoRII-Erkennungsort für EcoRII suszeptibel. Damit war bewiesen, dass die auf beiden Seiten unmittelbar benachbarten Basenpaare (bp) nicht die Ursache für die Resistenz des EcoRII-Erkennungsortes gegenüber der EcoRII-Spaltung sind (3).

Wir haben dann demonstriert, dass die resistenten EcoRII-Erkennungsorte der Bakteriophagen-Genome von T3 und T7 auch gespalten werden können, wenn sie mit einer heterologen spaltbaren DNA (z.B. pBR322 Plasmid-DNA oder DNA des Bakterienvirus λ) ko-inkubiert werden. Um zu erfahren, ob diese “Aktivator-Moleküle” wie ein Katalysator in geringsten Mengen wirken oder aber in einem definierten stöchiometrischen Verhältnis in der Reaktion vorhanden sein müssen, wurde die Konzentration der pBR322-DNA gegen eine konstante Konzentration von T3-DNA titriert. Die virale DNA wurde nur solange komplett von EcoRII gespalten, wie ein quantitatives Verhältnis von Erkennungsorten auf pBR322 : T3 von mindestens 2 : 1 erreicht wurde. Mit geringer werdenden pBR322-Konzentrationen nahm die Spaltung der T3-DNA deutlich ab. Diese direkte Korrelation zwischen der Konzentration der Aktivator-DNA und dem Grad der Aktivierung der EcoRII-Spaltung spricht für ein stöchiometrisches Verhältnis der an der EcoRII-Aktivierung beteiligten Reaktionspartner.

Interessant war auch unsere Beobachtung, dass die Spaltung von einzelnen pBR322-Fragmenten mit drei, zwei oder einem EcoRII-spezifischen Erkennungsort(en) mit der Zahl der EcoRII-Erkennungsorte drastisch abnimmt. Das DNA-Fragment mit einem Ort war gegenüber EcoRII resistent (4, 6).


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Unsere Ergebnisse zeigen, dass die katalytische Aktivität der Restriktionsendonuklease EcoRII offensichtlich von der gleichzeitigen Wechselwirkung des Proteins mit zwei Kopien seiner DNA-Erkennungssequenz abhängt. DNA-Moleküle mit einem einzelnen oder sehr selten vorkommenden EcoRII-Erkennungsort(en) lassen sich nicht mit EcoRII spalten. Die Resistenz solcher DNA-Moleküle kann durch Ko-Inkubation mit DNA, die eine höhere Frequenz an EcoRII-Erkennungsorten hat, überwunden werden.

EcoRII war die erste Restriktionsendonuklease, für die diese besondere Anforderung an ihr DNA-Substrat, die sonst eher von Enzymen der DNA-Transposition, -Rekombination und -Replikation bekannt ist, beschrieben wurde. Wir postulierten daher, dass EcoRII der Prototyp einer Gruppe von Restriktionsendonukleasen sein könnte, die die Interaktion mit zwei Erkennungsorten in der DNA gemein hat.

2.1.2. Aktivierung von EcoRII durch synthetische Oligonukleotidduplexe

Wir vermuteten die Ursache dafür, dass bestimmte DNA-Moleküle trotz vorhandener unmethylierter Erkennungsorte durch EcoRII nicht spaltbar sind, in einem besonderen katalytischen Mechanismus der Restriktionsendonuklease EcoRII, dessen wichtigstes Merkmal die Wechselwirkung des Proteins mit zwei Erkennungsorten ist. Um die strukturellen und funktionellen Anforderungen an ein Aktivator-Molekül systematisch untersuchen zu können, war es wünschenswert außer der natürlichen, hochmolekularen Plasmid- und Virus-DNA (pBR322, λ) einfachere, weniger komplexe DNA-Strukturen für die EcoRII-Aktivierung zu finden.

Wir konnten mit synthetischen Oligonukleotidduplexen von nur 14-bp Länge, die einen singulären EcoRII-Erkennungsort enthielten, die Spaltung von T3-DNA durch EcoRII ebenso stimulieren wie durch die beschriebenen hochmolekularen DNAs (5). Das kurze Aktivator-Molekül wird dabei selbst durch EcoRII gespalten. Ein einzelner Strang des 14-bp Oligonukleotidduplexes oder ein Oligonukleotidduplex ohne EcoRII-spezifischen Erkennungsort hat keinen Effekt auf die Spaltung der T3-DNA durch EcoRII.

Die Aktivierbarkeit von EcoRII durch das kurze synthetische DNA-Molekül ist abhängig von dessen Konzentration. Für eine komplette Spaltung der T3-DNA haben wir ein optimales molares Verhältnis der Erkennungsorte von Oligonukleotiden zu T3 von etwa 140:1 gefunden. Der notwendige hohe Überschuß an Erkennungsorten auf dem synthetischen Oligonukleotidduplex im Vergleich zu denen auf der hochmolekularen Plasmid-DNA (2:1) ist [Seite 13↓]vermutlich auf die Unterschiede in der Stabilität der entsprechenden Enzym-Substrat-Komplexe zurückzuführen, die mit der Länge der DNA korreliert. Diese Daten unterstreichen das notwendige stöchiometrische Verhältnis der Reaktionspartner bei der Aktivierungvon EcoRII.

Die Spaltung des als Aktivator eingesetzen 14-bp Oligonukleotidduplexes mit einem EcoRII-Erkennungsort ist nur dann möglich, wenn EcoRII, das aus zwei monomeren Untereinheiten besteht, in der Lage ist, zwei dieser Moleküle gleichzeitig in trans in einen Enzym-Substrat-Komplex zu binden, ähnlich als wären es zwei eng benachbarte Erkennungsorte auf einem DNA-Molekül (in cis).

Wir haben hier erstmals gezeigt, dass eine Restriktionsendonuklease gleichzeitig mit zwei verschiedenen DNA-Molekülen in trans interagieren kann.

2.1.3. Aktivierung von EcoRII durch Spaltprodukte und nicht spaltbare Oligonukleotidduplexe

EcoRII wird durch Zugabe von Aktivator-Molekülen in die Lage versetzt, a priori resistente DNA-Substrate zu spalten. Eine wichtige Frage zum Verständnis des Aktivierungsmechanismus von EcoRII war, ob die Spaltbarkeit des Aktivators selbst eine essentielle Voraussetzung für die Aktivierung von EcoRII ist.

Dazu haben wir in pBR322 Plasmid-DNA, die sechs EcoRII-Erkennnungsorte enthält und nachweislich als Aktivator von EcoRII fungieren kann, die Erkennungsorte durch EcoRII-Verdau komplett zerstört. Das Enzym wurde durch Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation entfernt und die pBR322/EcoRII-Spaltprodukte anschließend mit T3-DNA und EcoRII inkubiert. Wir konnten zeigen, dass EcoRII durch die Produkte der vorangegangenen Spaltreaktion aktiviert werden und die Spaltung der T3-DNA durchführen kann (6). Die EcoRII-Aktivierung gelingt nicht, wenn die EcoRII-Spaltorte in der pBR322-DNA durch Verdau mit einem EcoRII-Isoschizomer, z. B. BstNI oder MvaI, zerstört werden. Das Ergebnis beweist, dass die authentischen EcoRII-Spaltenden mit fünf 5´-überhängenden Basen zur EcoRII-Aktivierung führen. Sowohl BstNI als auch MvaI erkennen zwar dieselbe DNA-Sequenz wie EcoRII, produzieren aber Spaltenden mit nur einer 5´-überhängenden Base.

Außer EcoRII-gespaltener pBR322-DNA sind auch synthetische Oligonukleotide, die EcoRII-Spaltprodukte simulieren, effektive Aktivator-Moleküle. Essentiell scheint allerdings die 5´-Phosphatgruppe zu sein, da ohne diese keine Aktivierung von EcoRII erfolgt. [Seite 14↓]Oligonukleotidduplexe mit Modifikationen innerhalb der EcoRII-Erkennungssequenz, die selbst nicht mehr spaltbar sind, wurden ebenfalls mit Erfolg eingesetzt.

Untersuchungen an synthetischen Oligonukleotiden unterschiedlicher Länge belegen einen indirekten Zusammenhang zwischen der Länge eines Aktivator-Moleküls und seiner Spaltbarkeit durch EcoRII. Oligonukleotidduplexe von 14, 30 bzw. 71 bp Länge wurden durch EcoRII mit abnehmender Effizienz, unter den gegebenen Bedingungen zu 55, 37 bzw. 28 % gespalten. Die isoschizomere Restriktionsendonuklease MvaI spaltet diese Substrate unabhängig von deren Länge.

Die Spaltung natürlicher DNA-Fragmente mit einer unterschiedlichen Anzahl von EcoRII-Erkennungsorten, generiert durch Spaltung von pBR322-DNA mit verschiedenen anderen Restriktionsendonukleasen, zeigte darüber hinaus, dass Fragmente mit nur einem EcoRII-Erkennungsort von EcoRII nicht gespalten werden. Sind mehrere EcoRII-Erkennungsorte auf einem Molekül vorhanden, hat der Abstand zwischen ihnen einen entscheidenden Einfluß auf die Spaltbarkeit. Der Abstand zwischen zwei Orten darf eine kritische Distanz von ca. 1000 bp nicht überschreiten (6).

Diese Daten belegen eindeutig, dass die Aktivierung der Restriktionsendonuklease EcoRII nicht während der Spaltung der Aktivator-DNA vonstatten geht, da sowohl Reaktionsprodukte als auch Oligonukleotidduplexe, die selbst keine Substrate für EcoRII sind, zur Enzymaktivierung führen. Die Aktivator-DNA selbst muß nicht gespalten werden. Andere Voraussetzungen müssen aber dennoch für eine EcoRII-Aktivierung gegeben sein: (i) EcoRII muß das Aktivator-Molekül erkennen und binden können, (ii) für eine effiziente intermolekulare Reaktion (Wechselwirkung mit zwei Erkennungsorten in trans) muß das Aktivator-Molekül klein genug sein, um keine sterische Behinderung im Enzym-Substrat-Komplex darzustellen und (iii) für eine intramolekulare Interaktion von EcoRII (Wechselwirkung mit zwei Erkennungsorten in cis) darf der Abstand zwischen beiden nicht zu groß sein.

Die Ergebnisse lassen sich in einem Modell wie folgt zusammenfassen: EcoRII wechselwirkt im aktiven Enzym-Substrat-Komplex mit zwei Kopien seiner Erkennungssequenz, wobei einer der beiden Erkennungsorte als allosterischer Effektor wirkt und nicht gespalten werden muß. Der allosterisch wirkende Erkennungsort kann sowohl auf demselben als auch auf einem anderen DNA-Molekül als der zu spaltende Erkennungsort lokalisiert sein.


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Die Interaktion von EcoRII mit Erkennungsorten auf unterschiedlichen DNA-Molekülen ist durch deren Länge und Konzentration, die Interaktion innerhalb eines DNA-Moleküls durch den Abstand zwischen den Erkennungsorten limitiert.

Der unkonventionelle Reaktionsmechanismus, nämlich dass EcoRII durch seine eigenen Spaltprodukte zum Schneiden seiner DNA-Erkennungssequenz aktiviert werden kann, ist inzwischen für eine weitere Restriktionsendonuklease, SgrAI, gezeigt worden (Bitinaite and Schildkraut, 2002).

2.1.4. Weitere aktivierbare Restriktionsendonukleasen

Es ist eine Erfahrung aus dem Laboralltag, dass einige Restriktionsendonukleasen ihre Substrate nur unvollständig spalten, ohne dass jedoch nach Ursachen dafür geforscht wurde. Deshalb war es interessant zu untersuchen, ob einige dieser Enzyme vielleicht ähnliche Anforderungen an die DNA stellen wie EcoRII und ob sie auch durch geeignete Oligonukleotidduplexe zur kompletten DNA-Spaltung aktiviert werden können.

Bei dieser Suche wurde eine Reihe von TypII-Restriktionsendonukleasen, isoliert aus den verschiedensten Mikroorganismen, gefunden, die mittels spezifischer Oligonukleotidduplexe stimuliert werden konnten, sämtliche Kopien ihrer DNA-Erkennungssequenz in der DNA zu spalten: AtuBI, BspMI, Cfr9I, HpaII, NaeI, NarI, SacII, SauBMKI, Eco57I, Ksp632I (Oller et al., 1991; 7). Es ist wahrscheinlich, dass die DNA-Spaltung durch diese Enzyme ebenfalls von der Anzahl der Erkennungsorte und eventuell auch von deren Abstand beeinflusst wird.

Hinzu kamen jetzt Berichte über weitere TypII-Restriktionsendonukleasen, die nachweislich zwei Erkennungsorte zur Aktivität benötigen – Sau3AI (Friedhoff et al., 2001), FokI (Vanamee et al., 2001) sowie Acc36I, BsgI und BpmI (Bath et al., 2002). Während einige dieser beschriebenen TypII-Restriktionsendonukleasen als Dimere in Lösung aktiv sind, dimerisieren andere erst in Gegenwart spezifischer DNA. Es sind auch einige Restriktionsendonukleasen bekannt, die als Tetramere identischer Untereinheiten mit zwei Kopien ihrer Erkennungssequenz wechselwirken - SfiI (Wentzell et al., 1995), Cfr10I (Siksnys et al., 1999), NgoMIV (Deibert et al., 2000) und BspMI (Gormley et al., 2002).

Diese Enzyme haben trotz unterschiedlicher oligomerer Strukturen und Reaktionsmechanismen die spezielle Anforderung der Bindung zweier DNA-Erkennungsorte gemeinsam.


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2.1.5.  Anwendungsmöglichkeiten des Prinzips der Enzymaktivierung in der Gentechnik und zum Nachweis epigenetischer Modifikationen

Die Kenntnis, dass sich Restriktionsendonukleasen, die DNA per se nur inkomplett spalten, durch Zugabe sequenz-spezifischer synthetischer Oligonukleotidduplexe zur kompletten Spaltung befähigen lassen, hat sich als äußerst nützlich für gentechnische Experimente herausgestellt.

Die Kartierung von Genomen oder die Analyse von Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen setzt eine komplette DNA-Spaltung voraus. Werden für diese Verfahren Restriktionsendonukleasen verwendet, die bestimmte DNA-Sequenzen _ obwohl nicht methyliert _ nur unvollständig oder gar nicht spalten, könnten die Ergebnisse fehlinterpretiert werden. Unter den bisher bekannten aktivierbaren Restriktionsendonukleasen sind einige, die C+G-reiche DNA-Sequenzen erkennen und deshalb bei der Kartierung von Säuger-Genomen Anwendung finden. Gerade von diesen Enzymen ist bekannt, dass sie ihre Erkennungsorte innerhalb einer DNA mit sehr unterschiedlicher Effizienz spalten. Ausgehend davon, dass die Aktivität der meisten dieser Enzyme durch CpG-Methylierung innerhalb ihrer Erkennungssequenz blockiert wird, könnten nicht gespaltene Erkennungsorte zwingend mit einer DNA-Methylierung in Verbindung gebracht werden, obwohl es sich um selten im Genom auftretende DNA-Erkennungsorte handelt, die wegen ihres Abstandes zueinander gegenüber der Restriktionsendonuklease refraktär sind.

DNA-Methylierung in Pro- und Eukaryoten wird oft wegen der einfachen Praktizierbarkeit durch parallele Spaltung einer DNA mit einem Paar isoschizomerer Restriktionsendonukleasen detektiert – dabei ist die eine Restriktionsendonuklease sensitiv gegenüber der zu bestimmenden Methylierung, die andere nicht. Während die methylierungsunabhängige Restriktionsendonuklease an allen spezifischen Erkennungsorten in einer DNA spaltet, kann die methylierungssensitive Restriktionsendonuklease nur an den unmethylierten Erkennungsorten spalten. Diese Methode wird unzuverlässig, wenn DNA-Moleküle unmethylierte, aber resistente Erkennungsorte enthalten.

Wir konnten zeigen, dass derartige Fehlerquellen sowohl beim Nachweis der Dcm-Methylierung in Bakterien (5’C5meCA/TGG) mit dem Enzympaar EcoRII und BstNI als auch beim Nachweis von 5meCpG in eukaryoter DNA mit dem Enzympaar HpaII und MspI auftreten können [Seite 17↓](8,9). Die in den Tests verwendeten methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen EcoRII und HpaII gehören zu den Enzymen, die DNA in Abhängigkeit von der Frequenz an Erkennungsorten nur inkomplett spalten und die damit zu einer Fehlerquelle bei der Bestimmung von Methylierungsmustern werden. Wir haben dieses methodologische Problem durch die Zugabe von sequenz-spezifischen Oligonukleotidduplexen zum EcoRII- und HpaII-Spaltansatz gelöst. Die Oligonukleotidduplexe aktivieren die Enzyme, so dass alle unmethylierten Erkennungsorte gespalten werden. Die Resistenz der methylierten Erkennungsorte wird durch die Zugabe der Aktivator-Moleküle nicht beeinflusst (8, 9).

Darüber hinaus haben wir gefunden, dass die Enzym-Aktivierung durch Oligonukleotidduplexe sogar mit hochmolekularer genomischer DNA, die zum Schutz vor Scherkräften in Agarose eingebettet wird, funktioniert. Der molare Überschuß an Erkennungsorten auf den Aktivator-Molekülen über die Erkennungsorte in der Substrat-DNA muß hier allerdings 5-10mal höher sein als bei einer Reaktion in Lösung (10).

2.2. Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus von EcoRII (11, 12)

2.2.1. Kooperative Interaktion mit zwei DNA-Erkennungsorten

Wenn das vorhergesagte Zwei-Erkennungsorte-Modell tatsächlich der EcoRII-Enzymaktivität zu Grunde liegt, dann müsste sich eine Substratkooperativität nachweisen lassen.

Da die Spalteffizienz bestimmter EcoRII-Erkennungsorte nicht durch Nachbarschaftsbasen beeinflußt wird, sondern sehr wahrscheinlich durch die vorliegende Dichte von Erkennungsorten in der DNA, ist eine strikte qualitative Unterscheidung zwischen Aktivator-Molekül und “schlechtem” Substrat durch EcoRII nicht zu erwarten. Gabbara und Bhagwat (1992) bestätigten diese Vermutung, indem sie zeigten, dass kurze Aktivator-Moleküle (14 bp) in geringen Konzentrationen selbst auch ineffizient gespalten werden. Bei hohen Konzentrationen dagegen wirken die Oligonukleotidduplexe als Aktivator und sind gleichermaßen gute Substrate für EcoRII – ein Prozess, der positive Substratkooperativität zeigt. Die Wechselwirkung der gereinigten EcoRII-Restriktionsendonuklease wurde deshalb nicht an hochmolekularer DNA, sondern am Modell synthetischer Oligonukleotidduplexe mit einem bzw. zwei EcoRII-Erkennungsorten im Abstand von 55 bp untersucht. Die folgenden drei [Seite 18↓]Oligonukleotidduplexe wurden als Substrate für EcoRII eingesetzt und ihre Spaltung in Abhängigkeit von der Konzentration der Erkennungsorte quantitativ bestimmt _ ein 30-mer mit einem Erkennungsort, ein 111-mer mit einem bzw. zwei Erkennungsorten. Das entscheidende Merkmal bei der Spaltung beider Oligonukleotidduplexe mit einem EcoRII-Erkennungsort (30- und 111-mer) ist eine sigmoidale Abhängigkeit der Spalteffizienz von der Konzentration der EcoRII-Erkennungsorte. Die DNA-Spaltung wird abrupt geringer oder findet nicht mehr statt, wenn eine minimale DNA-Konzentration unterschritten wird (11). Die minimalen Erkennungsort-Konzentrationen liegen für das 30-mer bei 5 nM, für das 111-mer bei etwa 0,5 nM. Diese Daten unterstützen eindrucksvoll die Hypothese, dass EcoRII kooperativ mit zwei spezifischen Erkennungsorten wechselwirken muß, um katalytisch aktiv zu sein. Im Gegensatz zu den Substraten mit nur einem EcoRII-Erkennungsort konvergiert die Spaltung des 111-mers mit zwei Erkennungsorten nicht gegen Null, sobald die minimale Erkennungsort-Konzentration unterschritten wird. Auch bei der sehr geringen Konzentration von 0,5 nM werden noch zwischen 50 und 60 % des Substrates gespalten. Dieser hohe Wert ist auf den Beitrag der intramolekularen Kooperativität von EcoRII mit zwei Erkennungsorten zurückzuführen. Bei höheren Oligonukleotidduplex-Konzentrationen wird die Spaltung darüber hinaus über die intermolekulare Wechselwirkung des Enzyms verstärkt.

2.2.2. Stöchiometrie des aktiven Enzym-Substrat-Komplexes

Die Frage war nun, aus welchen Komponenten der aktive Enzym-Substrat-Komplex besteht. Obwohl EcoRII in Lösung bevorzugt als Dimer vorliegt (Kosykh et al., 1982), ist die kooperative Wechselwirkung mit zwei Erkennungsorten auch durch Bindung eines EcoRII-Dimers pro Erkennungsort denkbar, was im aktiven Komplex dann zu einer tetrameren Proteinstruktur führen würde. Zur Beantwortung der Frage nach der Stöchiometrie des aktiven EcoRII-Substrat-Komplexes haben wir zunächst das Molekulargewicht von EcoRII mit und ohne Substrat durch Gelfiltration bestimmt. Das Molekulargewicht von EcoRII lag bei 85 kDa, was in etwa dem zwei-fachen Molekulargewicht der monomeren Untereinheit entspricht. Das bestätigt, dass EcoRII in Lösung als dimere Proteinstruktur vorliegt. In Gegenwart von Substrat-DNA konnten wir einen DNA-Protein-Komplex nachweisen, der mit einem Molekulargewicht von etwa 197 kDa aus einem EcoRII-Dimer (85 kDa) und zwei Substrat-DNA-Molekülen (2 x 45 kDa) zusammengesetzt sein könnte. Das Molekulargewicht des Komplexes war unabhängig von der [Seite 19↓]eingesetzten Substrat-DNA-Konzentration und unabhängig vom molaren Verhältnis von Substrat und Protein sowie von der Anwesenheit von Mg2+ Ionen (12).

Das stöchiometrische Verhältnis von einem dimeren EcoRII-Molekül und zwei DNA-Molekülen im aktiven Komplex konnten wir auf unabhängige Weise durch Titration der dimeren EcoRII-Moleküle gegen eine konstante Konzentration von DNA-Substrat-Molekülen bestätigen. Es wurden molare Enzym-zu-Erkennungsort Verhältnisse von 0,01 bis 8 getestet. Die effektivste Spaltung wird bei einem Verhältnis von einem dimeren EcoRII-Molekül pro 2-4 DNA-Erkennungsorte erreicht. Beginnend bei einem Verhältnis von 1, wenn theoretisch jeder EcoRII-Erkennungsort von einem dimeren EcoRII-Molekül besetzt ist, wird die EcoRII-Spaltung mit höheren Enzymkonzentrationen deutlich gehemmt. Equimolarität und Enzymüberschuß behindern demnach die Bildung des aktiven Komplexes. Die EcoRII-Hemmung durch Enzymüberschuß ist durch Zugabe entsprechender Substratmengen, die ein Enzym-zu-Erkennungsort Verhältnis von 0,5 wiederherstellen, reversibel und beweist, dass nicht der Enzymüberschuß per se zur Hemmung der EcoRII-Aktivität führt. Wir schlussfolgern aus diesen Experimenten, dass ein dimeres EcoRII–Molekül die gleichzeitige Wechselwirkung mit zwei spezifischen DNA-Erkennungsorten im aktiven Komplex bewerkstelligt (12).

Findet die kooperative Interaktion von EcoRII mit zwei verschiedenen Molekülen statt, so ist die Länge der DNA-Moleküle die kritische Größe – mindestens eines der beiden Moleküle muß klein genug sein, so dass die Bildung des aktiven Komplexes nicht sterisch behindert wird. Für die Interaktion mit zwei Erkennungsorten innerhalb eines DNA-Moleküls sind verschiedene Mechanismen denkbar, wie ein dimeres EcoRII-Molekül die Distanz zwischen benachbarten Erkennungsorten überwinden kann. Generell werden für derartige enzymatische Prozesse die ATP-abhängige DNA-Translokation und ATP-unabhängige DNA-“sliding” oder -“looping” Vorgänge diskutiert (Wang and Giaever, 1988; Dröge, 1994). Da die Aktivität von TypII-Restriktionsendonukleasen ATP-unabhängig ist, ist die DNA-Translokation eher unwahrscheinlich. Ein einfaches Experiment, um zwischen DNA-“sliding“ oder DNA-“looping“ unterscheiden zu können, ist die Plazierung eines DNA-bindenden Proteins zwischen zwei interagierende Erkennungsorte. Ein prozessiver Mechanismus, der eindimensional an der DNA entlang verläuft, sollte durch das gebundene Protein blockiert werden. Ein dreidimensionaler Prozess wie das DNA-“looping“ sollte unbeeinflusst bleiben, vorausgesetzt, das gebundene [Seite 20↓]Protein ist klein genug bzw. der Abstand zwischen den Erkennungsorten groß genug. Unsere Experimente zeigten, dass ein Lac-Repressor, gebunden zwischen zwei EcoRII-Erkennungsorten im Abstand von 191 bp in einem linearen DNA-Molekül, keine Barriere für die kooperative Wechselwirkung von EcoRII mit den zwei Erkennungsorten darstellt. Im Gegensatz dazu blockiert der gebundene Lac-Repressor die essentielle Kooperation der TypIII-Restriktionsendonuklease EcoP15 mit zwei ihrer invers orientierten Erkennungssequenzen. EcoP15-DNA Komplexe kommunizieren über einen ATP-abhängigen DNA-Translokationsmechanismus miteinander (Meisel et al., 1995). Auch Restriktionsendonukleasen, die sich durch lineare Diffusion an der DNA entlang bewegen, wie z.B. EcoRI, werden von gebundenen Proteinen oder von irregulären DNA-Strukturen aufgehalten (Jeltsch et al., 1994). Wir schlußfolgern aus unseren Daten, dass EcoRII die Kooperativität zwischen den beiden Erkennungsorten, zumindest in dem hier getesteten Abstand, durch einen Prozess herstellt, der DNA-“looping“ einschließt.

In welchem Maße wirkt sich nun der Abstand zwischen zwei EcoRII-Erkennungsorten auf die Fähigkeit des Enzyms zur kooperativen Wechselwirkung aus? Lineare DNA-Fragmente mit zwei EcoRII-Erkennungsorten in verschiedener Distanz zueinander wurden auf ihre Spaltbarkeit untersucht. Der funktionell relevante Abstand liegt zwischen den 5’ Cytosinresten der beiden EcoRII-Erkennungsorte. Die Experimente wurden bei Substrat-Konzentrationen durchgeführt, die ausschließlich die intramolekulare Wechselwirkung von EcoRII mit zwei Erkennungsorten zulassen. Sind beide EcoRII-Erkennungsorte direkt benachbart, der Abstand beträgt dann 5 bp, liegt der Anteil der gespaltenen DNA bei etwa 26 %. Das bedeutet, dass EcoRII auch diese direkt nebeneinander liegenden Erkennungsorte als getrennte Erkennungsorte erkennt. Wird der Abstand auf 10 bp vergrößert, steigt die Spaltung auf 80 - 90 % an, die effizienteste intramolekulare DNA-Spaltung, die wir für EcoRII messen konnten. Der Abstand von 10 bp entspricht etwa einer helikalen DNA-Windung, so dass EcoRII wahrscheinlich beide Erkennungsorte von der gleichen Seite der Helix binden kann – eine offensichtlich optimale Konfiguration der kooperierenden Erkennungsorte. Wird dieser optimale Abstand von 10 bp verdoppelt bzw. verdreifacht, sinkt die Spalteffizienz auf 30 - 40 %. Bei Abständen von 31 bis 191 bp erreicht die DNA-Hydrolyse ein Plateau von 20 - 25 %. Bei einem Abstand von 952 bp werden nur noch 6 % des Substrates von EcoRII gespalten. Das entspricht [Seite 21↓]unseren früheren Beobachtungen an zirkulärer und linearer DNA, dass eine Distanz von etwa 1000 bp für die kooperative Wechselwirkung durch EcoRII kritisch ist (8). Alle Abstände, die 10 bp überschreiten, gehen wahrscheinlich mit größeren Distortionen der DNA im Enzym-Substrat-Komplex einher, wie z. B. DNA-Krümmung und -„looping“. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein EcoRII-Dimer gleichzeitig zwei Erkennungsorte binden kann, wird also mit zunehmendem Abstand der Erkennungsorte in der DNA geringer.

Wir haben darüberhinaus beweisen können, dass die Orientierung der beiden kooperierenden Erkennungsorte innerhalb des DNA-Doppelstranges, die durch das zentrale A/T-Paar in der EcoRII-Erkennungssequenz gegeben ist, keinen Einfluß auf die EcoRII-Enzymaktivität hat.

2.3. Untersuchungen zur spezifischen DNA-Erkennung durch EcoRII (13-15)

2.3.1. Lokalisierung von zwei DNA-bindenden Regionen in EcoRII mit synthetischen Peptiden

Wie realisiert EcoRII den Kontakt mit zwei Erkennungsorten auf Aminosäureniveau? Können strukturelle Elemente in der EcoRII-Primärsequenz gefunden werden, die den Kontakt vermitteln? Dazu wurde die Aminosäuresequenz von EcoRII in Form überlappender membran-fixierter synthetischer Peptide auf Bindung radioaktiv markierter Oligonukleotidduplexe mit einer EcoRII-Erkennungssequenz getestet. Diese Methode wurde erfolgreich zur Identifizierung von linearen und diskontinuierlichen Protein-Protein- (Kramer et al., 1997; Rüdiger et al., 1997; Reineke et al., 1998) und von Protein-Metall-Kontaktstellen (Malin et al., 1995) eingesetzt. Wir haben diese Methode für die Untersuchung von DNA-Protein-Kontakten adaptiert.

Die komplette EcoRII-Aminosäuresequenz lag in Form von 132 Dodecapeptiden auf einer Zellulose-Membran vor, wobei benachbarte Peptide um neun Aminosäuren überlappten. Unter stringenten kompetitiven Bedingungen (Anwesenheit von Mg2+ und 104-fachem molaren Überschuss einer unmarkierten unspezifischen Kompetitor-DNA) zeigten fünf Dodecapeptide eine besonders hohe spezifische Affinität zur Erkennungssequenz. Wir konnten zwei spezifische DNA-bindende Regionen in der EcoRII-Aminosäuresequenz identifizieren. Eine liegt im Bereich der Aminosäuren 88 bis 102 NH2-RHFGKTRNEKRITRW (Bindungsregion I) und eine zweite im Bereich der Aminosäuren 256 bis 273 NH2-NSVSNRRKSRAGKSLELH [Seite 22↓](Bindungsregion II). Die Regionen weisen das Consensus-Motiv KXRXXK (fett gedruckt) auf, das in der EcoRII-Aminosäuresequenz ansonsten kein weiteres Mal vorkommt (13).

2.3.2. Identifizierung der für die Peptid-DNA Bindung kritischen Aminosäurereste durch Substitutionsanalyse

Von den zwei DNA-bindenden Peptiden wurden Substitutionsanaloga synthetisiert, wobei jede Position der Originalsequenz durch jeweils alle anderen essentiellen Aminosäuren ersetzt wurde. Um den Einfluß einer Aminosäuresubstitution auf die DNA-Bindung des Peptids beurteilen zu können, wurde die Bindungskapazität der Originalsequenz, die auf Grund des Syntheseschemas und der Länge des Peptids, 30mal auf der Membran vorkommt, durch die Ermittlung des Mittelwertes +/- dreifache Standardabweichung bestimmt. Alle Werte, die nicht in diesen Bereich fielen, wurden als signifikant betrachtet. Es fiel auf, dass in beiden DNA-Bindungsregionen bestimmte basische Aminosäuren von Bedeutung sind. Zu beachtlichen Effekten auf die DNA-Bindungsfähigkeit der Peptide kam es nach Substitution der Aminosäuren Lysin bzw. Arginin an den Positionen 92, 94, 97 und 98 in Bindungsregion I, und noch stärker, an den Positionen 263, 265 und 268 in Bindungsregion II.

2.3.3. Austausch der kritischen Lysinreste verändert die DNA-Bindung oder die Katalyse des EcoRII-Proteins

Entsprechend der Ergebnisse der Substitutionsanalyse der DNA-bindenden Peptide haben wir die Lysine in beiden Bindungsregionen der EcoRII-codierenden DNA-Sequenz mittels ortsspezifischer Mutagenese durch neutrale Alanin- oder saure Glutaminsäurereste ausgetauscht. Wir erhielten die folgenden Mutanten: K92A/K97A, K92E/K97E, K263A/K268A, K263E/K268E, und K92A/K97A/K263A/K268A, K92A/K97A/K263E/K268E, K92E/K97E/K263A/K268A und K92E/K97E/K263E/K268E. Nach Expression mit N-terminalem 6 x His-Schwanz in Escherichia coli-Zellen wurden die Enzym-Mutanten über Nickel-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Enzymmutanten eluierten unter den gleichen Bedingungen von der Säule wie der EcoRII-Wildtyp (WT), reagierten im Westernblot mit polyklonalen EcoRII-spezifischen Antikörpern und zeigten im Vergleich zu EcoRII-WT keine bemerkenswerten Veränderungen der Sekundärstruktur.


[Seite 23↓]

Die DNA-Bindung der EcoRII-Mutanten wurde durch K D -Wertbestimmung im DNA-Gelshift und ihre katalytische Aktivität durch Spaltung linearisierter pBR322-DNA beurteilt. Der Austausch beider Lysine gegen Alanin in Bindungsregion I führt zu einer etwa 6-fachen Verringerung der DNA-Bindung. Die KD-Werte liegen bei 32 nM im Vergleich zu 5 nM für EcoRII-WT. Die Einführung von Glutaminsäure an diesen Positionen verhindert die DNA-Bindung fast vollständig, der KD-Wert liegt deutlich über 250 nM. Im Gegensatz dazu zeigten die entsprechenden Aminosäuresubstitutionen in Bindungsregion II KD-Werte wie der WT. In den EcoRII-Mutanten, die in beiden Bindungsregionen mutiert wurden, entsprechen die KD-Werte etwa denen der nur in Bindungsregion I veränderten Enzym-Mutanten: nach Austausch der Lysine gegen Alanine liegt der K D -Wert bei etwa 45-90 nM; nach Austausch der Lysine gegen Glutaminsäure bei >250 nM. Die KD-Werte der Mutanten werden deutlich von den Aminosäuresubstitutionen in der Bindungsregion I bestimmt. Die Mutationen in Bindungsregion II scheinen keinen, mit unserem System messbaren Beitrag zur DNA-Bindung der EcoRII-Mutanten zu leisten.

Im Gegensatz zu Bindungsregion I, die scheinbar in der DNA-Bindung der EcoRII-Mutanten eine dominierende Rolle spielt, aber nicht deren katalytische Aktivität beeinflusst, führt der Austausch beider Lysinreste in Bindungsregion II zu katalytisch inaktiven Enzym-Mutanten. Wir haben darüber hinaus die Aktivierbarkeit durch sequenz-spezifische Oligonukleotidduplexe (wie sie vom EcoRII-WT bekannt ist) und die Fähigkeit der EcoRII-Mutanten zur Restriktion von λ-Phagen in vivo getestet. Im Gegensatz zu EcoRII WT und den EcoRII-Mutanten in Bindungsregion I, sind die EcoRII-Mutanten in Bindungsregion II nicht mehr durch Oligonukleotidduplexe in trans zu aktivieren, was die Verwicklung dieser Region in die DNA-Hydrolyse unterstreicht. Das Verhalten der exprimierten Enzymmutanten in vivo bei der Restriktion des Bakterienvirus λ entspricht dem der gereinigten Proteine: K92/97A restringiert die Vermehrung des Virus um etwa vier Größenordnungen ebenso wie EcoRII-WT. Mit der Einführung der Glutaminsäurereste anstelle der Lysine an den Positionen 92 und 97 verliert EcoRII einen bedeutenden Teil seiner DNA-Bindungsfähigkeit und die λ-Restriktion sinkt von vier auf eine Größenordnung. Die Mutanten K263/268A und K263/268E sind zwar in vitro katalytisch inaktiv, hemmen aber die Virusvermehrung in vivo noch um ein bis zwei Größenordnungen. Möglicherweise können diese EcoRII-Mutanten unter den physiologischen [Seite 24↓]Bedingungen in der Zelle ihre katalytische Aktivität teilweise zurückgewinnen oder sie wirken wegen ihren effektiven DNA-Bindung wie Repressoren und hemmen auf diesem Wege die virale Genexpression. Die Mutanten mit Veränderungen in beiden Bindungsregionen können λ-Bakteriophagen nicht mehr restringieren.

2.3.4. Sequenzvergleiche identifizieren ähnliche Bindungsmotive in anderen Restriktionsendonukleasen

Sequenzvergleiche identifizierten Bindungsregion II-verwandte Sequenzbereiche in verschiedenen anderen Restriktionsendonukleasen, die als einzige Gemeinsamkeit G:C oder C:G Basenpaare in ihren ansonsten verschiedenen Erkennungssequenzen enthalten. Größte Sequenz-Übereinstimmung fanden wir zwischen EcoRII (5’/CCWGG), SsoII (5’/CCNGG) und ScrFI (5’CC/NGG), die eine degenerierte EcoRII-Sequenz erkennen (Striche kennzeichnen die Spaltpositionen). Die Homologie ist besonders bedeutsam, da sie auf die EcoRII DNA-Bindungsregion II begrenzt ist (13) – eine Tatsache, die die Rolle dieser Proteinregion für die sequenzspezifische Substraterkennung unterstreicht.

Sequenzähnlichkeiten zwischen EcoRII, SsoII und PspGI (/5’CCWGG), einem neu isolierten EcoRII-Isoschizomer, wurden auch von Morgan et al. (1998) beschrieben. Die Autoren identifizierten in den drei Enzymen einen Bereich von 87 Aminosäuren, der auch die Bindungsregion II von EcoRII einschließt, und spekulierten über eine Rolle dieses Bereiches als DNA-erkennendes Motiv für CCXGG-Sequenzen.

Durch umfangreiche Sequenzvergleiche und Analyse kristallographischer Daten wurden kürzlich eine weitere DNA-bindende Region sowie ein potentielles aktives Zentrum im C-terminalen Bereich von EcoRII vorhergesagt ( Pingoud et al., 2002; Tamulaitis et al., 2002).

Für die DNA-Bindungsregion I im N-terminalen Bereich des EcoRII-Proteins konnten wir bisher keine Ähnlichkeit zu einem anderen Protein finden.

2.3.5. Eine monomere EcoRII-Untereinheit kann eine DNA-Erkennungssequenz binden

Die Konserviertheit bestimmter Aminosäuren in der DNA-Bindungsregion II von EcoRII, PspGI und SsoII sowie der postulierte Zusammenhang mit der sequenz-spezifischen DNA-Erkennung durch diese Restriktionsendonukleasen warf die Frage auf, ob sich durch Austausch einzelner, zwischen EcoRII und SsoII nicht konservierter Aminosäuren, die EcoRII-DNA-[Seite 25↓]Spezifität von 5’CCWGG auf 5’CCNGG verändern läßt. Die Spezifitätsänderung konnten wir auf diesem Wege nicht erreichen, aber wir erhielten durch den Austausch des unpolaren Valin an Position 258 von EcoRII gegen das polare Asparagin, das sich an der entsprechenden Position in SsoII befindet, eine EcoRII-Mutante (V258N), bei der die Veränderung dieser einzelnen Aminosäure zur Entkopplung der DNA-Erkennung von kooperativer DNA-Interaktion und Spaltung führte (14).

Die Untersuchung der DNA-Bindungsfähigkeit der EcoRII-Mutante V258N in Gelshift-Experimenten und die Darstellung des DNaseI-Footprints ergab, dass die EcoRII-Mutante ebenso effizient an spezifische DNA bindet wie EcoRII-WT. Beide K D -Werte liegen bei etwa 5 nM. Die V258N-DNA Komplexe zeigten aber eine deutlich höhere Laufgeschwindigkeit als die vom EcoRII WT gebildeten Komplexe. Nach spezifischer DNA-Bindung zeigten sich für EcoRII WT und V258N symmetrische DNaseI-Footprints von 16 bis 18 bp.

Die Bestimmung des relativen Molekulargewichts von V258N mit nativer Gelelektrophorese bestätigte, dass die Mutante in Lösung zum großen Teil als Monomer, EcoRII WT wie erwartet als Dimer vorliegt. Die durch analytische Ultrazentrifugation ermittelten Dissoziationskonstanten bewiesen letztlich für V258N eine im Vergleich zum WT-Enzym etwa 350-fach verringerte Fähigkeit zu dimerisieren. Die Aminosäureposition Val258 ist demnach in einer Region von EcoRII lokalisiert, die für die Ausbildung des Kontakts der monomeren Untereinheiten verantwortlich ist.

Die Spaltaktivität von V258N beträgt nur noch etwa 16 % der Aktivität des WT-Enzyms. Da die DNA-Bindung von V258N ebenso wie die Verteilung der Sekundärstrukturen unbeeinträchtigt sind, ist offensichtlich der destabilisierte Protein-Protein-Kontakt für die verringerte katalytische Aktivität verantwortlich. Diese Daten bestätigen unsere Hypothese, dass der katalytisch aktive Komplex aus einem Dimer und zwei DNA-Substrat-Molekülen zusammengesetzt ist und dass Aminosäuren, die zur DNA-Bindung, Katalyse und Dimerisierung beitragen, eng vernetzt sind.

V258N ist die erste beschriebene monomere Mutante einer Restriktionsendonuklease, bei der die spezifische DNA-Bindungsfähigkeit erhalten geblieben ist. Wir schlussfolgern aus diesen Ergebnissen, dass eine monomere Untereinheit der homodimeren EcoRII [Seite 26↓]Restriktionsendonuklease die strukturellen Komponenten enthält, die zur spezifischen Bindung einer EcoRII-Erkennungssequenz hinreichend sind.

2.3.6. Transmissionselektronenmikroskopie zeigt durch EcoRII induzierte DNA-Schlaufen nach Interaktion mit zwei Erkennungsorten

Die Fähigkeit des dimeren EcoRII-Moleküls, nach gleichzeitiger Bindung von zwei Erkennungsorten spezifische DNA-Schlaufen auszubilden, konnten wir mittels Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar machen. Wir untersuchten dazu die Interaktion von EcoRII mit einer 1202 bp langen linearen DNA mit zwei Erkennungsorten im Abstand von 191 bp. Die asymmetrische Anordnung der beiden Erkennungsorte im DNA-Molekül ermöglichte die Unterscheidung der beiden Enden und damit die Einschätzung der Spezifik der entstandenen DNA-Schlaufen. Unter den gewählten experimentellen Bedingungen bildete EcoRII mit etwa 20 - 25 % der DNA-Moleküle eine spezifische Schlaufe zwischen den Erkennungsorten. Im Gegensatz zum EcoRII-WT fanden wir für die monomere V258N nur 3 - 6 % DNA-Schlaufen. Die Daten zeigen, dass die Ausbildung der EcoRII-induzierten DNA-Schlaufen an eine intakte dimere Proteinstruktur gebunden ist.

2.3.7. “Photocross-linking”-Experimente identifizieren einen asymmetrischen direkten Kontakt des EcoRII-Proteindimers zu den Basen der DNA-Erkennungssequenz

Obwohl wir mit Hilfe von Membran-gebundenen Peptiden zwei DNA-bindende Regionen innerhalb der EcoRII-Aminosäuresequenz identifizieren und deren funktionelle Bedeutung bestätigen konnten, ließen diese Daten noch keine Schlussfolgerung über direkte Kontakte einzelner Aminosäuren mit den Basen der Erkennungssequenz zu. Insbesondere konnten wir keine Aussage darüber treffen, ob die Lysine im Konsensus-Motiv oder andere Aminosäuren der beiden Bindungsregionen Kontakte zu den Basen der Erkennungssequenz oder zum Phosphatrückgrat der DNA herstellen oder aber ob sie entscheidend für die Geometrie und Ladungsverteilung in den Bindungsregionen sind. Es war ebenso unklar, ob der Kontakt von EcoRII zur DNA-Erkennungssequenz in beiden Strängen identisch ist oder nicht.

Um Aminosäuren zu identifizieren, die direkt und spezifisch mit den Basen der EcoRII-Erkennungssequenz in Kontakt sind, haben wir EcoRII und verschiedene Oligonukleotidduplexe mit einem EcoRII-Erkennungsort durch einen Helium/Cadmium-Laser photochemisch vernetzt. [Seite 27↓]In jedem Oligonukleotidduplex wurde jeweils eine Base der Erkennungssequenz substituiert _ Cytosin durch 5-Joddesoxycytidin (Y) oder Thymin, Adenin und Guanin durch 5-Joddesoxyuridin (X). Beide Substituenten lassen sich durch UV-Licht der Wellenlänge 325 nm anregen, um mit elektronenreichen Aminosäuren wie Phe, Tyr, Trp, His oder Met, die sich in unmittelbarer Nähe der DNA-Erkennungssequenz befinden, zu vernetzen. Die höchste Vernetzungsrate von etwa 45% erhielten wir im Falle der Substitution des 5’C im 5’CCAGG-Strang durch Y. Deutlich geringere Vernetzungsraten von etwa 5 % wurden erreicht, wenn das zentrale A oder T durch X substituiert war. Alle anderen Substitutionen in der EcoRII-Erkennungssequenz führten wegen gestörter Bindung oder wegen wahrscheinlich nicht vorhandener reaktiver Aminosäuren in entsprechender Nähe und Orientierung zu den Basen der DNA-Erkennungssequenz nicht zur Bildung eines nachweisbaren DNA-EcoRII Vernetzungsproduktes (15).

Die Restriktionsendonuklease EcoRII stellte die wichtigste spezifische Vernetzung zum 5’C des 5’CCAGG-Stranges, nicht aber zum 5’C des 5’CCTGG-Stranges her, obwohl EcoRII das entsprechend modifizierte Oligonukleotidduplex (5’YCTGG) binden kann. Das EcoRII-Vernetzungsmuster mit den Basen seiner doppelsträngigen DNA-Erkennungssequenz ist damit ein asymmetrisches. Wir konnten zeigen, dass die beobachtete Asymmetrie in der Erkennung der beiden DNA-Stränge durch EcoRII nicht durch Nachbarschaftsbasen verursacht wird. Wir schlussfolgern daraus, dass die lokale Asymmetrie der EcoRII-Erkennungssequenz im zentralen A/T-Paar für die Asymmetrie des EcoRII-Vernetzung verantwortlich ist. EcoRII unterscheidet sich damit deutlich von den TypII-Restriktionsendonukleasen, die ihre Erkennungssequenz in symmetrischer Weise erkennen und demnach auch ein symmetrisches Vernetzungsmuster zeigen sollten (Pingoud and Jeltsch, 2001).

Das EcoRII-Peptid, das die Vernetzung mit dem 5’C des 5’CCAGG-Stranges herstellt, wurde durch Vergleich der RT-HPLC (reversed phase high performance liquid chromatography)-Chromatogramme der durch Trypsinbehandlung des mit der DNA vernetzten EcoRII und des freien Enzyms entstandenen Peptidmischungen ermittelt. Die Sequenz des relevanten Peptids wurde durch Edman-Abbau bestimmt. Das vernetzte Peptid entspricht den Aminosäuren 25 - 49 von EcoRII LSANDTGATG GHQVGLYIPS GIVEK.


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Der Austausch der energiereichen Aminosäuren dieses Peptids, His36 und Tyr41, durch Ala mittels ortsspezifischer Mutagenesein EcoRII und die Expression der entsprechenden EcoRII-Mutanten bewiesen, dass Tyr41 die Aminosäure innerhalb des Peptids ist, die mit dem 5’C des 5’CCAGG-Stranges vernetzt ist. Tyr41 spielt offensichtlich eine entscheidende Rolle für die basen-spezifische DNA-Erkennung durch EcoRII (15).

2.4. Untersuchungen zur Domänenorganisation von EcoRII (16)

2.4.1. Limitierte Proteolyse von EcoRII zeigt zwei stabil gefaltete funktionelle Domänen

Insbesondere durch unsere Mutationsanalysen kennen wir Aminosäuren von EcoRII, die für DNA-Bindung, -Katalyse und Protein-Protein-Kontakte funktionell wichtig sind (13-15, unveröffentlichte Ergebnisse). Die durch die Mutationen hervorgerufenen veränderten Eigenschaften des Enzyms suggerierten die Zusammensetzung aus mindestens zwei funktionellen Domänen.

Um Informationen über stabil gefaltete Proteindomänen zu erhalten, haben wir EcoRII mit und ohne DNA einer limitierten Proteolyse durch die Proteasen Trypsin und Chymotrypsin unterzogen. Die Zuordnung der proteolytischen Fragmente zu einer definierten EcoRII-Aminosäureposition wurde nach N-terminaler Sequenzierung der proteolytischen Fragmente unter Einbeziehung ihrer molekularen Massen möglich.

Bei proteolytischem Abbau von EcoRII durch sowohl Trypsin als auch Chymotrypsin in Gegenwart von spezifischer DNA zeigten sich stabile Fragmente, die dem N-Terminus von EcoRII zugeordnet werden konnten. Die Fragmente, die ohne spezifische DNA den Proteasen am längsten widerstehen, gehören in die C-terminale Hälfte der EcoRII-Restriktionsendonuklease. Wir schlussfolgern aus diesen Ergebnissen, dass EcoRII sehr wahrscheinlich aus zwei Domänen besteht, die in etwa der N- bzw. C-terminalen Hälfte des Proteins entsprechen. Die N-terminale Domäne scheint für die spezifische Substrat-Bindung von Bedeutung zu sein, da sie in Gegenwart spezifischer DNA während der Proteolyse stabilisiert wird.


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2.4.2.  Expression der einzelnen EcoRII-Domänen erlaubt die Zuweisung distinkter Funktionen

Die Frage war nun, ob die identifizierten proteolytischen Fragmente tatsächlich stabilen funktionellen Domänen von EcoRII entsprechen. Wir haben dazu die entsprechenden EcoRII-codierenden DNA-Bereiche kloniert und exprimiert. Die trunkierten Proteine beinhalteten die N-terminalen Aminosäuren 4-192 (EcoRII-N) und die C-terminalen Aminosäuren 173-404 (EcoRII-C).

EcoRII-N bindet spezifisch, mit einem KD-Wert, der nur eine Größenordnung schlechter ist als der des kompletten Proteins, an DNA. Im Gegensatz zu EcoRII-N, konnten wir für EcoRII-C keine spezifische DNA-Bindung im hier verwendeten Gelshift nachweisen.

Obwohl EcoRII-N spezifisch an DNA bindet, ist es nicht in der Lage, die DNA spezifisch oder unspezifisch zu spalten. Im Gegensatz zu EcoRII-N, spaltet EcoRII-C linearisierte pBR322-DNA spezifisch und sogar mit einer etwa 100-fach höheren Reaktionsgeschwindigkeit als EcoRII-WT. Diese hohe Reaktionsgeschwindigkeit entspricht der einer orthodoxen TypII-Restriktionsendonuklease, z.B. der des EcoRII-Isoschizomers BstNI. EcoRII-C enthält offensichtlich alle essentiellen strukturellen und funktionellen Komponenten einer TypII-Restriktionsendonuklease, um jeden einzelnen Erkennungsort innerhalb einer DNA zu spalten.

Um diese Hypothese zu überprüfen, untersuchten wir die Spaltung der genomischen DNA des Bakterienvirus T3 mit EcoRII-C. T3-DNA wird von EcoRII-WT nicht gespalten (2). Der Grund dafür liegt in der notwendigen simultanen Interaktion von EcoRII mit zwei Erkennungsorten. Die fast 40.000 bp lange lineare Virus-DNA trägt nur drei EcoRII-Erkennungsorte und kann deshalb nicht von EcoRII-WT geschnitten werden. Zu unserer Überraschung spaltete EcoRII-C T3-DNA ebenso effizient wie die TypII-Restriktionsendonuklease BstNI, während T3-DNA unter den gleichen Bedingungen durch EcoRII-WT nicht gespalten werden kann. EcoRII-C stellt offensichtlich eine Endonuklease-ähnliche Domäne dar. Die Tatsache, dass EcoRII-C DNA spezifisch spaltet, setzt voraus, dass es auch spezifisch an die DNA binden kann. Vermutlich ist die Stabilität der gebildeten Komplexe zu gering, um sie in unseren Gelshift-Experimenten darstellen zu können.

EcoRII besteht demnach aus zwei Domänen, die spezifisch und unabhängig voneinander DNA binden können.


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2.5.  Erste Versuche zur Kristallisierung von EcoRII und EcoRII-Mutanten (17)

Für die Aufkärung der strukturellen Grundlage der EcoRII-DNA Wechselwirkung wäre die Röntgenkristallstrukturanalyse der Restriktionsendonuklease EcoRII und des Komplexes mit der DNA besonders wertvoll.

Die erste Kristall- und Ko-Kristallstruktur einer TypIIE-Restriktionsendonuklease, NaeI, wurde erst kürzlich aufgeklärt (Huai et al., 2000; 2001). Die 2,5 Å Kristallstruktur von NaeI im Komplex mit einem 17 bp langen DNA-Substrat zeigte, dass zwei DNA-Moleküle an zwei unterschiedliche Domänen in NaeI binden _.eine Besonderheit verglichen mit der Bindung eines DNA-Moleküls pro Dimer durch orthodoxe TypII-Restriktionsendonukleasen. Es wäre sehr interessant zu sehen, ob EcoRII ähnlich aufgebaut ist.

EcoRII wurde erstmals in kubischer Form kristallisiert (Karpova et al., 1999). Die Kristalle, die in Abwesenheit von Mg2+ gebildet wurden, konnten nur bis 4 Å aufgelöst werden. Wir haben nun His6-EcoRII verwendet und in Anwesenheit von Mg2+ Kristalle in monokliner Form erhalten, die bis zu 2,8 Å aufgelöst werden konnten (17). Von einer EcoRII-Mutante, R88A, konnten sogar monokline Kristalle mit einer Auflösung von 2,1 Å gewonnen werden. Alle vorläufigen Daten sprechen für die Existenz von zwei monomeren EcoRII-Untereinheiten in der Elementarzelle des Kristalls. Gegenwärtig laufen die Arbeiten zur Strukturaufklärung.

2.6. Bedeutung der strukturellen Details für die Funktion der Restriktionsendonuklease EcoRII

2.6.1. Modell des molekularen Reaktionsmechanismus von EcoRII

Die Verknüpfung unserer strukturellen und funktionellen Daten führte zu einem Modell der EcoRII-Struktur und seiner Interaktion mit der DNA: EcoRII existiert in Lösung als stabile homodimere Struktur. Das überdurchschnittlich große Molekulargewicht des EcoRII-Dimers von etwa 2 x 46,6 kDa im Vergleich zu anderen TypII-Restriktionsendonukleasen (ca. 2 x 30 kDa) suggeriert, dass EcoRII aus mehr als einer Proteindomäne bestehen könnte. Unsere Proteolyse-Experimente beweisen, dass ein EcoRII-Monomer aus zwei stabil gefalteten Proteindomänen besteht, die in etwa die beiden Hälften des Proteins ausmachen – einer N-terminalen Domäne EcoRII-N (Aminosäuren 1-190) und einer C-terminalen Domäne EcoRII-C (Aminosäuren 173-404). Jede der beiden EcoRII-Domänen, die vermutlich über einen kurzen [Seite 31↓]flexiblen „Arm“ verbunden sind, verfügt über eine DNA-bindende Region mit einem an basischen Aminosäuren reichen Konsensus-Motiv und bindet spezifisch und unabhängig an das DNA-Substrat. Der Beitrag der N-terminalen Domäne zur DNA-Substrataffinität des kompletten Enzyms scheint der primär entscheidende zu sein, da die gemessenen KD - Werte von EcoRII-N und dem kompletten Enzym nur um eine Größenordnung differieren. Im N-terminalen Bereich von EcoRII liegt auch die Aminosäure Tyr41 , die im direkten Kontaktzum 5’C des 5‘CCAGG-Stranges der Erkennungssequenz steht. Obwohl DNaseI-Footprinting- und Gelshift-Untersuchungen zeigen, dass EcoRII den 5’CCTGG-Strang der Erkennungssequenz ebenso wie den 5‘CCAGG-Strang bindet, konnten wir eine spezifische Vernetzung mit diesem Teil der Erkennungssequenz nicht nachweisen.

Die C-terminale Domäne von EcoRII beinhaltet alle strukturellen und funktionellen Komponenten einer orthodoxen TypII-Restriktionsendonuklease. Im C-terminalen Teil von EcoRII liegen nach unseren eigenen Daten und ebenso nach strukturellen Vorhersagen anderer Autoren (Pingoud et al., 2002; Tamulaitis et al., 2002) katalytisch wichtige Sequenz-Motive. Im C-terminalen Teil konnten wir auch entscheidende Protein-Protein-Kontakte lokalisieren (Petter, 2001) – eine Tatsache, die verdeutlicht, dass Aminosäuren, die für die hochspezifische DNA-Bindung und -Katalyse, aber auch für die Dimerisierung verantwortlich sind, notwendigerweise ein enges Netzwerk bilden. Wir konnten experimentell zeigen, dass die Enzym-Aktivität von EcoRII an eine intakte Dimer-Struktur gebunden ist. EcoRII-C liegt in Lösung als Dimer vor und kann spezifisch einzelne Erkennungsorte in beiden DNA-Strängen schneiden. Dieser überraschende Befund beantwortete gleichzeitig eine bis dahin ungeklärte Frage, nämlich wie die beiden DNA-Bindungsregionen innerhalb der Aminosäuresequenz von EcoRII in den zwei zu erwartenden Substratbindungsorten des Proteindimers organisiert sind: ein Substratbindungsort von EcoRII wird offensichtlich von den beiden C-terminalen Domänen, der zweite von den beiden N-terminalen Domänen gebildet. Da das aktive Zentrum von EcoRII in der C-terminalen Domäne liegt, wird der Erkennungsort des hier gebundenen DNA-Doppelstranges in einem Bindungsereignis endonukleolytisch gespalten. Das durch die beiden N-terminalen Domänen des EcoRII-Dimers gebundene DNA-Molekül fungiert als Aktivator bzw. Effektor und wird nach unserem bisherigen Kenntnisstand nicht geschnitten. Innerhalb der EcoRII-Aminosäuresequenz können also zwei unterschiedliche Peptide, die zwei nicht [Seite 32↓]identische Substratbindungsorte bilden, mit ein und derselben DNA-Erkennungssequenz interagieren.

Die Entscheidung, welches DNA-Molekül am N-terminalen, und welches am C-terminalen Substratbindungsort gebunden wird, fällt mehr oder weniger zufällig, wobei wir den Einfluß von Nachbarschaftsbasen des Erkennungsortes auf die Bindung an den einen oder anderen Substratbindungsort von EcoRII nicht völlig ausschließen können. Determiniert ist aber, dass beide Substratbindungsorte am EcoRII-Dimer besetzt sein müssen und dass nur das am C-terminalen Substratbindungsort gebundene DNA-Molekül gespalten werden kann. Die Wahrscheinlichkeit, dass beide DNA-Bindungsorte gleichzeitig okkupiert sind, hängt von der DNA-Konzentration und -Länge oder vom Abstand zweier Erkennungsorte in cis ab. Sind in einem Reaktionsansatz DNA-Moleküle verschiedener Länge und Konzentrationen vorhanden, z.B. wenn die Spaltung von hochmolekularer T3-DNA durch einen molaren Überschuß synthetischer Oligonukleotidduplexe stimuliert wird, so ist die bevorzugte Bindung der kurzen und im Überschuß vorhandenen Oligonukleotidduplexe an den Effektor-Bindungsort denkbar, da er über eine um Größenordnungen höhere DNA-Bindungsaffinität verfügt als der Substratbindungsort an den C-Termini. Sind nur synthetische Oligonukleotidduplexe in der Reaktion, so können sie gleichermaßen Effektor und Substrat sein. Das gilt offensichtlich nicht für hochmolekulare DNA, wie z.B. T3- oder T7-Genome. Die beiden Substratbindungsorte von EcoRII können, wahrscheinlich aus sterischen Gründen oder wegen der geringen Dichte an EcoRII-Erkennungsorten in den DNA-Molekülen, nicht gleichzeitig zwei dieser großen DNA-Moleküle binden. Denkbar ist auch, dass die Bindung prinzipiell möglich, der gebildete Komplex aber zu instabil ist.

2.6.2. EcoRII – eine Restriktionsendonuklease auf dem Weg zu neuen Funktionen?

Wir haben mit EcoRII-C eine Restriktionsendonuklease entwickelt, die im Gegensatz zu EcoRII-WT auch DNA-Substrate mit einzelnen Erkennungsorten spaltet. EcoRII-C spaltet diese Substrate unabhängig von einer zweiten Erkennungssequenz. Das bedeutet, dass wir erstmals eine Restriktionsendonuklease mit neuer DNA-Spezifität erhalten haben. Während EcoRII-WT spezifische Kontakte zur Erkennungssequenz 5‘CCWGG-(X)n-CCWGG herstellen muß, um aktiv zu sein, ist für EcoRII-C mit 5‘CCWGG nur die Hälfte der Kontakte essentiell.


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Die Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass die Verkürzung von Restriktionsendonukleasen, die die Wechselwirkung mit zwei Erkennungsorten benötigen, eine generelle experimentelle Strategie sein könnte, um deren katalytische Aktivität zu verbessern.

Die C-terminale Domäne von EcoRII, die an sich eine aktive TypII-Restriktionsendonuklease ist, könnte im Verlaufe der Evolution eine zusätzliche DNA-bindende Domäne und damit eine neue Proteinfunktion akquiriert haben. Die neue Funktion besteht in der gleichzeitigen Wechselwirkung mit zwei Kopien der Erkennungssequenz 5’CCWGG und reduziert gleichzeitig die endonukleolytische Aktivität des Enzyms.

Dass EcoRII mit zwei DNA-Sequenzen gleichzeitig wechselwirken muß, könnte eine Verbindung zu Enzymen aufzeigen, die in der Zelle an Prozessen wie DNA-Transposition und -Rekombination beteiligt sind. In der Tat haben Sequenzvergleiche konservierte, funktionell bedeutsame Aminosäuren in EcoRII und der Integrase-Familie der ortsspezifischen Rekombinasen gefunden (Topal und Conrad, 1993; Nunes-Düby et al., 1998). In den letzten Jahren wurde die Konservierung von Restriktionsendonuklease-ähnlichen Strukturen in einer Reihe von Enzymen beschrieben, die an Prozessen wie DNA-Transposition, -Rekombination und -Reparatur in Prokaryoten, Eukaryoten und Archaea beteiligt sind (Kovall und Matthews, 1998; Ban und Yang, 1998; Hickman et al., 2000; Tsutakawa und Morikawa, 2001; Yang et al., 1999; Daiyasu et al., 2000; Wah et al., 1997). Das könnte darauf hinweisen, dass sich diese mit der DNA interagierenden Enzyme möglicherweise vor sehr langer Zeit von einer gemeinsamen Nuklease-Struktur divergent entwickelt haben. Ausgehend von einer evolutionären Verwandtschaft zwischen Restriktionsendonukleasen und verschiedenen DNA-prozessierenden Enzymen könnte man spekulieren, dass die Akquirierung einer zusätzlichen DNA-bindenden Domäne durch EcoRII ein erster Schritt einer Restriktionsendonuklease auf dem Weg zu Proteinfunktionen ist, die über die Spaltung von Phosphodiesterbindungen hinausgehen.

Die beschriebene strukturelle Homologie zwischen diesen Enzymen spricht deutlich für eine Verbindung zwischen sequenzspezifischer DNA-Rekombination bzw. -Transposition und Restriktionsendonukleasen. Eine Verbindung, die möglicherweise in der biologischen Funktion der R/M-Systeme begründet ist. Neben der allgemein akzeptierten Erklärung, dass R/M-Systeme in Bakterienzellen existieren, um die Infektion durch Bakterienviren und andere molekulare Parasiten abzuwehren (Bickle und Krüger, 1993), werden seit einiger Zeit weitere [Seite 34↓]Hypothesen diskutiert, die die Entstehung und Erhaltung der zahlreichen R/M-Systeme im Laufe der Evolution erklären könnten (Naito et al., 1995; Arber, 2000; Kobayashi, 2001). Während genetische Stabilität für das Überleben eines Individuums bzw. einer Population auf kurze Sicht essentiell ist, ist es die genetische Variabilität auf längere Sicht. R/M-Systeme erfüllen beide Ansprüche gleichermaßen (Bickle and Krüger, 1993). Arber (2000) postuliert die Existenz sogenannter „Evolutionsgene“ und bezeichnet die R/M-Systeme, gemeinsam mit den Reparaturgenen, als „Frequenzmodulatoren der genetischen Variation“ _ einerseits restringieren sie die Aufnahme fremden genetischen Materials auf ein für die Zelle tolerierbares Maß, andererseits produzieren sie mit den DNA-Restriktionsfragmenten potentielles rekombinationsfähiges Material, das ins Genom der Zelle aufgenommen werden kann. Die Anhäufung genomischer Sequenzdaten und deren Vergleich belegt darüber hinaus eindrucksvoll die Beweglichkeit von R/M-Systemen innerhalb eines Genoms und zwischen verschiedenen Genomen. Diese Ereignisse scheinen nicht selten das Arrangement genomischer Sequenzen zu verändern (Arber, 2000; Kobayashi, 2001).

Eine alternative Hypothese (Naito et al., 1995) betrachtet die R/M-Systeme als „egoistische“ genetische Elemente, ähnlich den Viren oder den Transposons. R/M-Systeme sichern ihr Fortbestehen innerhalb einer Population auf Kosten der Wirtszelle, indem sie sie töten, sofern die Wirtszelle sie eliminiert. Diese Beobachtung wurde nur für die R/M-Systeme des Typ II gemacht (Kobayashi, 2001). Der Verlust der komplexeren TypI R/M-Systeme scheint der Wirtszelle dagegen keine Probleme zu bereiten (Murray, 2002). Zukünftige Untersuchungen müssen zeigen, ob R/M-Systeme tatsächlich mehr Funktionen erfüllen als bisher angenommen.

Die Akquirierung neuer Proteindomänen, entweder durch den vorausgesagten häufigen horizontalen Gentransfer der R/M-Gene verbunden mit DNA-Umordnungen oder durch die Auf- nahme von DNA-Restriktionsfragmenten, ist zweifellos eine effiziente evolutionäre Strategie, um Proteine mit neuen Funktionen zu erhalten. Untersuchungen an diversen Protein-Superfamilien belegen diese Entwicklung, da sie aus zwei oder mehreren separaten Domänen zusammengesetzt sind (Babbitt und Gerlt, 2001). Im Falle von EcoRII besteht die neu erworbene Funktion in der Abhängigkeit der Enzymaktivität von zwei Kopien der DNA-Erkennungssequenz, ein essentielles Merkmal, das ebenso Enzyme auszeichnet, die in der Zelle an sequenz-spezischer Rekombination und Transposition beteiligt sind. Die Fähigkeit zur [Seite 35↓]DNA-Transposition könnte für EcoRII einen selektiven Vorteil darstellen. EcoRII könnte auf diesem Wege für die horizontale Verbreitung seiner codierenden Gensequenzen, ähnlich einem transponiblen Element, selbst sorgen.


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10.06.2005