Richter , Frank : Interaktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen - möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms
Interaktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen
- möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms
HABILITATIONSSCHRIFT

Zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med. habil.
(doctor medicinae habilitatus)
vorgelegt von

Dr. med. Frank Richter
aus Magdeburg

Präsident: Prof. Dr. rer. nat J.Mlynek
Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Eingereicht im September 2001


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Die Ergebnisse der vorliegenden Habilitationsschrift wurden in folgenden Abstracts und Publikationen veröffentlicht (chronologisch geordnet):

  1. F.Richter: “Influence of retinoic acid on cell proliferation of NRP152 and NRP154 -a cancerogenous and a non-cancerogenous cell line from rat prostate.“ Abstract.
    Summer Research Conference “Advances in Cell Biology“ of the American Urological Association (AUA), 9.-11. August 1996, Houston, Texas, USA.
  2. M.T. Li, F. Richter, H.F.S. Huang, R. J. Irwin:
    “Interaction of testosterone and retinoic acid on human prostate cancer cells.“ Abstract.
    37th Annual Meeting of theAmerican Society for Cell Biology,13.-17. Dezember 1997; Washington DC, USA.
  3. F. Richter, H.F.S. Huang, M.T. Li, D. Danielpour, R.J. Irwin:
    “ Tumorigenesis of rat prostate epithelial cells is associated with an altered retinoic acid / RAR- pathway.“ Abstract. International Symposium on Biology of Prostate Growth.15.-18. März 1998. NIH, Bethesda, Maryland,USA
  4. F. Richter, H. F.S. Huang, M.T. Li, R. Irwin:
    “Expression von Retinolsäuerezeptor (RAR)mRNA in humanem Prostatakarzinom und Prostatagewebe.“Abstract. Jahrestagung der “Deutschen Gesellschaft für Urologie“
    Hamburg, 23. - 26. September 1998.
  5. F. Richter:“ Differences in expression of retinoic acid receptor mRNAs in human prostate versus prostate cancer.“Abstract. Foundation of the Clinical Research Center and
    Institute for Biomedical Research,Hackensack University Medical Center,
    Hackensack, New Jersey, USA, 13. November 1998.
  6. F. Richter, H.F.S. Huang, M.T. Li, D. Danielpour, R.J. Irwin:
    “Tumorigenesis of rat prostate epithelial cells is associated with an altered retinoic acid / RAR- pathway.“Prostate 38:4; 340-341, 1999.
  7. F. Richter, H.F.S. Huang, M.T. Li, R.J. Irwin Jr:
    “Retinoid and androgen regulation of cell growth; Epidermal Growth Factor and Retinoic Acid Receptors in normal and carcinoma rat prostate cells.“
    Molecular and Cellular Endocrinology 153: 29-38, 1999.

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  8. F. Richter, D. O`Keefe, D.J. Bacich, A. Uchida, M. Bisogna , W.D.W. Heston:
    “Co-incubation of microvascular endothelial cells with breast cancer cell line stimulates PSMA-expression in vitro.“ Poster, Annual Meeting of the American Association for Cancer Research (AACR), San Francisco, 5. April, 2000.
    Proceedings of the American Association for Cancer Resarch 41: 794 ; 2000 (Abstract 5051).
  9. F. Richter, D. O`Keefe, D.J. Bacich, A. Uchida, M. Bisogna , W.D.W. Heston:
    “Co-incubation of microvascular endothelial cells with breast cancer cell line stimulates PSMA-expression in vitro.“Abstract, 95th Annual Meeting of the American Urological Association (AUA), Atlanta, USA, 30. April, 2000.
  10. Li, M.-T., Richter, F., Hsiao, P.-W., Wang, C, Chang, C., Irwin, R.J., Huang, H.F.S.:
    “ Androgen and retinoic acid interaction in LNCaP cells. Effects on cell proliferation and expression of retinoic acid receptor and epidermal growth factor receptor. (Molecular and Cellular Endocrinology (in Revision).
  11. Li, M.-T., Richter, F., Hsiao, P.-W., Wang, C,., Irwin, R.J., Huang, H.F.S.:
    “Differential Expression of Retinoid acid receptors in the Rat Prostate - Effect of Anatomic Location and Castration.“ (Endocrinology, eingereicht 1/2001).
  12. Richter F., Joyce, A. , Fromowitz, F, Irwin, R.J.,Huang, H.F.S.:
    Expression of Retinoid Acid Receptors in Human Prostate and Prostate Cancer.
    Journal of Cellular Endocrinology and Metabolism (eingereicht 4/2001).

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Inhaltsverzeichnis

TitelseiteInteraktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen - möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms
Abkürzungsverzeichnis VERZEICHNIS DER IN DER ARBEIT VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN
1 EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG
2 STAND DER FORSCHUNG
2.1ANDROGENREZEPTOR - MOLEKULARBIOLOGIE, FUNKTION UND KLINISCHE BEDEUTUNG
2.2RETINOIDREZEPTOREN UND RETINOIDE
2.3ZELLKULTURMODELLE BEIM PROSTATAKARZINOM
2.4TIERMODELLE DES PROSTATAKARZINOMS UND DEREN LIMITIERUNGEN
2.5THERAPEUTISCHER EINSATZ VON RETINOIDEN BEI MALIGNEN TUMOREN
3 MATERIALIEN UND METHODEN
3.1VERWENDETE ZELLINIEN UND DEREN CHARAKTERISIERUNG
3.2TIERMODELL NACH POLLARD (LOBUND-WISTAR-RATTE)
3.3GEWINNUNG VON HUMANEM PROSTATAGEWEBE-GEWEBEAUFBEREITUNG
3.4BESTIMMUNG DER ZELLPROLIFERATION
3.5NORTHERN BLOTS MIT cDNA GEGEN ARmRNA uns RARmRNA
3.6ANALYSE DER GEN-EXPRESSION MIT GEN-ARRAYS (NRP152 und NRP154 )
3.7RT-PCR MIT RARalpha,beta,gamma- PRIMERN
3.8WESTERN BLOTS MIT ANTIK_RPERN GEGEN RARalpha,RARbeta, RARgamma, und EGFR
3.9LIGANDEN-BINDUNGS-ASSAYS MIT [125I]-EGF und [125I]-IGF1
3.9.1Zellmembran- Präparation
3.9.2Liganden-Bindungs-Assays
3.10IMMUNHISTOCHEMIE MIT ANTIK_RPERN GEGEN RARalpha, RARß, RARgamma und EGFR
3.11DATENANALYSE UND STATISTISCHE AUSWERTUNG
4 ERGEBNISSE
4.1Bestimmung der Zellproliferation
4.2AR-mRNA und RAR-mRNA- Expression
4.3Gen-Arrays zur Identifizierung unterschiedlicher Genexpression zwischen NRP152 und NRP154
4.4Einfluß der Androgenbehandlung auf Expression von Onkogenen - Unterschiede zwischen NRP152/NRP154
4.5RT-PCR von menschlichem Prostatageweben (Benigne versus Karzinom) mit RAR-Primern
4.6Western Blots mit Antikörpern gegen RARalpha , RAR ß, RARgamma, EGFR
4.7Liganden-Bindungs-Assays mit [125I]-EGF und [125I]-IGF1
4.8Immunhistochemie mit Antikörpern gegen RARalpha, RAR ß, RARgamma
4.8.1Zellinien
4.8.2Immunhistochemie mit Rattenprostaten
4.8.2.1Unterschiede in der Expression der RARalpha, RARbeta, RARgamma in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Rattenprostata
4.8.2.2Einfluß von Kastration auf die Expression der RARalpha, RARbeta, RARgamma im Rattenmodell
4.8.2.3Einfluß einer chemisch induzierten Karzinogenese auf die Expression der RARalpha, RARbeta, RARgamma im Rattenmodell
4.8.3Immunhistochemie - Gewebsschnitte mit humaner Prostata
4.9Vergleich der Expression von RARalpha, RARbeta, RARgamma-mRNA in verschiedenen Geweben und Zellinien
5 DISKUSSION
Bibliographie LITERATURVERZEICHNIS
Anhang A THESEN
Danksagung
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Primer für RT-PCR ( Sequenzen, Loci und Basenpaarlänge der PCR-Produkte)
(nach Tanji et al. 1996)
Tab. 2: Patienten und Tumordaten
Tab. 3: Grad der Immunreaktivität (semi-quantitativ) und Anzahl immunpositiver Zellen pro Azinus. Vergleich von Gewebsschnitten aus menschlichem Prostatagewebe zwischen benigner Prostata (Normal); PIN, hochdifferenzierten (Gleason <7) Prostatakarzinomen (LGPCa) und undifferenzierten (Gleason >6) Prostatakarzinomen (HGPCa). Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen mit p<0.05.

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Struktur der Retinoid-Rezeptoren RARalpha,beta,gamma
Abb. 2: SchematisierterMechanismus der RA/RAR-Interaktion
Abb. 3: Zellproliferation von NRP152 und NRP154 in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Jeder Punkt entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.
Abb. 4: Abhängigkeit der Zellproliferation bei NRP152 und NRP154 von der RA-Konzentration
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.
Abb. 5: Abhängigkeit der Zellproliferation bei NRP152 und NRP154 von der Testosteron-Konzentration. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.
Abb. 6: Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der Testosteron-Konzentration
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.
Abb. 7: Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der RA-Konzentration.
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.
Abb. 8: Abhängigkeit der Zellproliferation bei PC3-Zellen von der Testosteron-Konzentration
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.
Abb. 9: Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der RA-Konzentration.
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.
Abb. 10: (A) Vergleich der Expression der Androgenrezeptor (AR)-mRNA und der RAR zwischen NRP152 und NRP154. (B) Vergleich der Expression der RARalpha- und RARgamma-mRNA zwischen NRP154 und NRP152. RARgamma up-reguliert in NRP152. RARalpha up-reguliert in NRP154
Abb. 11: Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA in NRP152 in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots (oberes Bild) und quantitative Analyse des Dosis-Effekts von Testosteron auf die Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der NRP152-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RARalpha und RARgamma (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. a: Signifikante Unterschiede verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe, P<0.05.
Abb. 12: Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA in NRP154 in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots (oberes Bild) und quantitative Analyse des Dosis-Effekts von Testosteron auf die Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der NRP152-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RARalpha und RARgamma (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. a: Signifikante Unterschiede verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe, P<0.05.
Abb. 13: Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA in LNCaP-Zellen in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots demonstrieren die Expression von RARalpha- und RARgamma-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der LNCaP-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RARalpha und RARgamma (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet.
Abb. 14: Macro- Gen-Array (Clontech) um Unterschiede der Expression verschiedener Gene zwischen NRP152 und NRP154 aufzufinden. A-E waren up-reguliert in NRP152. a-l waren up-reguliert in NRP154.
Abb. 15: Expression von Onkogenen c-myc-mRNA wird durch Androgene stimuliert. In NRP152 erfolgte keine Änderung der c-myc-mRNA-Expression nach Gabe von Testosteron. In NRP154 wurde die Expression von c-myc-mRNA durch Androgenbehandlung stimuliert. Der Effekt war 15 Minuten nach Behandlungsbeginn nachweisbar, und daurte bis 3 Stunden nach Behandlung an.
Abb. 16: RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RARalpha-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05).
Abb. 17: RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RARbeta-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05).
Abb. 18: RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RARgamma-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05).
Abb. 19: Western blots mit Proteinlysaten von NRP154 und NRP152-Zellen nach Behandlung mit RA; Monoklonaler RARalpha- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion.
Abb. 20: Western blots mit Proteinlysaten von NRP154 und NRP152-Zellen nach Behandlung mit RA; Monoklonaler RARalpha- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion. Die Bandendichte von NRP152 =100%. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.
Abb. 21: Western blots mit Proteinlysaten von LNCaP-Zellen nach Behandlung mit Testosteron (T; 0-200nM) ; Monoklonaler RARalpha- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion.
Abb. 22: Western blots mit Anti-EGF-R-Antikörper . 25µg Protein von Zellysaten
(NRP152) nach Behandlung mit Testosteron (T), RA und deren Kombination. Unbehandelte NRP152 zum Vergleich.
Abb. 23: Western blots mit anti-EGF-R-Antikörper. 25µg Protein von Zellysaten (NRP154) nach Behandlung mit Testosteron (T), RA und deren Kombination. Unbehandelte NRP154 zum Vergleich.
Abb. 24: Effekte von 0.1µM RA, 20nM Testosteron (T) und deren Kombination (RA+T) auf die Expression von EGFR-Protein. Quantitative Analyse der Bandendichten von Westernblots (Abb.19+20) mit Antikörper gegen EGF-R. Resultate sind Mittelwerte +/-SEM von vier identischen experimentellen Ansätzen. * kennzeichnet signifikante Unterschiede im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (=100% Bandendichte; p<0.05).
Abb. 25: Die Effekte von 0.1µM RA, 20nM Testosteron (T) und deren Kombination (RA+T) auf die Verfügbarkeit von EGF-R gemessen mittels Liganden-Bindungs-Assays (A) bei NRP152 und (B) bei NRP154 nach verschiedenen Zeitintervallen nach Behandlung. Jede Säule representiert den Median von vier Experimenten und ist als prozentuale Differenz von unbehandelten Kontrollen ausgedrückt. * kennzeichnet signifikante Unterschiede im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (=100% Bandendichte; p<0.05).
Abb. 26: Ligandenbindungs-Assays mit LNCaP-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen.
Abb. 27: Ligandenbindungs-Assays mit NRP152-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen.
Abb. 28: Ligandenbindungs-Assays mit NRP154-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen.
Abb. 29: Immuncytochemie von NRP154 (oben) und NRP152 (unten) mit anti-RARalpha,beta,gamma-Antikörpern (1:200; Farbdetektion mit Peroxidase -Diaminobenzaldehyd)
Abb. 30: Semiquantitative Summen-Scores von Immunhistochemischen Färbungen von NRP152 und NRP154, wie in Abb. 23 angegeben. Die durchschnittlichen Summen-Scores sind als Balkendiagramme dargestellt, die Median+/-SEM von acht Experimenten beinhalten (signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (p<0.01) sind mittels * markiert.
Abb. 31: Unterschiedliche Expression der RARmRNAs in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Prostata der Ratte (Northern blots mit 15µg Poly(a)RNA isoliert aus deventralen, dorsalen Lobulus der Ratten-Prostata oder der gesamten Ratten-Prostata. Normalisierung gegen 18S-RNA.
Abb. 32: Unterschiedliche Expression der RARmRNAs in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Prostata der Ratte (Northern blots mit 15µg Poly(a)RNA isoliert aus deventralen, dorsalen Lobulus der Ratten-Prostata oder der gesamten Ratten-Prostata. Quantifizierung des in Abb.25 dargestellten Versuchs. Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. Expression der RAR in der Gasamtprostata = 100%.
Abb. 33: Expression von RARs in der Prostata der Ratte. Immunhistochemie mit anti RARalpha. (1:200)
Abb. 34: Expression von RARs in der Prostata der Ratte. Immunhistochemie mit anti RARgamma. (1:200)
Abb. 35: Kastrationseffekt auf die Expression von RARalpha-mRNA und RARgamma-mRNA nach verschiedenen Zeitintervallen nach Kastration in der Prostata der Ratte. Northern blots mit 15 µg Poly(A)-RNA aus Ratten-Prostaten unbehandelt (Kontrolle) und nach verschiedenen Zeitintervallen nach Kastration. Normalisierung gegen 18S-RNA.
Abb. 36: Kastrationseffekt auf die Expression von RARbeta in ventraler und dorsaler Prostata der Rat.te (Immunhistochemie mit anti-RARbeta; 1:1000;)
Abb. 37: Expression von RARalphamRNA in Lobund-Wistar-Ratten nach Behandlung mit MNU + Testosteron in Abhängigkeit von der Zeit (in Wochen) nach Behandlungsbeginn.
Abb. 38: Expression von RARgammamRNA in Lobund-Wistar-Ratten nach Behandlung mit MNU + Testosteron in Abhängigkeit von der Zeit (in Wochen) nach Behandlungsbeginn.
Abb. 39: Unterschiede in der Expression von RARgamma in Prostatakarzinom (links) und BPH (rechts) in menschlicher Prostata. Immunhistochemie mit Semidünnschnitten nach Radikaler Prostatektomie wegen eines Gleason 6 Prostata-Karzinoms.
Abb. 40: Immunhistochemie mit anti-RARgamma-Antikörpern. Undifferenziertes Prostatakarzinom (Gleason >7) links im Bild ohne Nachweis von Immunreaktivität gegen RARgamma- Rechts im Bild: PIN mit heterogener Anfärbung eines Azinus.
Abb. 41: A) Hematoxilin-Eosin-Färbung eines undifferenzierten Prostatakarzinoms. B) Verlust der Immunreaktivität gegen RARgamma bei einem undifferenzierten Prostatakarzinom.
Abb. 42: Unterschiede inder Expression von RARalpha-mRNA und RARgamma-mRNA zwischen Prostata und Prostata-Karzinom . Northern blots mit 15 µg Poly(A)-RNA aus Prostata-Geweben (Human und Ratte) und den Prostata-Zellinien NRP152, NRP154 und LNCaP.

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