Richter , Frank : Interaktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen - möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms

Anhang A. THESEN

Der Effekt der Androgen-Eliminierung beim Prostatakarzinom sind seit den Kastrationsversuchen von Higgins et al. belegt. Molekularbiologische Untersuchungen am Androgenrezeptor, insbesondere die Klonierung des Androgenrezeptor-Gens durch Liao trugen zum weiteren Verständnis der Mechanismen der Androgenwirkung bei.

Retinoide sind Steroide, Derivate des Vitamin A, die ihre Wirkung durch Interaktion mit Retinoid-Rezeptoren, lokalisiert im Zellkern, entfalten. Diese Retinoid-Rezeptoren, von denen eine Reihe von Sub-Typen charakterisiert wurde, weisen erstaunliche Ähnlichkeiten mit dem Androgenrezeptor auf . Das trifft sowohl strukturell als auch funktionell , im Hinblick auf deren Funktion als Transkriptionsfaktoren, zu.

Retinoide wurden als als Therapeutikum bei verschiedenen Karzinomen in der Vergangenheit erfolgreich angewandt. Überzeugendstes Beispiel ist der Einsatz von Retinoiden als Therapeutikum bei der Promyelocyten-Leukämie, ein Malignom das nachgewiesen durch strukturelle Veränderungen an einem der Retinoid-Rezeptor-Subtypen verursacht wird.

Experimentelle Arbeiten an Zellkulturen haben einen inhibierenden Effekt von Retinoiden auf das Zellwachstum verschiedener Malignom-Zellen, insbesondere beim Prostatakarzinom, nachgewiesen.

Eigene Untersuchungen zeigten, daß der Effekt von Retinoiden auf das Zellwachstum von Prostata-Epithelzellen und Prostatakarzinomzellen keiner einfachen Kinetik folgt, sondern neben der Abhängigkeit von der Retinoid-Dosis, auch von der Zellinie, insbesondere deren Androgenrezeptor abhängt. So zeigten LNCaP-Zellen (androgenabhängig, mit Androgenrezeptormutation) Unterschiede in der Zellproliferation im Vergleich zu PC3 (androgemnunabhängig) oder NRP154 (Prostatakarzinom Ratte) und NRP152 (Prostataepithel Ratte). Die beiden letzteren Zellinien erschienen interessant, da sie einen Vergleich zwischen Karzinomzellen und benignen Eoithelzellen ermöglichen und darüber hinaus Vergleiche bei der Karzinogenese des Prostatakarzinoms im Tiermodell (Lobund-Wistar-Ratten, Pollard-Modell) ermöglichen.


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Die beobachteten Effekte der Retinoidwirkung bei verschiedenen Prostata-Zellinien (benigne und maligne) ließen Interaktionen von Retinoiden mit dem Androgenrezeptor und/ oder Androgen-Interaktion mit Retinoid-Rezeptoren vermuten.

Northern-blots mit Poly(A)RNA von verschiedenen Prostata-Zellinien (benigne und maligne) nach Behandlung mit Retinoic acid (RA) bestätigte dosisabhängige Unterschiede in der Expression der Androgenrezeptor (AR)-mRNA.

Umgekehrt verursachte die Behandlung mit Testosteron in verschiedenen Prostata-Zellinien (benigne und maligne) Unterschiede in der Expression der Retinoid-Rezeptor-mRNA für RARalpha und RARgamma.

Die Ergebnisse, die in (7) und (8) zusammengefaßt sind unterstützen somit die Hypothese einer Interaktion von Retinoiden und Androgenen mit deren Rezeptoren auf RNA-Ebene.

Western Blot Analysen wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Expression der Retinoid-Rezeptoren RARalpha and RARgamma nach Gabe von Testosteron Unterschiede auf Protein-Ebene aufweist.

Beim Vergleich von malignen und benignen Prostataepithelzellen zeigten sowohl Northern-als auch Western-Blots eine vermehrte Expression von RARalpha-mRNA, als auch RARalpha-Protein bei der Karzinomzellinie NRP154, im Gegensatz zu NRP152. Die Expression von RARgamma-mRNA und RARgamma-Protein verhielt sich genau entgegengesetzt.

Untersuchungen an humanem Prostatagewebe bestätigten Unterschiede in der Expression von RARalphamRNA und RARgammamRNA mittels RT-PCR. Western Blots mit Protein-Lysaten von humanem Prostata- und Prostata-Karzinomgewebe bestätigten die Unterschiede in der Expression von RAR alpha und RARgamma auf Protein-Ebene.

Durch immunhistochemische Untersuchungen an humanem Prostatagewebe mit Antikörpern gegen RAR alpha und RARgamma konnten deren Lokalisation und Expression nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich wiederum eine erhöhte Immunreaktivität von RARalpha beim Prostatakarzinom, im Gegensatz zu RARgamma, das bei benignem Prostataepithelium deutlich stärkere Immunreaktivität aufwies.


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Das von Pollard et al. entwickelte Tiermodell der Karzinogenese eines Prostatakarzinoms bei der Ratte, verwendet Lobund-Wistar-Ratten, die schon spontan ein Prostatakarzinom entwickeln können. Durch einmalige Gabe des Karzinogens Methyl-nitroso-Harnstoff (MNU) I.V. und kontinuierliche Gabe von Testosteron (als sunbkutane slow-release Applikation) kann die Chance der Karzinomentstehung erhöht werden. Bei unseren eigenen Untersuchungen entwickelten 90% der so behandelten Tiere nach 10 Monaten ein histologisches Prostatakarzinom.

Immunhistochemische Untersuchungen am Rattenmodell lieferten Resultate, die denen am menschlichen Prostatakarzinom entsprechen. Während RARgamma initial und in den unbehandelten Kontrollgruppen stärkere Immunreaktivität in Gewebsschnitten und Western blots zeigte, nahm die Expression von RARalpha im Verlauf der Karzinogenese zu - die Immunreaktivität von RARgamma dagegen nahm im Verlauf der Karzinogenese ab.

Androgene entfalten ihre Wirkung nach Bindung an den im Zellkern lokalisierten Androgenrezeptor als Transkriptionsfaktoren, wobei die Expression von Genen aktiviert wird, die verschiedenartige Proteine kodieren mit unterschiedlichen Funktionen innerhalb der Zelle . Ein Teil dieser Proteine ist nicht im Zellkern, sondern an der Zellmembran lokalisaiert, z.B. EGFR IGF-1R und PSMA.

Danielpour at al. zeigten Unterschiede in der Expression von TGFbeta nach Gabe von Retinoiden und vermuten, daß RA- Effekte auf das Zellwachstum durch TGFß vermittelt werden.

Unsere eigenen Untersuchungen zielten darauf ab, den Einfluß von Retinoid-Gabe auf die Expression von EGFR zu untersuchen, von dem bekannt ist, daß die Expression durch Androgene stimuliert werden kann (Traisch). Im Vergleich der Karzinomzellinie NRP154 gegenüber NRP152 zeigte sich EGFR in Western Blots stärker in der Karzinomzellinie exprimiert. Liganden-Bindungs-Assays mit Zellmembranen von NRP154 und NRP152 mit [125I]-EGF zeigten, daß die Gabe von Retinoiden in einer Konzentration von 0.1µM nicht nur die EGFR-Verfügbarkeit, sondern auch dessen Bindungsaffinität verminderte.

Liganden-Bindungs-Assays mit Zellmembranen von NRP154 und NRP152 mit [125I]-IGF1 zeigte eine Reduzierung der Rezeptorexpression, sowohl auch der Bindungsaffinität des IGF-Rezeptors.


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Zusammenfassend belegen unsere Untersuchungen, daß Retinoide einen meist wachstumshemmenden Effekt auf Prostatakarzinomzellinien verursachen, der wahrscheinlich neben Bindung an Retinoid-Rezeptoren (RARs`) durch Interaktion mit dem Androgenrezeptor (AR), vermittelt durch Hemmung verschiedener membrangebundener Zellproteine und Rezeptoren ,verursacht wird. Weiterhin konnten wir zeigen, daß sich im Verlauf der Prostata-Karzinogenese im Tiermodell, die Expression der Retinoid-Rezeptoren RARalpha und RARgamma umkehrt, was möglicherweise das verschiedene Wachstumsverhalten, als auch Unterschiede der Zellproliferation nach Gabe von Retinoiden in normalen Epithelzellen gegenüber Prostatatkarzinomzellen erklärt.


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