Richter , Frank : Interaktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen - möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms

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Kapitel 2. STAND DER FORSCHUNG

Huang et al. fanden 1997, daß die mRNA-Transkripts der Retinolsäurerezeptoren RARalpha und RARgamma vermehrt in Ratten-Prostaten vorkommen und daß die jeweiligen Gewebsspiegel dieser Transkripts durch Testosteron negativ moduliert werden. Im Gegensatz dazu fanden Huang et al. (1996) eine Dosis-abhängige Stimulation der RARalpha- und RARgamma-mRNA in hmanen LNCaP- Zellen nach Testosteronbehandlung.

Diese Daten lassen vermuten, daß RAR-gesteuerte Prozesse bei der Regulation von Zellproliferation und Differenzierung bei Prostatakarzinomzellen involviert sind und daß dabei Interaktionen zwischen Androgenen und Retinoiden nicht nur mit deren jeweiligen Rezeptoren, sondern zwischen Androgenen und RARs`, sowie Retinoiden und dem Androgenrezeptor eine Rolle spielen.

Diese Beobachtungen sind vor allem im Hinblick auf die Karzinogenese des Prostatakarzinoms interessant, da unsere hier vorgestellten Daten sowohl im Tierexperiment als auch im humanen Prostatagewebe eine Veränderung der RAR-Rezeptor-Level auf mRNA-Ebene zeigen. Die Vermutung liegt nahe, daß Mechanismen der Zellregulation, die durch RAR- und AR-Aktivierung ablaufen, im Verlauf der Karzinogenese verändert werden.

Allgemein wird angenommen, daß Androgene bei er Karzinogenese des Prostatakarzinoms beteilig sind, allerdings fehlt der Beweis eines direkt mitogenen Effekts von Androgenen auf Prostataepithelzellen. Eine Reihe von Untersuchungen lassen eher vermuten, daß Androgene Zellwachstum und Differenzierung durch Expression von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren beeinflussen (McKeehan et al., 1984; Griffiths et al., 1993). Insbesondere die Expression von Epidermal growth factor (EGF) und dessen rezeptor (EGF-R) kann durch Androgene reguliert werden (Traish and Wotiz, 1987; Schuurmans et al., 1988). Darüberhinaus wurde eine over-expression von EGF-R in BPH und beim fortgeschrittenen Prostatakarzinom beschrieben (Turkeri and Wykes, 1994). Beobachtungen von Zhang and Goldsmith (1990) weisen darauf hin, daß die Expression von EGF-R durch RA moduliert werden kann. Somit liegt die Vermutung nahe, daß EGF/EGF-R -Interaktionen Mediatorfunktion bei der Regulation von Zellproliferation und Differenzierung haben könnten und als mögliches Bindeglied bei der Signalvermittlung zwischen Androgenen und Retinoiden auf das Zellwachstum infrage kommen.


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2.1 ANDROGENREZEPTOR - MOLEKULARBIOLOGIE, FUNKTION UND KLINISCHE BEDEUTUNG

Männliche Geschlechtshormone (Androgene) sind verantwortlich für die Entwicklung der männlichen Geschlechtsorgane, das Wachstum der Körperhaare, die Vergrößerung der Stimmbänder, die Spermatogenese, das Muskelwachstum und die Ausprägung anderer sekundärer Geschlechtsmerkmale. Jedes dieser Eigenschaften wird durch die gewebsspezifische Wechselwirkung von Androgenen mit dem im Zellkern von Targetzeellen lokalisierten Androgenrezeptor (AR) vermittelt, wodurch die Aktivierung oder Inhibierung von spezifischen Genen vermittelt wird (Kallio et al., 1996). Dabei ist relativ wenig über die Mechanismen durch die diese Gen-Aktivierung oder Supprimierung erfolgt bekannt. Anscheinend ist einer der ersten Schritte eine Interaktion zwischen dem Androgen-Androgenrezeptor-Komplex (A-AR) mit spezifischen DNA-Sequenzen in den Target-Zellen, den sogenannten Androgen-Resoponsive-Elements (AREs`). Diese AREs enthalten Basensequenzen, die auch bei den Glucocorticoid-Responsive-Elements (GREs`) und bei der Retinoic-Acid-Responsive Elements (RAREs`) gefunden werden (Kallio et al, 1996; Chambon 1995; Mangelsdorf et al.1993).Diese Homologie der DNA-Sequenzen scheint bei der Aktivierung aller Steroid-Rezeptor-Hormon-Komplexen (Androgene, Glukortikoide, Retinoide) eine Rolle zu spielen.

Das Androgenrezeptor (AR)-Gen besteht aus 8 Exons von ~80kb Länge lokalisiert auf dem Chromosom Xq11-12 (Kallio et al.,1996). Zwei mRNAs (11 und 7.5kb) werden von dem AR-Gen transkribiert. Mehr als 200 Mutationen des AR-Gens wurden bisher beschrieben. Damit ist der AR der am meisten mutierte Transkriptionsfaktor, der bisher bakannt ist (Kallio et al; 1992). Dabei sind die meisten Mutationen Punktmutationen, die die Liganden-Bindung mit Androgenen beeinflussen.

Das AR-Protein ist polymorph aufgrund einer repetitiven Sequenz (CAG-repeat) am N-Terminal. Die Bedeutung dieses Längen-Polymorphismus ist unklar. Klinische Bedeutung scheint dieser Polymorphismus beim Kennedy-Syndrom, einer seltenen progressiven Motorneuron- Erkrankung zu haben, bei dem die Länge der CAG-Sequenzen direkt mit dem Schweregrad der Erkrankung korreliert (LaSpada et al., 1992).

Neben dem Kennedy-Syndrom ist das Androgen Insensitivity Syndrome (AIS) mit Veränderungen am Androgenrezeptor verbunden, wobei hier bei einer Reihe von


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Patienten keine Mutationen des AR-Gens nachgewiesen werden konnten (Quigley et al. 1995). Hinsichtlich der klinischen Relevanz des AR sind das Prostatakarzinom und das Mammakarzinom bedeutsam.

In mindestens zwei Publikationen (Wooster et al., 1992; Lobaccaro et al, 1993) wurden AR-Genmutationen im Mammakarzinom des Mannes beschrieben.

Die Progression des Prostatakarzinoms ist ein multifaktorieller Prozeß, bei dem eine Vielzahl genetischer Alterationen von Onkogenen, Tumor Supressor Genen und auch des AR-Gens beschrieben wurde. Die ersten Publikationen über AR-Genmutationen beim Prostatakarzinom stamen von Klocker et al. (1994). Offenbar scheint ein Zusammenhang zwischen der Progression des Prostatakarzinoms und der Inzidenz von AR-Rezeptormutationen zu bestehen, da AR-Mutationen wesentlich häufiger beim metastasierenden als beim primären Prostatakarzinom gefunden wurden (Taplin et al.; und Visakorpi et al. 1995).

2.2 RETINOIDREZEPTOREN UND RETINOIDE

Vitamin A ist eine essenzielle Komponente unserer Nahrung. Es ist seit langem bekannt, daß Retinoide (Derivate des Vitamin A) wesentlich sind für normales Wachstum, Sehkraft, Reproduktion und Regeneration einer Vielzahl von Geweben (Sporn et al. 1984; Wolbach and Howe, 1925). Andererseits ist bekannt, daß Vitamin A-Mangel ausgedehnte Metaplasien von Plattenzellepithelien im Respirationstrakt, Gastrointestinaltrakt, im Urintrakt und im Auge verursacht (Wolbach and Howe 1925; Underwood 1984). Darüberhinaus belegen Daten den Einfluß von Vitamin A auf die Embryogenese (Wilson et al. 1953). Eine komplette Eliminierung von Vitamin A verursacht im Tiermodell (VAD-Ratten) eine Vielzahl von kongenitalen Malformationen des Auges, des Aortenbogens, des Herzens, der Lunge und unter anderem die Agenesie von Prostata und Samenblase (Wilson et al. 1953). Ein exzessives Angebot von mütterlichem RA in der Embryogenese hat einen teratogenen Effekt (Kessel 1992). Die lokale Anwendung von Retinoiden auf die Organogenese der Extremitäten in Vertabraten und die Extremitäten-Regeneration als Folge einer lokalen Gabe von Retinoiden bei Amphibien belegen die Rolle von Retinoiden als Morphogene (Tabin, 1991).
Retinoide verursachen biologische Effekte durch Bindung mit Retinoidrezeptoren (Giguere et al., 1987; Petkovich et al., 1987). Es wird angenommen , daß mindestens


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zwei Gruppen von Retinoidrezeptoren existieren (Chambon,1995). Retinoidrezeptoren gehören zu den Liganden-induzierbaren Transkriptionsfaktoren , zu denen auch Steroidhormon-Rezeptoren, Thyroidhormonrezeptoren und der Vitamin-D3-rezeptor gehören (Leid et al. 1992). Die Retinoidrezeptoren RARalphabetagamma werden sowohl durch all-trans-RA als auch 9-cis-RA aktivirert, wohingegen die Rezeptoren der RXR-Gruppe nur durch 9-cis-RA aktiviert wird (Leid et al., 1992; Mangelsdorf et al., 1992). Der Vergleich der Aminosäuresequenzen der verschiedenen RARs und RXRs weisen einen hohen Grad an Homologie auf (Abb.1) (Chambon, 1995).
Der Mechanismus der RA/RAR- Interaktion ist schematisch in Abb.2 dargestellt. Es wird angenommen, daß sich der jeweilige RAR nach Bindung des Liganden (RA) an die Ligandenbindungsstelle, an spezifische DNA-Sequenzen (Retinoid Acid Responsive Elements =RAREs) anlagert und dadurch die Aktivierung von Target Genen verursacht (Chambon, 1995). Diese Target Gene kodieren Proteine, die für Zell-Proliferation und Differenzierung verantwortlich sind (Abb.2) (Chambon, 1995).

Abb. 1: Struktur der Retinoid-Rezeptoren RARalpha,beta,gamma


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Abb. 2: SchematisierterMechanismus der RA/RAR-Interaktion

2.3 ZELLKULTURMODELLE BEIM PROSTATAKARZINOM

Eine Vielzahl von Prostatakarzinomzellinien ist derzeit in Laborversuchen im Einsatz. Dabei deutet die Zahl der verwendeten Zellinien auf die Tatsache hin, daß keine einzelne Zellinie alle Eigenschaften menschlicher Prostatakarzinomzellen hinreichend wiederspiegeln. Neben der Eliminierung des Einflusses von Stroma-Epithel-Interaktionen, die beim menschlichen Prostatakarzinom eine Rolle spielen und auf die im Zellkulturmodell verzichtet werden muß, sind es vor allem Unterschiede hinsichtlich der Expression des Androgenrezeptores, die Unterschiede in der Zellbiologie verursachen. Dabei weisen die von uns verwendeten und eine Reihe anderer Zellinien aufgrund von Mutationen des Androgenrezeptors Unterschiede hinsichtlich der Androgenabhängigkeit auf. Dabei werden Zellen unterschieden, die zum Wachstum Androgene benötigen (androgenabhängig), von solchen, die zur Proliferation zwar keine Androgene benötigen, jedoch durch Androgene im Wachstum stimulierbar sind (wie z.B. LNCaP-Zellen).


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Eine dritte Gruppe von Prostatakarzinomzellen, zu denen PC3-Zellen gehören, sind im Wachstum komplett androgenunabhängig. Das bedeutet, daß diese Zellen zur Proliferation weder Androgene benötigen, noch durch diese stimuliert werden können.

Dabei sind die Unterschiede zwischen Prostatakarzinomzellinien mit unterschiedlicher Androgenabhängigkeit nich absolut. Interessante Arbeiten von Leland Cheung haben gezeigt, daß sich LNCaP-Zellen durch Subklonierung in eine aggressive Karzinom-Zellinie, C2-4, transformieren lassen, die im Nacktmausmodell in der Lage ist, Knochenmetastasen zu verursachen (Cheung et al., 1997).
Die von uns in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zellmodelle sind die folgenden:

LNCaP: Humane Epithelzellinie aus einer supraklavikulären Lymphknotenmetastase eines Patienten mit hormonresistentem, undifferenzierten metastasierendem Prostatakarzinom (Lymph Node of Carcinoma of the Prostate), entwickelt 1981 durch Horoszewicz et al. (Cancer Research, 1983) in Roswell Park Memorial Institute. Die Zellinie hat einen mutierten Androgenrezeptor und ist im Wachstum durch Androgene stimulierbar. LNCaP- Zellen exprimieren PSA, PAP und das Prostata-Spezifische Membran Antigen (PSMA). Der mutierte Androgen-Rezeptor in LNCaP-Zellen führt biologisch zu einer Stimulierung des Zellwachstums durch das Anti-Androgen Hydroxyflutamid.

PC3: Prostatakarzinomzellinie mit aggressivem Wachstumsverhalten im Nacktmaus-Modell. Der Androgenrezepror ist mutiert. Die Zellinie ist komplett androgen-unabhängig hinsichtlich der Proliferation.

NRP152 : Prostataepithelzellinie, entwickelt von Prostaten aus Lobund-Wistar-Ratten. Keine Karzinomzellinie (Danielpour et al,1994). Die Proliferation der Prostata-Epithelzellen in Zellkultur wird durch die Zugabe verschiedener Wachstumsfaktoren (Hydrocortison, EGF, Cholera-Toxin) in das Zellmedium ermöglicht.

NRP154: Prostatakarzinomzellinie, entwickelt von Prostaten aus Lobund-Wistar-Ratten nach Induktion eines Prostatakarzinoms durch Gabe von Methyl-Nitrosoharnstoff (NMU) in die Schwanzvene, gefolgt von chronischer Gabe von Depot-Testosteron als S.C.Kapsel (Danielpour, et al.,1994).


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Die menschlichen Prostatakarzinomzellinien LNCaP und PC3 wurden wegen ihrer unterschiedlichen Androgenabhängigkeit verwendet.

Die Prostata-Epithel-Zellinien NRP154 und NRP152, die aus Ratten-Prostaten gewonnen wurden erlauben einen direkten Vergleich der Retinoid/ Androgenwirkung auf normales und karzinomatös verändertes Prostata-Epithel und weiterhin eine Korrelation zu dem von uns verwendeten Tiermodell (Lobund-Wistar-Ratten).

2.4 TIERMODELLE DES PROSTATAKARZINOMS UND DEREN LIMITIERUNGEN

Die Karzinogenese des Prostatakarzinoms wird allgemein als “multi-step“ Prozeß angesehen, der offenbar mit einer Progression von einer niedrig-gradigen Histologie über das latente Karzinom, bishin zum höher-gradigen metastasierenden Karzinom einhergeht. Es ist schwierig, einzelne Stadien dieser Progression zu untersuchen, doch erlauben einige Tiermodelle Aufschluß auf Teilprozesse der Karzinogenese des Prostatakarzinoms (Bosland, 1992). Die Anforderungen, die ein solches Karzinogenese-Modell erfüllen muß, um valide Schlußfolgerungen auf die Karzinogenese des humanen Prostatakarzinoms zuzulassen sind die folgenden:

Die Induktion einer Karzinogenese im Rattenmodell durch einmalige Gabe eines chemischen Karzinogens erzielt nur eine geringe Inzidenz (5-25%) von Prostatakarzinomen in den so behandelten Tieren (Pollard, 1973; Bosland, 1992). Gleichermaßen wird durch chronische Gabe von Androgenen nur eine geringe Prostatakarzinom-Inzidenz erzielt. Die Kombination eines chemischen Karzinogens, wie Methyl-Nitroso-Harnstoff (MNU) mit der chronischen Gabe von Testosteron erzielt jedoch


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Prostatakarzinome im Rattenmodell, deren Inzidenz bei 75-85% liegt (Pollard et al., 1991). Dabei wirkt Testosteron offenbar als Promoter.

Obwohl das Pollard-Modell in seiner Validität kritisiert wurde, haben immunhistochemische Untersuchungen belegt, daß die histologischen Veränderungen, die durch MNU und Depot-Testosteron in Lobund-Wistar-Ratten hervorgerufen wurden, in der Tat Prostata-Epithelzellen betreffen (Pugh et al., 1994).

Alle durch MNU oder Dimethyl-4-Aminobiphenyl (DMAB) induzierten Prostatakarzinome sind Adenokarzinome, die meist vom dorsolateralen und anterioren Lobus, aber nicht vom ventralen Lubus der Rattenprostaten ausgehen. Dabei ist zu berücksichtigen, daß die Rattenprostata aus vier gepaarten Lappen besteht, die im Unterschied zur menschlichen Prostata nicht zu einem Organ zusammengefügt sind (Price, 1963).

Drei dieser Lappen - der dorsale, laterale und anteriore - weisen homologe Strukturen in der humanen Prostata auf. Der ventrale Lappen der Ratten-Prostata scheint kein menschliches Äquivalent zu haben (Price, 1963). Prostatakarzinome, die in Rattenprostaten erzeugt werden zeigen einige wesentliche Übereinstimmungen mit menschlichen Prostatakarzinomen, wie z.B. die Androgenabhängigkeit. Dennoch scheint Skelett-Metastasierung spezifisch für das menschliche Prostatakarzinom zu sein.

2.5 THERAPEUTISCHER EINSATZ VON RETINOIDEN BEI MALIGNEN TUMOREN

Retinoide, aufgrund ihrer biologischen Funktion als Morphogene, wurde experimentell bei Amphibien eingesetzt, wobei hierbei eine Regeneration der Extremitätenentwicklung erzielt werden konnte (Tabin et al, 1991). In Züchtungsversuchen mit weiblichen Ratten, die mit Vitamin-A-Mangeldiät ernährt wurden (VAD- Ratten), wiesen die neugeborenen Ratten eine Vielzahl angeborener Mißbildungen auf. Unter anderem waren die Augen, der Urogenitaltrakt (mit Agenesie der Samenblasen und Prostata), der Aortenbogen, Herz und Lunge betroffen (Wald, 1968). Die meisten dieser Mißbildungen konnte durch Gabe von RA verhindert oder revertiert werden (Wilson et al., 1953; Van Pelt and de Roij, 1991).


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Diese Untersuchungen veranlaßten den Einsatz von Retinoid-Derivaten (N-(4-Hydroxyphenyl)retinamid = 4-HPR) im Tierversuch als mögliches Therapeutikum bei der Karzinigenese des Prostatakarzinoms (Pollard et al., 1991). Dabei konnten die Untersucher eine deutliche Reduzierung der Inzidenz von experimentell induzierten Prostatakarzinomen (von 88% auf 21%) nach Gabe des Retinoid-derivats während der Karzinogenese beobachten. Interessant war hierbei, daß mit der Gabe der 4-HPR-Diät relativ spät, 7 Monate nach Beginn der MNU/ Testosteron-Behandlung begonnen wurde. Die Autoren schlußfolgerten, daß der biologische Effekt des 4-HPR gegen die durch Testosteron hervorgerufene Promotion des Tumors zustande kommt.

Weiere Untersuchungen wurden mit dem Retinoid-Analog Fenretimid im Tiermodell durchgeführt (Pienta et al., 1993). Dabei wurde Fenretimid verwendet, um die Toxizität von RA zu vermeiden.

Diese Daten veranlaßten eine Reihe von klinischen Studien mit dem Ziel des Einsatzes von Retinoiden bei der Prävention des Prostatakarzinoms. Leider hat keine dieser klinischen Studien bisher Aufschluß über den Vorteil einer Retinoid-Gabe zur Karzinom-Prävention geliefert (Sporn et al., 1976; Reichmann et al., 1990; Lippmann et al., 1994).

Aufgrund der langen Latenzzeit bei der Karzinogenese des Prostatakarzinoms und der Vielfalt von Faktoren, die auf diese einwirken können, sind Ergebnisse in dieser Richtung auch in der näheren Zukunft nicht zu erwarten (Karp et al., 1996).

Ein überzeugendes Beispiel, wie Molekularbiologie direkten Einfluß auf Therapiekonzepte nehmen kann, wird am Beispiel der Akuten Promyelocyten-Leukämie, einer spezifischen Form der Akuten Myeloiden Leukämie, deutlich. Die Erkrankung geht mit einer spezifischen t(15;17)-Translokation der Blasten einher, die das PML-Gen am Chromosom 15, an das Gen des RARalpha am Chromosom 17 fusioniert. Die Erkrankung ist biologisch durch eine Koagulopathie gekennzeichnet, die aufgrund von DIC und Fibrinolyse entsteht (Chomienne et al., 1996). Die Entdeckung, daß durch Gabe von all-trans-RA die Differenzierung unreifer Blasten in reifere Formen möglich ist, hat das therapeutische Herangehen bei dieser Erkrankung grundlegend verändert. Dieser Ansatz läßt auch bei anderen malignen Tumoren auf die Effizienz einer Differenzierungs-Therapie hoffen.


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