Richter , Frank : Interaktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen - möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms

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Kapitel 4. ERGEBNISSE

4.1 Bestimmung der Zellproliferation

A) NRP154 und NRP152-Zellen

Abb. 3 zeigt die Wachstumskurve von NRP-152 und NRP-154 in DMEM-Medium mit 10%FCS. Die Anzahl der NRP-152 und NRP-154-Zellen nahm im Zeitraum von 5-6 Tagen stetig zu, ohne daß das Zellmedium gewechselt werden mußte. In diesem Zeitraum nahm die Anzahl der NRP-152-Zellen auf das 15fache des Ausganswertes zu, die Anzahl der NRP154-Zellen nahm im gleichen Zeitraum auf das 60fache des Ausgangswertes zu (p<0.001). Danach nahm die Anzahl der NRP-152-Zellen weiterhin zu, währenddessen die Anzahl der NRP-154-Zellen abnahm.

Abb. 3: Zellproliferation von NRP152 und NRP154 in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Jeder Punkt entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.

Behandlung von NRP-152-Zellen mit RA in DMEM-Medium (mit 10%cFCS) für 4 Tage resultierte in einer dosisabhängigen Zunahme der Zellzahl, mit einem maximalen proliferativen Effekt bei einer RA-Konzentration von 0.1µM (p<0.01; Abb.2A). Dabei nahm die Zellproliferation im angegebenen Zeitraum nach Behandlung mit 0.1µM RA auf das fast 5fache des Ausgangswertes (unbehandelte Zellen zum Vergleich) an.


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Behandlung von NRP-154-Zellen mit RA resultierte demgegenüber nicht in einer signifikanten Zunahme der Zellzahl (p<0.01; Abb. 4).

Abb. 4: Abhängigkeit der Zellproliferation bei NRP152 und NRP154 von der RA-Konzentration
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.

Abb. 5: Abhängigkeit der Zellproliferation bei NRP152 und NRP154 von der Testosteron-Konzentration. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.


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Unter den oben beschriebenen Kulturbedingungen verusachte Behandlung mit Testosteron (T) bei beiden Zellinien (NRP-152 und NRP-154) eine dosisabhängige Stimulation der Zellproliferation (p<0.01; Abb. 5). Dabei erhöthe sich die Zahl der NRP-152- Zellen im Dosis-Bereich von 0 - 0.2µM T um mehr als das 8fache des Ausgangswertes (T=0, unbehandelte Zellen zum Vergleich).
Die Proliferation der NRP-154-Zellen erhöthe sich nur um das 2.5fache im Vergleich zu unbehandelten NRP-154-Zellen (p<0.01).

LNCaP-Zellen

Bein LNCaP-Zellen verursachte eine Testosteronbehandlung eine dosisabhängige Stimulation der Zellproliferation (p<0.01; Abb. 6). Dabei erhöthe sich die Zahl der LNCaP- Zellen im Dosis-Bereich von 0 - 0.2µM T um mehr als das 3fache des Ausgangswertes (T=0, Unbehandelte Zellen im Vergleich). Behandlung von LNCaP-Zellen mit RA verursachte eine Dosis-abhängige Stimulation der Zellproliferation bis zu einer RA-Konzentration von 0.1µM (Abb. 7). Hierbei nahm die Zellzahl auf das 4fache des Ausgangswertes zu (unbehandelte Zellen im Vergleich).

Abb. 6: Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der Testosteron-Konzentration
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.


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Abb. 7: Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der RA-Konzentration.
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.

C) PC3- Zellen

Bei PC3- Zellen, die mit Testosteron (0 - 20nM) behandelt wurden, ließen sich erwartungsgemäß im Wachstum nicht beeinflussen (Abb. 8).
Ebenso ließ sich die Zellproliferationsrate von PC3-Zellen durch Gabe von RA (0- 10µM) nicht beeinflussen (Abb. 9).

Abb. 8: Abhängigkeit der Zellproliferation bei PC3-Zellen von der Testosteron-Konzentration
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.


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Abb. 9: Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der RA-Konzentration.
Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.

4.2 AR-mRNA und RAR-mRNA- Expression

Northern Blots mit isolierter Poly (A)RNA von den Zellinien NRP152 und NRP154 konnten die 9.4kb - Bande der Androgenrezeptor (AR)mRNA nachweisen. Beide Zellinien wurden in DMEM mit 10%FCS kultiviert. Die Bandendichte der ARmRNA war 5fach höher in NRP152, im Vergleich zu NRP154 bei gleicher Menge an Poly(A)RNA (25µg von beiden Zellinien) (Abb. 10A). Abb. 10B zeigt, die Bandendichte der 3.4 und 2.7kb RARalphamRNA ist 2.5 fach höher in NRP-154-Zellen bei gleicher Menge an Poly(A)RNA (25µg von beiden Zellinien; n=3; p<0.05). Die Bandendichte der 3.4 kb RARgammamRNA war demgegenüber 25% niedriger in NRP154-Zellen, im Vergleich zu NRP-152.


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Abb. 10: (A) Vergleich der Expression der Androgenrezeptor (AR)-mRNA und der RAR zwischen NRP152 und NRP154. (B) Vergleich der Expression der RARalpha- und RARgamma-mRNA zwischen NRP154 und NRP152. RARgamma up-reguliert in NRP152. RARalpha up-reguliert in NRP154

Behandlung von NRP-152-Zellen mit T für 6 Stunden resultierte in einer biphasischen, dosisabhängigen Reduzierung der RARalpha-mRNA und der RARgamma-mRNA, mit der niedrigsten RARmRNA-Expression bei 0.002-0.02 µM Testosteron (T) (p< 0.01; Abb.11).
Im Gegensatz dazu, zeigte die Dosis-Wirkungs-Kurve der Testosteronbehandlung auf die Expression von RARalpha-mRNA und RARgamma-mRNA bei NRP154 einen genau entgegengesetzten Verlauf, m einem Anstieg der Expression von RARalpha-mRNA und RARgamma-mRNA bis zum Maximum bei einer Testosteron-Konzenttion von 0.01 µM(Abb. 11).


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Abb. 11: Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA in NRP152 in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots (oberes Bild) und quantitative Analyse des Dosis-Effekts von Testosteron auf die Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der NRP152-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RARalpha und RARgamma (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. a: Signifikante Unterschiede verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe, P<0.05.


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Abb. 12: Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA in NRP154 in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots (oberes Bild) und quantitative Analyse des Dosis-Effekts von Testosteron auf die Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der NRP152-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RARalpha und RARgamma (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. a: Signifikante Unterschiede verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe, P<0.05.


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Die Expression von RARalpha-mRNA in LNCaP-Zellen war durch Testosteron bis zu einer Konzentration von 20nM Up-regulierbar. Die Expression von RARgamma-mRNA wurde durch Testosteron im Dosisbereich von 0-20µM down-reguliert (Abb. 13).

Abb. 13: Expression von RARalpha und RARgamma-mRNA in LNCaP-Zellen in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots demonstrieren die Expression von RARalpha- und RARgamma-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der LNCaP-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RARalpha und RARgamma (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet.


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4.3 Gen-Arrays zur Identifizierung unterschiedlicher Genexpression zwischen NRP152 und NRP154

Abb. 14: Macro- Gen-Array (Clontech) um Unterschiede der Expression verschiedener Gene zwischen NRP152 und NRP154 aufzufinden. A-E waren up-reguliert in NRP152. a-l waren up-reguliert in NRP154.

Gene a - r sind up-reguliert in NRP154 Zellen
a: Calcium/ calmodulin-dependent protein kinase type IV, b: cell adhesion kinase beta (CAKbdta), c: Rab-4a ras-related prtein, d: MRK; serine/threonine kinase, e: Leptin precursor, f: PKR; double-stranded RNA-activated elF-2a kinase, g: Beta arrestin 1, h: GABA-B receptor 1a and 1b, I: T-lymphocyte maturation-associated protein, j: Glycerol kinase; glycerokinase; k: Syntaxin binding protein, l: Cytochrome P-450 4F5, m: 67kDa glutamic acid decarboxylase, n: glutamic acid decarboxylase, o: aldehydroganse 2, p: opioid receptor-like orphan receptor, q: somatostatin receptor 1, r: calcitonin receptor precursor

Gene A - E are up-reguliert in NRP152 Zellen
A: cytochrome P450VII; cholesterol 7-alpha-hydroxylase, B: glucose transporter type 1, C: testis frutose-6-phosphate 2-kinase; fructose-2,6-biphsphatase, D: Cak tyrosine-protein kinase, E: Urokinase receptor + GPI-anchored form urokinase plasminogen activator surface receptor Hose keeping -Gene (HKG)

HKP 1: myosin, HKG 2: beta actin, HKG 3: GAPDH, HKG 4: phospholipase A2 precursor, HKG 5: polyubiquitin


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4.4 Einfluß der Androgenbehandlung auf Expression von Onkogenen - Unterschiede zwischen NRP152/NRP154

Northern Blot-Hybridisierung mit c-myc-cDNA unter Verwendung von Poly(A)-RNA, die von NRP-152 und NRP-154 nach Testosteronbehandlung mit 20nM T nach unterschiedlichen Zeitintervallen nach Behandlungsbeginn isoliert wurde ergab, daß sich die Expression von c-myc-mRNA in NRP-152 durch Testosteronbehandlung nicht veränderte. Dabei waren weder bei der Dosis-Wirkungs-Kurve im Dosierungsintervall von 0 - 200nM T (nicht dargestellt), noch im zeitlichen Verlauf (20nM T) statistisch signifikante Änderungen der c-myc-mRNA-Expression nachweisbar (Abb. 15).

Demgegenüber war die Expression der c-myc-mRNA in NRP154-Zellen durch Testosteron stimulierbar. Dabei wurde in der Dosis-Wirkungs-Kurve (nicht dargestellt), die maximale c-myc-mRNA-Expression bei 20 nM T nachgewiesen. Im zeitlichen Verlauf war die Stimulierung durch Testosteron 15 Minuten nach Behandlung erkennbar, und bis 180 Minuten nach Behandlungsbeginn nachweisbar (Abb. 15).

Abb. 15: Expression von Onkogenen c-myc-mRNA wird durch Androgene stimuliert. In NRP152 erfolgte keine Änderung der c-myc-mRNA-Expression nach Gabe von Testosteron. In NRP154 wurde die Expression von c-myc-mRNA durch Androgenbehandlung stimuliert. Der Effekt war 15 Minuten nach Behandlungsbeginn nachweisbar, und daurte bis 3 Stunden nach Behandlung an.

Die Tatsache, daß Prostatakarzinomzellen durch Androgene zur Expression von Onkogenen veranlaßt werden können, erklärt möglicherweise die klinisch nachweisbare Stimulierbarkeit des Prostatakarzinoms durch Testosteron. Diese Daten sind andererseits Hinweis darauf, daß unser Zellmodell wesentliche Eigenschaften von klinischen Prostatakarzinomen widerspiegelt.


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4.5 RT-PCR von menschlichem Prostatageweben (Benigne versus Karzinom) mit RAR-Primern

RARalpha: Ein Vergleich der Bandendichten der 547bp-RT-PCR-Produkte von RNA aus humanem Prostatagewebe nach Gelelektrophorese (2% Agarose) unter Verwendung der in Tab. 2 angegebenen Primer, zeigte signifikante Unterschiede für die Expression der RARalphamRNA-Transkripts im Vergleich zwischen benignen (25 Proben) und malinen Prostatagewebe (25 Proben). Die mittlere Bandendichte bei den Prostatakarzinomen war 46.6 +/- 10.3% gegenüber 13.4+/- 5.8% bei benignen Prostatageweben (Abb.13; p<0.01). Von den 25 benignen Gewebsproben zeigten 15 keine Expression von RARalphamRNA. Die klinische Charakterisierung der verwendeten Gewebe hinsichtlich Tumor-Stadium, Gleason-Score und präoperativem PSA ist in Tab. 1 angegeben. Keiner der Patienten hatte Behandlung mit Antiandrogenen oder LHRH-Agonisten.

RARbeta: Ein Vergleich der mittleren Bandendichten der 327bp-RT-PCR-Produkte unter Verwendung der in Tab. 2 angegebenen Primer zeigte mit 25.2+/-8.9% (25 benigne) gegenüber 20.3+/-5.5% (25 maligne) keine signifikanten Unterschiede (Abbb.14 ; p<0.01).

RARgamma: Ein Vergleich der mittleren Bandenintensitäten der 514bp-RT-PCR-Produkte nach 2% Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung der in Tab.2 angegebenen Primer zeigte mit 78.5+/- 3.5% (25 benigne) gegenüber 10.9+/-4.6% (25 maligne) signifikante Unterschiede (Abb. 15 ; p<0.01). Von den 25 malignen Gewebsproben zeigten 15 keine Expression von RARgammamRNA.


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Abb. 16: RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RARalpha-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05).


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Abb. 17: RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RARbeta-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05).


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Abb. 18: RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RARgamma-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05).


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4.6 Western Blots mit Antikörpern gegen RARalpha , RAR ß, RARgamma, EGFR

Western blots wurden mit Zellysaten von behandelten (RA, T oder deren Kombination) und unbehandelten NRP154 und NRP152 durchgeführt. Dabei war die eingesetzte Proteinmenge pro Lane jeweils 50µg. Als Antikörper wurde ein monoklonaler anti-RARalpha (Geschenk von Prof. P. Chambon, Strassbourg, France) in einer Verdünnung von 1:200 verwendet (Abb. 19).

Abb. 19: Western blots mit Proteinlysaten von NRP154 und NRP152-Zellen nach Behandlung mit RA; Monoklonaler RARalpha- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion.

NRP154 zeigte im Vergleich zu NRP152 eine deutlich höhere Expression von RARalpha mit einer etwa doppelten Bandendichte von NRP154 gegenüber NRP152 (Proteinlysate unbehandelter Zellen ;NRP152: NRP154 = 1:2.1). Bei NRP152 wurde die Expression von RARalpha durch RA inhibiert, wobei der maximale Effekt bei einer RA-Konzentration von 0.1µM gefunden wurde, bei der fast kein RARalpha nachweisbar war.

Im Gegensatz dazu zeigte sich, daß bei NRP154 troz der insgesamt höheren Expression von RARalpha, ein inhibierender Effekt von RA hinsichtlich der RARalpha-Expression zwar auftrat, aber deutlich geringer ausgeprägt als bei NRP152 (Abb. 20).


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Abb. 20: Western blots mit Proteinlysaten von NRP154 und NRP152-Zellen nach Behandlung mit RA; Monoklonaler RARalpha- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion. Die Bandendichte von NRP152 =100%. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten.

Western blots mit Anti-RARalpha wurden mit Proteinlysaten von LNCaP-Zellen durchgeführt. Der Effekt einer Testosteronbehandlung (4 Stunden in RPMI-Medium supplementiert mit 10% charcol-strippen FBS) ist in Abbildung 21 dargestellt. Behandlung mit Testosteron (1-200 nM) führte zu einer Stimulierung der RARalpha-Expression, wobei der naximale Effekt bei Behandlung mit 20nM Testosteron nachweisbar war.


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Abb. 21: Western blots mit Proteinlysaten von LNCaP-Zellen nach Behandlung mit Testosteron (T; 0-200nM) ; Monoklonaler RARalpha- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion.

B) EGF-R

Behandlung von NRP-152-Zellen mit 0.1µM RA für 24 Stunden verurursachte eine Reduzierung der 170kDa-Bandendichte des EGF-R-Proteins auf 40% des Ausgangswertes (p< 0.05;Abb.19). Andererseits verursachte Behandlung mit 0.02µM Testosteron (T) einen Anstieg der 170kDa-Bandendichte des EGF-R-Proteins auf 130% des Ausgangswertes (p<0.05). Deser Effekt wurde durch simultane Gabe von 0.1µM RA eliminert (Abb. 22)


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Abb. 22: Western blots mit Anti-EGF-R-Antikörper . 25µg Protein von Zellysaten
(NRP152) nach Behandlung mit Testosteron (T), RA und deren Kombination. Unbehandelte NRP152 zum Vergleich.

Bei NRP-154-Zellen war die 170kDa-Bandendichte des EGF-R-Proteins nach Behandlung mit 0.1µM RA für 24 Stunden ebenfalls reduziert, aber nur auf 60% des Ausgangswertes (p<0.05;Abb.20). Behandlung von NRP-154-Zellen mit Testosteron (T) oder RA+T verursachten keine Veränderung der Bandenintensität der 170kDa- EGF-R-Bande (p<0.05; Abb.22,23)

Abb. 23: Western blots mit anti-EGF-R-Antikörper. 25µg Protein von Zellysaten (NRP154) nach Behandlung mit Testosteron (T), RA und deren Kombination. Unbehandelte NRP154 zum Vergleich.


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Abb. 24: Effekte von 0.1µM RA, 20nM Testosteron (T) und deren Kombination (RA+T) auf die Expression von EGFR-Protein. Quantitative Analyse der Bandendichten von Westernblots (Abb.19+20) mit Antikörper gegen EGF-R. Resultate sind Mittelwerte +/-SEM von vier identischen experimentellen Ansätzen. * kennzeichnet signifikante Unterschiede im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (=100% Bandendichte; p<0.05).

4.7 Liganden-Bindungs-Assays mit [125I]-EGF und [125I]-IGF1

Behandlung von NRP-152-Zellen mit 0.1µM RA für 4 - 48 Stunden verursachte eine kontinuierliche Reduzierung der EGF-R-Verfügbarkeit im Liganden-Bindungs-Assay (Abb. 22) für 48Stunden-Behandlung; p<0.05). Andererseits verursachte die Behandlung mit 0.02µM Testosteron (T) eine 50-75%ige Zunahme der Ligandenbindung. Dieser Effekt wurde duch simltane Gabe von 0.1µM RA verhindert.

Behandlung von NRP-154-Zellen mit 0.1 µM RA resultierte in einer Abnahme der EGF-R-Verfügbarkeit innerhalb von 24 Stunden (p<0.05), die Bindung von [125I]-EGF kehrte bei 48Stunden Behandlung zum Ausgangswert zurück (Abb.19). Während die Verfügbarkeit von EGF-R in NRP-154-Zellen ebenfalls durch Testosteron stimulert wurde (bis zu 8 Stunden; p<0.05), war dieser Effekt bei 24 stündiger Behandlung nicht mehr nachweisbar - ebensowenig war der Antagonistische Effekt der RA-Behandlung, der bei NRP-152-Zellen gefunden wurde, erkennbar (Abb. 25).


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Abb. 25: Die Effekte von 0.1µM RA, 20nM Testosteron (T) und deren Kombination (RA+T) auf die Verfügbarkeit von EGF-R gemessen mittels Liganden-Bindungs-Assays (A) bei NRP152 und (B) bei NRP154 nach verschiedenen Zeitintervallen nach Behandlung. Jede Säule representiert den Median von vier Experimenten und ist als prozentuale Differenz von unbehandelten Kontrollen ausgedrückt. * kennzeichnet signifikante Unterschiede im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (=100% Bandendichte; p<0.05).

LigandenBindungs-Assays mit [125I]-IGF1 zeigten einen analogen Verlauf wie bei Bindung von [125I]-EGF für NRP154-Zellen und NRP152-Zellen.

Behandlung von NRP-152-Zellen mit 0.1µM RA für 4 - 48 Stunden verursachte eine kontinuierliche Reduzierung der IGF-R-Verfügbarkeit im Liganden-Bindungs-Assay für 48Stunden-Behandlung; p<0.05). Andererseits verursachte die Behandlung mit 0.02µM Testosteron (T) eine 50-75%ige Zunahme der Ligandenbindung. Dieser Effekt wurde duch simltane Gabe von 0.1µM RA verhindert.


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Behandlung von NRP-154-Zellen mit 0.1 µM RA resultierte in einer Abnahme der IGF-R-Verfügbarkeit innerhalb von 24 Stunden (p<0.05), die Bindung von [125I]-IGF1 kehrte bei 48Stunden Behandlung zum Ausgangswert zurück. Während die Verfügbarkeit von IGF-R in NRP-154-Zellen ebenfalls durch Testosteron stimulert wurde (bis zu 8 Stunden; p<0.05), war dieser Effekt bei 24 stündiger Behandlung nicht mehr nachweisbar - ebensowenig war der Antagonistische Effekt der RA-Behandlung, der bei NRP-152-Zellen gefunden wurde,nachweisbar.

Abb. 26: Ligandenbindungs-Assays mit LNCaP-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen.


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Abb. 27: Ligandenbindungs-Assays mit NRP152-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen.

Abb. 28: Ligandenbindungs-Assays mit NRP154-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen.


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4.8 Immunhistochemie mit Antikörpern gegen RARalpha, RAR ß, RARgamma

4.8.1 Zellinien

Immunhstochemische Untersuchungen mit Antikörpern gegen RARalpha,gamma (human) ergaben Kreuzreaktivität mit den Zellinien NRP152/NRP154 (Ratte). Dabei war die Immunreaktivität gegen RARalpha bei NRP154, LNCaP und PC3 stark positiv. Die Immunreaktivität gegen RARgamma war bei NRP152 deutlich intensiver als bei NRP154 (Abb. 23). Eine semiquantitative Morphometrie wurde durchgeführt, wobei Peroxidase-positiv gefärbte Zellen (positive Zellkern-Anfärbung) ausgezählt und die Intensität der Färbung mittels eines einfachen Scores (0=keine Anfärbung; 1=schwach positiv in <10% der Zellen; 2= moderat positiv in >10% der Zellen; 3= stark positiv in >10% der Zellen) bestimmt wurde (Abb. 29). Bei allen Versuchen wurden parallel negative Kontrollen durchgeführt, bei denen anstelle des primären Antikörpers Serum verwendet wurde. Als Positivkontrollen wurden Gewebsschnitte von Rattentestis mit vorher bestimmter positiver Immunreaktivität verwendet.


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Abb. 29: Immuncytochemie von NRP154 (oben) und NRP152 (unten) mit anti-RARalpha,beta,gamma-Antikörpern (1:200; Farbdetektion mit Peroxidase -Diaminobenzaldehyd)


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Abb. 30: Semiquantitative Summen-Scores von Immunhistochemischen Färbungen von NRP152 und NRP154, wie in Abb. 23 angegeben. Die durchschnittlichen Summen-Scores sind als Balkendiagramme dargestellt, die Median+/-SEM von acht Experimenten beinhalten (signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (p<0.01) sind mittels * markiert.

Wie Abb 30 zeigt, ist die Expression von RAR alpha in NRP-154 signifikant höher als in NRP152 -Zellen. Die Expression von RARgamma ist demgegenüber signifikant höher in NRP152 , als in NRP154-Zellen. Die Expression von RARbeta wies keinen Unterschied zwischen NRP152 und NRP154 auf.


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4.8.2 Immunhistochemie mit Rattenprostaten

4.8.2.1 Unterschiede in der Expression der RARalpha, RARbeta, RARgamma in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Rattenprostata

Um Unterschiede in der Expression der RARalpha,beta,gamma-mRNAs in Abhängigkeit von der Lokalisation des untersuchten Gewebes (ventrale und dorsale Ratten-Prostaten) wurde Poly(A)-RNA aus den dorsalen und ventralen Lappen von Rattenprostaten seperat isoliert. Zum Vergleich wurde Poly(A)-RNA aus der gesamten Rattenprostata isoliert. Northern Blot-Hybridisierung mit den RAR-cDNAs` wurde wie oben angegeben durchgeführt.

Abb. 31: Unterschiedliche Expression der RARmRNAs in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Prostata der Ratte (Northern blots mit 15µg Poly(a)RNA isoliert aus deventralen, dorsalen Lobulus der Ratten-Prostata oder der gesamten Ratten-Prostata. Normalisierung gegen 18S-RNA.


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Abb. 32: Unterschiedliche Expression der RARmRNAs in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Prostata der Ratte (Northern blots mit 15µg Poly(a)RNA isoliert aus deventralen, dorsalen Lobulus der Ratten-Prostata oder der gesamten Ratten-Prostata. Quantifizierung des in Abb.25 dargestellten Versuchs. Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. Expression der RAR in der Gasamtprostata = 100%.


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Abb. 33: Expression von RARs in der Prostata der Ratte. Immunhistochemie mit anti RARalpha. (1:200)


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Abb. 34: Expression von RARs in der Prostata der Ratte. Immunhistochemie mit anti RARgamma. (1:200)


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4.8.2.2 Einfluß von Kastration auf die Expression der RARalpha, RARbeta, RARgamma im Rattenmodell

Um den bereits in Zellkultur-Experimenten nachgewiesenen Effekt der Interaktion von Androgenen mit den RARs zu simulieren, wurden Kastrationsversuche mit Ratten durchgeführt. Dabei dienten unbehandelte Tiere als Kontrollgruppe. Bei den kastrierten Tieren wurden nach 12 Stunden, 1,2,3 und 6 Tagen die Prostaten (Gesamt-Prostata) entfernt und das Gewebe zur Gewinnung von Poly(A)RNA für Norther-Blot Hybridisierungen mit RAR-cDNAs verwendet. Dabei zeigte sich, daß sowohl die Expression von RARalpha-mRNA, als auch die Expression von RARgamma-mRNA nach Kastration bis zu einem Zeitraum von 6 Tagen zunimmt (Abb.35). Die subkutane Gabe von Depot-Testosteron nach Kastration beweist, daß Testosteronmangel für die vermehrte Expression der RARalpha- und RARgamma-mRNA verantwortlich ist, da Testosteron-Supplementierung die Expression der RAR-mRNAs` auf den Level von unkastrierten Tieren zurücksetzt (Abb.35)


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Abb. 35: Kastrationseffekt auf die Expression von RARalpha-mRNA und RARgamma-mRNA nach verschiedenen Zeitintervallen nach Kastration in der Prostata der Ratte. Northern blots mit 15 µg Poly(A)-RNA aus Ratten-Prostaten unbehandelt (Kontrolle) und nach verschiedenen Zeitintervallen nach Kastration. Normalisierung gegen 18S-RNA.


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Abb. 36: Kastrationseffekt auf die Expression von RARbeta in ventraler und dorsaler Prostata der Rat.te (Immunhistochemie mit anti-RARbeta; 1:1000;)


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4.8.2.3 Einfluß einer chemisch induzierten Karzinogenese auf die Expression der RARalpha, RARbeta, RARgamma im Rattenmodell

Nach Induktion einer Karzinogenese mittels IV-Injektion von Methyl-Notrosoharnstoff (MNU) in die Schwanzvene von Lobund-Wistar-Ratten, gefolgt von subkutaner Gabe von Testosteronkapseln (1cm), wiesen 90% der so behandelten Tiere histologische Veränderungen im Sinne eines Prostatakarzinoms auf. Unbehandelte Tiere wurden als Kontrollgruppe verwendet. Die Prostaten der behandelten (und unbehandelten Tiere zur Kontrolle) wurden nach 0,3,6,12,24 und 40 Wochen nach Behandlungsbeginn entfernt. Das Prostatagewebe, welches nicht für Gewebsschnitte verwendet wurde, wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und für die Isolierung von Gesamt-RNA verwendet. RT-PCR mit den oben angegebenen Primern diente der Untersuchung der Expression der RAR-mRNAs im zeitlichen Verlauf der Karzinogenese im Rattenmodell.

Abb. 37: Expression von RARalphamRNA in Lobund-Wistar-Ratten nach Behandlung mit MNU + Testosteron in Abhängigkeit von der Zeit (in Wochen) nach Behandlungsbeginn.

Die Expression von RAR alpha-mRNA wurde im Verlaufe der Karzinogenese (Vergleich t=0 mit t=40 Wochen) auf das durchschnittlich 10fache des Ausgangswertes erhöht (6 behandelte Tiere pro Gruppe - 4 unbehandelte Kontrolltiere pro Gruppe zum Vergleich).


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Abb. 38: Expression von RARgammamRNA in Lobund-Wistar-Ratten nach Behandlung mit MNU + Testosteron in Abhängigkeit von der Zeit (in Wochen) nach Behandlungsbeginn.

Die Expression von RAR gamma-mRNA, ausgedrückt in der Bandendichte nach RT-PCR, wurde im Verlaufe der Karzinogenese (Vergleich t=0 mit t=40 Wochen) auf durchschnittlich 1% (1/100 des Ausgangswertes) gesenkt (6 behandelte Tiere pro Gruppe - 4 unbehandelte Kontrolltiere pro Gruppe zum Vergleich).

Im vergleich zu den oben angegebenen RAR alpha- und RARgamma -mRNA, änderte sich die Expression von RARbeta-mRNA im Verlauf der Karzinogenese im Lobund-Wistar-Rattenmodell, ausgedrückt in der Bandendichte nach RT-PCR, nicht signifikant.


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4.8.3 Immunhistochemie - Gewebsschnitte mit humaner Prostata

Abb. 39: Unterschiede in der Expression von RARgamma in Prostatakarzinom (links) und BPH (rechts) in menschlicher Prostata. Immunhistochemie mit Semidünnschnitten nach Radikaler Prostatektomie wegen eines Gleason 6 Prostata-Karzinoms.

Immunhistochemische Färbungen wurden verwendet, um die Lokalisation der RAR- Expression in archiviertem, formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten menschlichem Prostatagewebe nachzuweisen. Die Anfärbbarkeit der Prostata-Schnitte wurde mit einem semi-quantitativen Score ausgewertet. Dabei wurde die Immunreaktivitä wie folgt beurtelt: 0=negativ; 1=schwach positiv in <10% der Epithelzellenellen; 2=moderat positiv in 10% der Epithelzellen; 3=stark positiv in >10% der Epithelzellen eines Azinus. Insgesamt wurden jeweils 8 Gewebsschnitte von 12 undifferenzierten Adenokarzinomen (Gleason >6) , jeweils 8 Gewebsschnitte von 12 hoch differenzierten Adenokarzinomen (Gleason <7) und jeweils 4 Schnitte von 12 normalen Prostaten untersucht.


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Im Drüsenepithel von histologisch normalem Prostata-Gewebsschnitten, war RARgamma-Immunreaktivität im Zytoplasma in homogener Verteilung nachweisbar (Abb.38). Die RARgamma- Immunreaktivität war 2+ in über 90% der untersuchten Azini und 3+ in den übrigen Azini (<10%). Während der Gasamt-Score für die RARgamma- Immunreaktivität in Adenokarzinomen mit Gleason-Grading <6 vergleichbar war mit normalem Prostatagewebe, variierte die Farbintensität zwischen Epithelzellenn innerhalb der Azini. Die in normalem Prostatagewebe beobachtete homogene Anfärbbarkeit der Endothelzellen innerhalb eines Azinus weicht einer Heterogenität hinsichtlich der Immunreaktivität. Diese Befunde wurden in Adenokarzinomen mit Gleason-Grading <7 und in PIN gesehen (Abb.39). In Adenokarzinomen mit Gleason Grading >7 (undifferenzierte Karzinome), war nur noch eine schwache oder keine Immunreaktivität gegen RARgamma nachweisbar (Abb.40).

Abb. 40: Immunhistochemie mit anti-RARgamma-Antikörpern. Undifferenziertes Prostatakarzinom (Gleason >7) links im Bild ohne Nachweis von Immunreaktivität gegen RARgamma- Rechts im Bild: PIN mit heterogener Anfärbung eines Azinus.


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Abb. 41: A) Hematoxilin-Eosin-Färbung eines undifferenzierten Prostatakarzinoms. B) Verlust der Immunreaktivität gegen RARgamma bei einem undifferenzierten Prostatakarzinom.

Tab. 3: Grad der Immunreaktivität (semi-quantitativ) und Anzahl immunpositiver Zellen pro Azinus. Vergleich von Gewebsschnitten aus menschlichem Prostatagewebe zwischen benigner Prostata (Normal); PIN, hochdifferenzierten (Gleason <7) Prostatakarzinomen (LGPCa) und undifferenzierten (Gleason >6) Prostatakarzinomen (HGPCa). Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen mit p<0.05.

RARalpha

Immunreaktivität [0-3]

0.4

1.71

2.42

2.83

 

Anteil immunpositiver Zellen pro Azinus [%]

74.6%

25.4%

75.1%

82.7%

 

 

 

P<0.05

P<0.05

P<0.05

 

 

Normal

PIN

LGPCa

HGPCa

RARbeta

Immunreaktivität [0-3]

1.52

0.7

1.9

1.97

 

Anteil immunpositiver Zellen pro Azinus [%]

55%

32%

46.5%

69.7%

 

 

 

P<0.05

N.S.

N.S.

RARgamma

Immunreaktivität [0-3]

2.62

2.29

0.26

0.08

 

Anteil immunpositiver Zellen pro Azinus [%]

72.2%

33.2%

73.5%

92.5%


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4.9 Vergleich der Expression von RARalpha, RARbeta, RARgamma-mRNA in verschiedenen Geweben und Zellinien

Eine Reihe von Experimenten lassen den Schluß zu, daß eine vermehrte Expression von RARalpha vorwiegend in Prostatakarzinomzellen, in Lobund-Wistar-Ratten nach Induktion einer Karzinogenese mittels Nitrosaminen und Androgenen, sowie in menschlichem Prostatakarzinomgewebe vorkommt.
Demgegenüber gibt es eine Reihe von Hinweisen darauf, daß eine vermehrte Expression von RARgamma vorwiegend in benignen Epithelzellinien von Rattenprostaten (NRP152), in Gewebsschnitten von Rattenprostaten, sowie in Gewebsschnitten von normalem humanen Prostatagewebe vorkommt.Die in Abb. 41dargestellten Northern-Blots stellen eine Zusammenfassung verschieder untersuchter Gewebe und Zellinien hinsichtlich der Expression von RARalpha,gamma-mRNAs dar.

Abb. 42: Unterschiede inder Expression von RARalpha-mRNA und RARgamma-mRNA zwischen Prostata und Prostata-Karzinom . Northern blots mit 15 µg Poly(A)-RNA aus Prostata-Geweben (Human und Ratte) und den Prostata-Zellinien NRP152, NRP154 und LNCaP.


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