Richter , Frank : Interaktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen - möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms

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Kapitel 5. DISKUSSION

Für den Kliniker ist das Problem der Androgenresistenz beim Prostatakarzinom bislang ungelöst. Während Prostatakarzinome, die mit den derzeit etablierten Staging-Verfahren als “lokalisiert“ bezeichnet werden, einer Behandlung durch Radikale Prostatektomie oder Betsrahlung (Brachytherapie oder External Beam oder deren Kombination) mit kurativer Intention zugänglich sind, ist das metastasierende Prostatakarzinom nur palliativ angehbar. Die first-line Therapie beinhaltet Androgen-Eliminierung, entweder durch Bilaterale Orchiektomie oder mittels Gabe von GnRH-Agonisten +/- Anti-Androgenen. Dabei ist der Nachweis einer besseren Wirksamkeit einer kompletten Androgenblockade (CAB) gegenüber einer Therapie mit GnRH-Agonisten allein, trotz über 27 prospektiven, randomisierten Studien, nur unzureichend belegt.

Scher et al. haben beobachtet, daß Patienten, die steigende Serum- PSA-Werte unter CAB aufwiesen, nach Absetzen des Anti-Androgens (Flutamid) auf die Therapie mit PSA-Senkung ansprachen. Der Effekt, bekannt als andogen-withdrawal, kann daduch erklärt werden, daß es im Verlauf der CAB nicht nur zur Selektion von Androgen-resistenten Zellklons, sondern möglicherweise auch zu Mutationen des Androgenrezeptors in Prostatakarzinomzellen kommt. Diese Mutationen könnten die biologische Wirkung des Anti-Androgens (Flutamid) verändern, so daß aus einem Androgen-Inhibitor ein Androgen-Stimulator wird.

Die Anti-Androgen-Behandlung von metastasierenden Prostatakarzinomen mit führt in fast allen Fällen im Zeitraum von 18 bis 36 Monaten zur Androgenresistenz. Damit sind die therapeutischen Optionen weiter eingeschränkt, da chemotherapeutische Ansätze bislang nur unzureichende Wirksamkeit gezeigt haben.

Für uns war die Frage der Androgenrezeptorwirkung interessant, insbesondere die Untersuchung von molekularbiologischen Mechanismen , die einen Einfluß auf die Androgen-Androgenrezeptor-Interaktion haben könnten. Dabei konzentrierten wir uns auf Retinoide und deren Rezeptoren (RARs`), da diese strukturell und funktionell dem Androgenrezeptor und dessen Liganden ähnlich sind. Retinoide haben sich als wirksame Therapie bei der Promyelozytenleukämie erwiesen (Huang et al.) und sind funktionell wirksam als Stimulatoren von Epithelzelldifferenzierung und Zellproliferation (). Retinoide


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und deren Rezeproren haben in Zellkulturen, wie frühere Arbeiten aus unserem Labor zeigten, Wechselwirkungen mit dem Androgenrezeptor und dessen Liganden (Huang et al., 1997). So konnte die Expression des Androgenrezeptors in Zellkulturen durch Gabe von RA modifiziert werden (Huang et al., 1997; Richter et al., 1999), andererseits wurde die Expression der RARs`alphabetagamma durch Gabe von Testosteron moduliert. Dabei zeigen verschiedene Zelllinien mit unterschiedlicher Stimulierbarkeit durch Androgene auch Unterschiede hinsichtlich des Effekts von RA. So sind die androgenabhängigen LNCaP-Zellen durch

Testosteron stimulierbar und reagieren nach Gabe von Androgenen mit einer Erhöhung der Zellproliferation. Gabe von Retinoiden resultierte ebenfalls in einer Zunahme der Zellproliferation, bis zu einer RA-Konzentration von 0.1µM.

Androgenunabhängige Zellen, wie PC3, sind weder durch Testosteron, noch durch Retinoide stimulierbar. Interessanterweise haben erste Versuche, PC3-Zellen mit RAREs` zu transfizieren, biologisch zu einer Stimulierbarkeit durch Androgene und RA geführt (Huang et al., unveröffentlicht). Damit könnten RARs als Target für gentherapeutische Ansätze beim Prostatakarzinom genutzt werden. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Untersuchungen konzentrierte sich auf Prostata-Epithelzellen (NRP152) und Prostatakarzinomzellen (NRP154) von Ratten-Prostaten. Diese Zellinien, die von Danielpour et al () etabliert wurden, erlaubten einen Vergleich von Prostata-Epithelien mit karzinomatös veränderten Prostata-Epithelium im Ratten-Modell (Danielpour et al., 1996). Darüberhinaus ließen sich Vergleiche mit dem von uns verwendeten Tiermodell (Ratte) bei Kastrationsversuchen, hinsichtlich der Lokalisation von RARs` in Gewebsschnitten und der Einfluß einer experimentell induzierten Karzinogenese (Pollard-Modell) auf die Expression von RARs` anstellen. Gen-Arrays erlaubten Aufschluß auf die Unterschiede in der Gen-Expression zwischen NRP152 und NRP154 und dienten zur weiteren Charakterisierung der beiden Zellinien. Dabei stellte sich heraus, daß nicht nur unterschiedliche Gene im Vergleich zwischen NRP152 und NRP154 exprimiert wurden, sondern sich die beiden Zellinien auch völlig unterschiedlich hinsichtli ch der Stimulierbarkeit mit Testosteron verhielten. Besonders bemerkenswert war die 10fach höhere expression von Interferon-alpha in NRP154 nach Stimulation mit Testosteron im Vergleich mit NRP152.

NRP154 und NRP152 wiesen unterschiedliches Wachstumsverhalten nach Gabe von RA


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auf, wobei die Proliferationsrate von NRP152 nach Gabe von RA bis zu einer Konzentration von 0.1µM bis auf das fast 5fache des Ausgangswertes anstieg. Demgegenüber blieb die Proliferationsrate von NRP154-Zellen, trotz einer initial höheren Proliferationsrate, nach Gabe von RA im Vergleich zu NRP152 fast unverändert. LNCaP-Zellen zeigten einen 4fachen Anstieg der Zellproliferation nach Gabe von RA bis zu einer RA-Konzentration von 0.1µM. PC3-Zellen waren durch Gabe von RA in ihrem Wachstumsverhalten nicht beeinflußbar.

Androgenbehandlung zeigte sowohl bei NRP152 als auch bei NRP154 einen stimulierenden Effekt auf die Zellproliferationsrate, wobei diese bei NRP152 auf das 8fache des Ausgangswertes, bei NRP154 nur auf das doppelte des Ausgangswertes anstieg. LNCaP-Zellen waren bekanntermaßen ebenfalls durch Testosteron stimulierbar, wobei im angegebenen Konzentrationsbereich ein Anstieg der Zellproliferationsrate auf das 3fache des Ausgangswertes zu beobachten war. PC3 ließen sich, als androgenunabhängige Prostatakarzinomzellen, nicht durch Testosteron im Wachstum beeinflussen. Interessanterweise beobachteten Huang et al. in Experimenten, bei denen PC3 dauerhaft mit Sequenzen von Retinoid Acid Responsive Elements (RAREs`) transfiziert wurden, eine Inhibierung der Zellproliferation bei diesen transfizierten PC3-Zellklons nach Gabe von RA (unveröffentlicht).

Um mögliche Mechanismen aufzuklären, die für die Unterschiede der Zellproliferation nach Behandlung mit Retinoiden und Androgenen bei den verschiedenen Zelllinien verantwortlich sind, führten wir Northern-Blots mit cDNAs gegen RARalphabetagamma, sowie den Androgenrezeptor (AR) durch. Dabei stellte sich heraus, daß RARalpha-mRNA vermehrt in NRP154 exprimiert wird, während RARgamma-mRNA vermehrt in NRP152 exprimiert wird. Auch die Expression der AR-mRNA zeigte Unterschiede zwischen NRP154 und NRP152. Wir fanden außerdem nach Behandlung von Testosteron im Sinne eines Dose-Response-Experiments Unterschiede in der Expression von RARalpha-mRNA und RARgamma-mRNA bei den Zellinien NRP154 und NRP152 in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Die Tatsache, daß die Expression von Retinoidrezeptor-RNA durch Androgene beeinflußt werden kann, wurde schon von Huang et al. 1997 in Prostata , Samenblasen und Nieren von Ratten in Kastrationsversuchen gezeigt. Auf Zellkulturebene konnten wir diesen Effekt der Modulation der RAR-RNAs duch Androgene hiermit auch bei LNCaP-Zellen, sowie NRP154 und NRP152 nachweisen. Ein weiterer Bestandteil unserer Untersuchungen, war der Nachweis einer möglichen Stimulation von Proto-Onkogenen und Rezeptoren von


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Wachstumsfaktoren, wie sie schon bei LNCaP-Zellen beschrieben wurde ( Traisch et al. 1987). Wir konzentrierten uns dabei auf c-myc als Onkogen, und konnten mittels Northern Blot Hybridisierung bei NRP154, nicht aber bei NRP152, eine Stimulation der Expression von c-myc-mRNA durch Testosteronbehandlung nachweisen. Die kanzerogene Zellinie NRP154 zeigte dabei eine Stimulation der Expression von c-myc-mRNA, wie wir durch Dosis-Wirkungs-Versuche nach Behandlung mit Testosteron unterschiedlicher Konzentration (0 - 200 nM) durch Northern Blot Hybridisierung nachweisen konnten.

Dabei war im zeitlichen Verlauf die Stimulation der c-myc-RNA-Expression schon 15 Minuten nach Androgenbehandlung vorhanden, und war bis zu 3 Stunden nach Behandlung nachweisbar.

Weiterhin konnten wir mittels Western-Blots und Liganden-Bindungs-Assays nachweisen, daß die Expression von EGF-Rezeptor-Protein in NRP154 und NRP152 durch Behandlung mit RA und/ oder Testosteron modulierbar ist. Dabei zeigen beide Zellinien wiederum Unterschiede in der Expression des EGF-R in Abhängigkeit von Androgen und/ oder Retinoid-Behandlung. Wir vermuten, daß das Gen, das EGF-R-Protein kodiert zu den “down-stream“ Genen gehört, die durch Interaktion, sowohl von RA/ RAR, als auch Androgenen mit dem Androgenrezeptor reguliert werden. Beoachtungen über die Modulierung der EGF-R-Expression in Mambranfraktionen aus Prostatagewebe wurden bereits von Traisch et al. (1987 publiziert. In Liganden-Bindungs-Assays konnte nachgewiesen werden, daß nicht nur die Verfügbarkeit des EGF-Rezeptor-Proteins, sondern auch dessen Affinität zu EGF durch Androgene und Retinoide beeinflußt werden kann. Dabei wirken Retinoide inhibierend auf die biologische Verfügbarkeit, als auch die Bindungsaffinität gegen EGF, während Androgene stimulierend wirken. Beide Effekte, sowohl der Androgene als auch der Retoinoide, wirkten sich auf die beiden Zellinien NRP154 und NRP152 graduell unterschiedlich aus.

Ein ähnlicher Mechanismus könnte bei der Regulierung der IGF-R-Expression durch RA und/ oder Testosteron eine Rolle spielen, wie unsere Liganden-Bindungsassays mit Zellmembranepräparationen von NRP154, NRP152 und LNCaP-Zellen vermuten lassen.

Da die Prostatakarzinomzellinien NRP152 und NRP154 aus Rattenprostaten bevor und nach Induktion einer Karzinogenese durch Gabe von Methyl-Nitrisoharnstoff IV in die Schwanzvene gefolgt von einer subkutanen Implantation einer Depot-Testosteron-Kapsel


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(Pollard et al.), waren wir daran interessiert, die Expression der RARs` während der Karzinogenese im Ratten-Modell (Lobund-Wistar-Ratten) zu verfolgen. Als Detektion der Expression der RAR-mRNAs wurde RT-PCR mit von Cunha et al. angegebenen Primern für RARalphabetagamma verwendet, da aufgrund der zur Verfügung stehenden geringen Mengen an Prostatagewebe eine Northern-Blot-Hybridisierung nicht infrage kam. Dabei zeigte sich mittels RT-PCR, daß im Verlauf der experimentell über einen Zeitraum von 10 Monaten induzierten Karzinogenese, bei der etwa 90% der Tiere ein histologische Veränderungen im Sinne eines Prostatakarzinoms im H/E-gefärbten Gewebsschnitt aufwiesen, die Expression von RARalpha-mRNA zunahm die Expression der RARgamma-mRNA jedoch abnahm. Dies steht in Übereinstimmung mit unseren Northern Blot Hybridisierungen mit den Zellinien NRP152 und NRP154. Im Gewebsschnitt ließen sich ebenfalls die Zunahme der Expression von RARalpha und die Abnahme der Expression von RARgamma im Verlauf der Karzinogenese durch jeweilige Zu- oder Abnahme der nukleären Färbung mittels Meerrettichperoxidase-Reaktion bei der Immunhistochemie mit Antikörpern gegen RARalpha und RARgamma semiquantitativ nachweisen. Weierhin lassen die Ergebnisse unserer immunhistochemischen Untersuchungen erkennen, daß tatsächlich nur Zellkerne von karzinomatös veränderten Zellen verstärkte Immunreaktivität gegen den anti- RARalpha-Antikörpe aufwiesen, wobei die unveränderten Zellen verstärkte Immunreaktivität gegen den verwendeten anti-RARgamma-Antikörper zeigte.

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