| Richter , Frank : Interaktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen - möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms |
Zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med. habil.
(doctor medicinae habilitatus)
vorgelegt von
Präsident: Prof. Dr. rer. nat J.Mlynek
Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen
Eingereicht im September 2001
2
3
90
94
96
| Seiten: | [2] [3] [4] [5] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] |
Inhaltsverzeichnis | |
| Titelseite | Interaktion von Retinolsäurerezeptoren und Androgenrezeptor bei Androgen- und Retinoid- Stimulation von Prostatazellen und Prostatakarzinomzellen - möglicher Ansatz zur Therapie des Prostatakarzinoms |
| Abkürzungsverzeichnis | VERZEICHNIS DER IN DER ARBEIT VERWENDETEN ABKÜRZUNGEN |
| 1 | EINLEITUNG UND AUFGABENSTELLUNG |
| 2 | STAND DER FORSCHUNG |
| 2.1 | ANDROGENREZEPTOR - MOLEKULARBIOLOGIE, FUNKTION UND KLINISCHE BEDEUTUNG |
| 2.2 | RETINOIDREZEPTOREN UND RETINOIDE |
| 2.3 | ZELLKULTURMODELLE BEIM PROSTATAKARZINOM |
| 2.4 | TIERMODELLE DES PROSTATAKARZINOMS UND DEREN LIMITIERUNGEN |
| 2.5 | THERAPEUTISCHER EINSATZ VON RETINOIDEN BEI MALIGNEN TUMOREN |
| 3 | MATERIALIEN UND METHODEN |
| 3.1 | VERWENDETE ZELLINIEN UND DEREN CHARAKTERISIERUNG |
| 3.2 | TIERMODELL NACH POLLARD (LOBUND-WISTAR-RATTE) |
| 3.3 | GEWINNUNG VON HUMANEM PROSTATAGEWEBE-GEWEBEAUFBEREITUNG |
| 3.4 | BESTIMMUNG DER ZELLPROLIFERATION |
| 3.5 | NORTHERN BLOTS MIT cDNA GEGEN ARmRNA uns RARmRNA |
| 3.6 | ANALYSE DER GEN-EXPRESSION MIT GEN-ARRAYS (NRP152 und NRP154 ) |
| 3.7 | RT-PCR MIT RAR , , - PRIMERN |
| 3.8 | WESTERN BLOTS MIT ANTIK_RPERN GEGEN RAR,RAR, RAR, und EGFR |
| 3.9 | LIGANDEN-BINDUNGS-ASSAYS MIT [125I]-EGF und [125I]-IGF1 |
| 3.9.1 | Zellmembran- Präparation |
| 3.9.2 | Liganden-Bindungs-Assays |
| 3.10 | IMMUNHISTOCHEMIE MIT ANTIK_RPERN GEGEN RAR, RARß, RAR und EGFR |
| 3.11 | DATENANALYSE UND STATISTISCHE AUSWERTUNG |
| 4 | ERGEBNISSE |
| 4.1 | Bestimmung der Zellproliferation |
| 4.2 | AR-mRNA und RAR-mRNA- Expression |
| 4.3 | Gen-Arrays zur Identifizierung unterschiedlicher Genexpression zwischen NRP152 und NRP154 |
| 4.4 | Einfluß der Androgenbehandlung auf Expression von Onkogenen - Unterschiede zwischen NRP152/NRP154 |
| 4.5 | RT-PCR von menschlichem Prostatageweben (Benigne versus Karzinom) mit RAR-Primern |
| 4.6 | Western Blots mit Antikörpern gegen RAR , RAR ß, RAR, EGFR |
| 4.7 | Liganden-Bindungs-Assays mit [125I]-EGF und [125I]-IGF1 |
| 4.8 | Immunhistochemie mit Antikörpern gegen RAR, RAR ß, RAR |
| 4.8.1 | Zellinien |
| 4.8.2 | Immunhistochemie mit Rattenprostaten |
| 4.8.2.1 | Unterschiede in der Expression der RAR, RAR, RAR in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Rattenprostata |
| 4.8.2.2 | Einfluß von Kastration auf die Expression der RAR, RAR, RAR im Rattenmodell |
| 4.8.2.3 | Einfluß einer chemisch induzierten Karzinogenese auf die Expression der RAR, RAR, RAR im Rattenmodell |
| 4.8.3 | Immunhistochemie - Gewebsschnitte mit humaner Prostata |
| 4.9 | Vergleich der Expression von RAR, RAR, RAR-mRNA in verschiedenen Geweben und Zellinien |
| 5 | DISKUSSION |
| Bibliographie | LITERATURVERZEICHNIS |
| Anhang A | THESEN |
| Danksagung | |
| Selbständigkeitserklärung | |
Tabellenverzeichnis | |
| Tab. 1: | Primer für RT-PCR ( Sequenzen, Loci und Basenpaarlänge der PCR-Produkte) (nach Tanji et al. 1996) |
| Tab. 2: | Patienten und Tumordaten |
| Tab. 3: | Grad der Immunreaktivität (semi-quantitativ) und Anzahl immunpositiver Zellen pro Azinus. Vergleich von Gewebsschnitten aus menschlichem Prostatagewebe zwischen benigner Prostata (Normal); PIN, hochdifferenzierten (Gleason <7) Prostatakarzinomen (LGPCa) und undifferenzierten (Gleason >6) Prostatakarzinomen (HGPCa). Statistische Unterschiede zwischen den Gruppen mit p<0.05. |
Abbildungsverzeichnis | |
| Abb. 1: | Struktur der Retinoid-Rezeptoren RAR,, |
| Abb. 2: | SchematisierterMechanismus der RA/RAR-Interaktion |
| Abb. 3: | Zellproliferation von NRP152 und NRP154 in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Jeder Punkt entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. |
| Abb. 4: | Abhängigkeit der Zellproliferation bei NRP152 und NRP154 von der RA-Konzentration Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. |
| Abb. 5: | Abhängigkeit der Zellproliferation bei NRP152 und NRP154 von der Testosteron-Konzentration. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. |
| Abb. 6: | Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der Testosteron-Konzentration Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. |
| Abb. 7: | Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der RA-Konzentration. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. |
| Abb. 8: | Abhängigkeit der Zellproliferation bei PC3-Zellen von der Testosteron-Konzentration Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. |
| Abb. 9: | Abhängigkeit der Zellproliferation bei LNCaP-Zellen von der RA-Konzentration. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. |
| Abb. 10: | (A) Vergleich der Expression der Androgenrezeptor (AR)-mRNA und der RAR zwischen NRP152 und NRP154. (B) Vergleich der Expression der RAR- und RAR-mRNA zwischen NRP154 und NRP152. RAR up-reguliert in NRP152. RAR up-reguliert in NRP154 |
| Abb. 11: | Expression von RAR und RAR-mRNA in NRP152 in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots (oberes Bild) und quantitative Analyse des Dosis-Effekts von Testosteron auf die Expression von RAR und RAR-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der NRP152-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RAR und RAR (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. a: Signifikante Unterschiede verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe, P<0.05. |
| Abb. 12: | Expression von RAR und RAR-mRNA in NRP154 in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots (oberes Bild) und quantitative Analyse des Dosis-Effekts von Testosteron auf die Expression von RAR und RAR-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der NRP152-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RAR und RAR (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. a: Signifikante Unterschiede verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe, P<0.05. |
| Abb. 13: | Expression von RAR und RAR-mRNA in LNCaP-Zellen in Abhängigkeit von der Testosteron-Konzentration. Repräsentative Northern-Blots demonstrieren die Expression von RAR- und RAR-mRNA nach 6 Stunden Behandlung. Jede Bande wurde durch Hybridisierung von 15 µg Poly(A)-RNA isoliert von der LNCaP-Zellsuspension gewonnen. Detektion durch [53P]-markierte cDNA für RAR und RAR (Prof.P.Chambon, Strassbourg). Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes (unbehandelte Proben =100%) berechnet. |
| Abb. 14: | Macro- Gen-Array (Clontech) um Unterschiede der Expression verschiedener Gene zwischen NRP152 und NRP154 aufzufinden. A-E waren up-reguliert in NRP152. a-l waren up-reguliert in NRP154. |
| Abb. 15: | Expression von Onkogenen c-myc-mRNA wird durch Androgene stimuliert. In NRP152 erfolgte keine Änderung der c-myc-mRNA-Expression nach Gabe von Testosteron. In NRP154 wurde die Expression von c-myc-mRNA durch Androgenbehandlung stimuliert. Der Effekt war 15 Minuten nach Behandlungsbeginn nachweisbar, und daurte bis 3 Stunden nach Behandlung an. |
| Abb. 16: | RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RAR-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05). |
| Abb. 17: | RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RAR-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05). |
| Abb. 18: | RT-PCR mit RNA von humanem Prostatagewebe. Vergleich der Expression von RAR-RNA zwischen benignem [n=25] und malignem [n=25] Prostatagewebe. Primer und RT-PCR-Produkte wie in Tab. 1 angegeben Signifikante Unterschiede zwischen Karzinom und und benigner Prostata (n<0.05). |
| Abb. 19: | Western blots mit Proteinlysaten von NRP154 und NRP152-Zellen nach Behandlung mit RA; Monoklonaler RAR- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion. |
| Abb. 20: | Western blots mit Proteinlysaten von NRP154 und NRP152-Zellen nach Behandlung mit RA; Monoklonaler RAR- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion. Die Bandendichte von NRP152 =100%. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. |
| Abb. 21: | Western blots mit Proteinlysaten von LNCaP-Zellen nach Behandlung mit Testosteron (T; 0-200nM) ; Monoklonaler RAR- Antikörper 1:200. ECL-Signal-Detektion. |
| Abb. 22: | Western blots mit Anti-EGF-R-Antikörper . 25µg Protein von Zellysaten (NRP152) nach Behandlung mit Testosteron (T), RA und deren Kombination. Unbehandelte NRP152 zum Vergleich. |
| Abb. 23: | Western blots mit anti-EGF-R-Antikörper. 25µg Protein von Zellysaten (NRP154) nach Behandlung mit Testosteron (T), RA und deren Kombination. Unbehandelte NRP154 zum Vergleich. |
| Abb. 24: | Effekte von 0.1µM RA, 20nM Testosteron (T) und deren Kombination (RA+T) auf die Expression von EGFR-Protein. Quantitative Analyse der Bandendichten von Westernblots (Abb.19+20) mit Antikörper gegen EGF-R. Resultate sind Mittelwerte +/-SEM von vier identischen experimentellen Ansätzen. * kennzeichnet signifikante Unterschiede im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (=100% Bandendichte; p<0.05). |
| Abb. 25: | Die Effekte von 0.1µM RA, 20nM Testosteron (T) und deren Kombination (RA+T) auf die Verfügbarkeit von EGF-R gemessen mittels Liganden-Bindungs-Assays (A) bei NRP152 und (B) bei NRP154 nach verschiedenen Zeitintervallen nach Behandlung. Jede Säule representiert den Median von vier Experimenten und ist als prozentuale Differenz von unbehandelten Kontrollen ausgedrückt. * kennzeichnet signifikante Unterschiede im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe (=100% Bandendichte; p<0.05). |
| Abb. 26: | Ligandenbindungs-Assays mit LNCaP-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen. |
| Abb. 27: | Ligandenbindungs-Assays mit NRP152-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen. |
| Abb. 28: | Ligandenbindungs-Assays mit NRP154-Zellmembranen inkubiert mit [125I]-IGF1 steigender Konzentration. RA= 24 Stündige Inkubation mit 0.1µM Retinolsäure; T=24 Stündige Inkubation mit 20nM Testosteron. Jeder Punkt enstricht dem Median von vier Versuchsansätzen. |
| Abb. 29: | Immuncytochemie von NRP154 (oben) und NRP152 (unten) mit anti-RAR,,-Antikörpern (1:200; Farbdetektion mit Peroxidase -Diaminobenzaldehyd) |
| Abb. 30: | Semiquantitative Summen-Scores von Immunhistochemischen Färbungen von NRP152 und NRP154, wie in Abb. 23 angegeben. Die durchschnittlichen Summen-Scores sind als Balkendiagramme dargestellt, die Median+/-SEM von acht Experimenten beinhalten (signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (p<0.01) sind mittels * markiert. |
| Abb. 31: | Unterschiedliche Expression der RARmRNAs in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Prostata der Ratte (Northern blots mit 15µg Poly(a)RNA isoliert aus deventralen, dorsalen Lobulus der Ratten-Prostata oder der gesamten Ratten-Prostata. Normalisierung gegen 18S-RNA. |
| Abb. 32: | Unterschiedliche Expression der RARmRNAs in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Prostata der Ratte (Northern blots mit 15µg Poly(a)RNA isoliert aus deventralen, dorsalen Lobulus der Ratten-Prostata oder der gesamten Ratten-Prostata. Quantifizierung des in Abb.25 dargestellten Versuchs. Die Bandendichte jades Transkripts in jeder Probe wurde normalisiert gegen 18S-RNA und als Prozent des Nullwertes berechnet. Jede Säule entspricht dem Median+/-SEM von 4 Experimenten. Expression der RAR in der Gasamtprostata = 100%. |
| Abb. 33: | Expression von RARs in der Prostata der Ratte. Immunhistochemie mit anti RAR. (1:200) |
| Abb. 34: | Expression von RARs in der Prostata der Ratte. Immunhistochemie mit anti RAR. (1:200) |
| Abb. 35: | Kastrationseffekt auf die Expression von RAR-mRNA und RAR-mRNA nach verschiedenen Zeitintervallen nach Kastration in der Prostata der Ratte. Northern blots mit 15 µg Poly(A)-RNA aus Ratten-Prostaten unbehandelt (Kontrolle) und nach verschiedenen Zeitintervallen nach Kastration. Normalisierung gegen 18S-RNA. |
| Abb. 36: | Kastrationseffekt auf die Expression von RAR in ventraler und dorsaler Prostata der Rat.te (Immunhistochemie mit anti-RAR; 1:1000;) |
| Abb. 37: | Expression von RARmRNA in Lobund-Wistar-Ratten nach Behandlung mit MNU + Testosteron in Abhängigkeit von der Zeit (in Wochen) nach Behandlungsbeginn. |
| Abb. 38: | Expression von RARmRNA in Lobund-Wistar-Ratten nach Behandlung mit MNU + Testosteron in Abhängigkeit von der Zeit (in Wochen) nach Behandlungsbeginn. |
| Abb. 39: | Unterschiede in der Expression von RAR in Prostatakarzinom (links) und BPH (rechts) in menschlicher Prostata. Immunhistochemie mit Semidünnschnitten nach Radikaler Prostatektomie wegen eines Gleason 6 Prostata-Karzinoms. |
| Abb. 40: | Immunhistochemie mit anti-RAR-Antikörpern. Undifferenziertes Prostatakarzinom (Gleason >7) links im Bild ohne Nachweis von Immunreaktivität gegen RAR- Rechts im Bild: PIN mit heterogener Anfärbung eines Azinus. |
| Abb. 41: | A) Hematoxilin-Eosin-Färbung eines undifferenzierten Prostatakarzinoms. B) Verlust der Immunreaktivität gegen RAR bei einem undifferenzierten Prostatakarzinom. |
| Abb. 42: | Unterschiede inder Expression von RAR-mRNA und RAR-mRNA zwischen Prostata und Prostata-Karzinom . Northern blots mit 15 µg Poly(A)-RNA aus Prostata-Geweben (Human und Ratte) und den Prostata-Zellinien NRP152, NRP154 und LNCaP. |
© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
|
DiML DTD Version 2.0 |
Zertifizierter Dokumentenserver der Humboldt-Universität zu Berlin |
HTML - Version erstellt am: Fri Nov 1 13:35:56 2002 |