Retroviraler Gentransfer in primäre T-Zellen

Retroviral transfizierte T-Zellen sind in der Lage, stabil und dauerhaft ein Protein zu exprimieren (Blaese et al., 1995). Besonders aktivierte T-Zellen exprimieren vermehrt ihr [Seite 24↓]Transgen (Quinn et al., 1998). Bisher wurden retroviral transduzierte T-Zellen hauptsächlich zur Tumorbekämpfung eingesetzt. Hierbei wurden ex-vivo generierte, tumorspezifische T-Zellen mit proinflammatorischen Zytokinen (wie beispielsweise TNF-α) transduziert, die bei späterer Infiltration den Tumor und seine Metastasen „bekämpfen“. Wir konnten kürzlich zeigen, dass retroviral transduzierte allospezifische T-Zellen sowohl in-vitro als auch in-vivo mit einer verstärkten Transgen-Expression reagieren, wenn sie mit dem spezifischen Antigen stimuliert werden (Hammer et al., 2000 [siehe eigene Arbeiten]). Dies könnte die Basis für einen neuartigen Therapieansatz in der Transplantation darstellen (Abbildung 2). Für diese Arbeiten haben wir das von Flügel et al. (1999) beschriebene retrovirale Gentransfersystem in primäre T-Zellen übernommen und für unsere Anforderungen modifiziert. Die alloreaktiven, transgenen T-Zellen werden in einem Ko-Kultursystem generiert. Dies setzt sich zum einen aus der Virus-produzierenden Verpackungszelllinie und zum anderen aus einer gemischten Lymphozytenkultur, die aus bestrahlten Stimulatorzellen (um diese an der unerwünschten Proliferation zu hemmen) und Responderzellen des Transplantatempfängers zusammen.

Alle Zellen, die im Zuge des retroviralen Gentransfers nicht transduziert wurden, gehen im Rahmen einer Antibiotika-Selektion zugrunde, so dass nur die Zellen überleben, die durch das Retrovirus transduziert wurden. Die so generierten proliferierenden Zellen können durch weitere Restimulationsschritte vermehrt werden, um eine ausreichend große Anzahl von Zellen für die Applikation in den Transplantationsmodellen zur Verfügung zu haben.

Wir konnten in diesem System erstmals zeigen, dass in-vitro generierte allospezifische T-Zellen sowohl in-vitro als auch in-vivo bei Antigen-Kontakt verstärkt das Transgen (in unserer Arbeit das Reportergen EGFP, Enhanced Green Fluorescent Protein), welches in die T-Zellen mit Hilfe eines Retrovirus eingebracht wurde, exprimieren (Hammer et al., 2000 [siehe eigene Arbeiten]). Dies ist eine wichtige Voraussetzung für Untersuchungen, in denen immunregulatorische Proteine (z.B. IL-4 oder IL-10) nach retroviralem Gentransfer zur Verhinderung der Transplantatrejektion exprimiert werden sollen. Außerdem weisen diese retroviral transduzierten T-Zellen den gleichen Phänotyp (CD4+, CD25+, CD45RClow) wie die oben beschriebenen Toleranz-induzierenden T-Zellen auf (Hammer et al., 2002 [siehe eigene Arbeiten]). Noch wichtiger aber war, dass wir zeigen konnten, dass die allospezifischen T-Zellen nach intravenöser Applikation auch tatsächlich zu den entscheidenden Orten der Antigenpräsentation/-auseinandersetzung (Lymphknoten, Milz) hinwandern. Dies wurde mit Hilfe der konfokalen Lasermikroskopie an Gewebeschnitten bestätigt. Weiterhin konnten wir zeigen, dass die allospezifischen T-[Seite 25↓]Zellen nicht nur in den Lymphknoten und in der Milz, sondern tatsächlich auch im Allotransplantat verstärkt zu finden sind, jedoch kaum in Kontroll- oder Allotransplantaten mit anderen MHC-Antigenen („third-party“ Transplantaten) (Hammer et al., 2002 [siehe eigene Arbeiten]).

Diese Untersuchungen erfolgten sowohl durch histologische Auswertung von Gewebeschnitten als auch mit Hilfe der Durchflußzytometrie (FACS), wobei die T-Zellinfiltrate aus dem Transplantat isoliert und die EGFP-transduzierten T-Zellen am FACS analysiert wurden. Dabei konnten wir zeigen, dass die TEGFP-Lymphozyten aus dem Allotransplantat neben dem Transgen selbst auch den Aktivierungsmarker CD25 (α-Kette des IL-2 Rezeptors) verstärkt exprimieren. Dies ist jedoch nicht der Fall, wenn sie aus einem syngenen Transplantat oder einem Allotransplantat mit anderen MHC-Antigenen („third-party“ Transplantaten) isoliert wurden (Hammer et al., 2002 [siehe eigene Arbeiten]).

Die oben beschriebenen Vorarbeiten in Bezug auf die Akkumulation und Transgen-Expression ex-vivo generierter allospezifischer T-Zellen waren die Voraussetzung für die Experimente mit allospezifischen T-Zellen, die immunmodulierende Transgene sezernieren. Hierfür wurden zunächst allospezifische T-Zellen generiert, die als therapeutisches Gen vIL-10 exprimieren. Zunächst wurden diese Zellen in-vitro auf ihr immunmodulierendes Potenzial untersucht. Wir konnten in unseren Experimenten zeigen, dass die Zugabe dieser Zellen (5% der naiven Zellen) zu naiven, Antigen-stimulierten T-Zellen diese sowohl in ihrer Proliferationskapazität als auch in ihrer Fähigkeit, IFN-γ zu produzieren, deutlich hemmt (Ritter et al., 2001; Abstract ASGT). Damit sind die Voraussetzungen für eine in-vivo Applikation der TvIL-10-Lymphozyten gegeben. Die entsprechenden Untersuchungen werden derzeit im allogenen Herztransplantationsmodell der Ratte durchgeführt.


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04.02.2005