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1.  Gentherapie in der experimentellen Transplantation mittels adenoviralem Gentransfer

1.1. Adenoviraler Gentransfer von Zytokinen moduliert die akute Rejektion allogener Transplantate

Wie bereits erwähnt, wird die Rolle der TH2-Zytokine in bezug auf ihr Potenzial zur Prävention der Transplantatrejektion in der Literatur kontrovers diskutiert. So wird berichtet, dass die lokale Überproduktion von IL-4, entweder durch adenoviral transduzierte oder IL-4 transgene Transplantate, nicht zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führte (Smith et al., 1997 Mueller et al., 1997). Auf der anderen Seite wurde jedoch gezeigt, dass transgene, IL-4 sezernierende Transplantate oder die systemische Applikation von IL-4 - in Kombination mit Cyclosporin A – das Überleben allogener Transplantate verlängern kann (Takeuchi et al., 1997; Rabinovitch et al., 1997). Eine mögliche Ursache hierfür könnte darin liegen, dass unterschiedliche Modelle zur Aufklärung dieser Mechanismen verwendet wurden. Wir haben zunächst das Potenzial eines rekombinanten, IL-4 der Ratte exprimierenden Adenovirus (AdrIL-4) zur Verlängerung des Transplantatüberlebens in einem allogenen Nierentransplantationsmodell der Ratte (LBNF1:RT1l+n auf LEW:RT1l) untersucht (Abbildung 1). Hierfür wurden in einer einmaligen Behandlung 2x109 rekombinante Virus-Partikel (plaque forming units [Seite 9↓](pfu) ex-vivo in die Spendernieren perfundiert und für 90 Minuten bei 4°C inkubiert. Danach wurden die Organe orthotop transplantiert, wobei zuvor eine Empfänger-eigene Niere entfernt wurde. Am fünften Tag nach der Transplantation wurde die verbliebene zweite Empfänger-eigene Niere entfernt, so dass der Transplantatempfänger allein auf die Funktionsfähigkeit des allogenen Transplantates angewiesen war.

Kontrolltiere, die entweder unbehandelte oder mit einem Reportergen-Adenovirus (β-Galaktosidase) behandelte Nieren erhielten, verstarben zwischen Tag 10 und 20 nach der Transplantation (Mittlere Überlebenszeit 13,0±4,7 Tage bzw. 11,0±2,4 Tage). Hingegen war das Überleben von Tieren, die AdrIL-4 transduzierte Organe erhielten, signifikant verlängert (Mittlere Überlebenszeit 43,5±9,5; p<0.05) (Kato et al., 2000; Kato et al., zur Veröffentlichung eingereicht). Die Serumkreatininwerte, als Indikator für ein funktionell intaktes Transplantat, waren bei den Tieren, die AdrIL-4 transduzierte Nieren erhielten, zum Zeitpunkt der Organentnahme im Vergleich zu Tieren, die mit Kontroll-Vektor transduzierte Nieren erhielten, signifikant erniedrigt (p<0.05). Die molekularbiologische Analyse des Transplantatgewebes mit Hilfe der PCR zeigte, dass das Verhältnis der IL-4/IFN- mRNA als Indikator für eine Verschiebung des TH2/TH1-Milieus in Richtung TH2 in den Langzeitüberlebenden erhöht war (Kato et al., zur Veröffentlichung eingereicht). Hinweise auf den Mechanismus, der dazu führt, dass allogene Transplantate, die IL-4 überexprimieren, nicht oder nur verzögert abgestoßen werden, wurden vor kurzem beschrieben. Demnach scheint IL-4 immunmodulierend auf antigen-präsentierende Zellen, insbesondere auf dendritische Zellen, zu wirken. Dies führt zu einer Veränderung der Oberflächenexpression bestimmter ko-stimulatorischer Moleküle, die sich hemmend auf die Funktion von zytotoxischen T-Zellen auswirkt (King et al., 2001). Außerdem deutet sich an, dass IL-4 zytoprotektive Gene induziert (Bach et al., 1997).

Als nächstes wurde untersucht, ob sich die erfolgreiche Anwendung des AdrIL-4 Konstruktes im LBNF1/LEW Modell auch auf andere Stammkombinationen bzw. Transplantationsmodelle übertragen lässt. Hierfür wurde zunächst das starke, MHC Klasse I und II inkompatible Nieren-Transplantationsmodell Wistar-Furth auf Lewis (WF:RT1u auf LEW:RT1l) gewählt. Es zeigte sich, dass der alleinige adenovirale Gentransfer von IL-4 in diesem stringenten Modell nicht in der Lage ist, die Rejektion eines allogenen Nierentransplantates zu verhindern (Mittlere Überlebenszeit 17 Tage, n=5). Wenn man jedoch noch andere therapeutische Moleküle, wie z. B. Interleukin-10 oder die immunregulativ wirkende Untereinheit von IL-12, p40, zusammen mit IL-4 im Transplantat exprimiert, kommt es zu einer signifikanten Verlängerung der [Seite 10↓]Transplantatakzeptanz (IL-4/vIL-10, Mittlere Überlebenszeit > 26 Tage, n=4, Tiere wurden an Tag 30 zur Organentnahme getötet und IL-4/IL12p40, Mittlere Überlebenszeit > 24 Tage, n=3, Tiere wurden an Tag 30 zur Organentnahme getötet). Die Serumkreatinin-Untersuchungen zeigen jedoch, dass diese Therapie eine akute Rejektion mit zeitweiliger Funktionseinschränkung nicht verhindern kann. Dennoch kommt es in den gentherapeutisch behandelten Tieren zu einer spontanen Erholung von der akuten Rejektion, während die Kontrolltiere irreversibel rejezieren. Offensichtlich wird die akute Rejektion nicht verhindert, jedoch stark moduliert (Spontanerholung).

Ähnliche Effekte wie die oben beschriebenen konnten wir auch im Modell der allogenen Korneatransplantation der Ratte (WF:RT1u auf LEW:RT1l) beobachten. Während der Gentransfer von IL-4 in die Kornea alleine nicht zu einer Verlängerung des Transplantatüberlebens führt (IL-4, Mittlere Überlebenszeit 12,6 Tage, n=8; unbehandelte allogene Kontrollen, Mittlere Überlebenszeit 14,1 Tage, n=29) (Pleyer et al., 2001 [siehe eigene Vorarbeiten]), bewirkt die kombinierte Applikation von IL-4 und IL-10 einen signifikanten Anstieg des Transplantatüberlebens (Mittlere Überlebenszeit 26,3 Tage, n=10) (Pleyer et al., zur Veröffentlichung eingereicht). Weitere Untersuchungen, sowohl im Nieren- als auch im Korneatransplantationsmodell, sollen darüber Aufschluss geben, ob der lokale Gentransfer von IL-10 bzw. IL-12p40 im Transplantat alleine in der Lage ist, das Überleben allogener Gewebe signifikant zu verlängern. Für den IL-10 Gentransfer wurde dies mittlerweile in einem Korneatransplantationsmodell des Schafes gezeigt (Klebe et al., 2001).

Nach den erfolgreichen Untersuchungen zur Verhinderung der Transplantatrejektion im Nieren- bzw. Korneatransplantationsmodell mittels adenoviralem Gentransfer von Zytokinen wollten wir nun an weiteren Transplantationsmodellen, z. B. am allogenen Herz- bzw. Inselzelltransplantationsmodell untersuchen, ob sich auch in diesen Modellen die Therapie erfolgreich anwenden lässt. Im allogenen Herztransplantationsmodell in zwei MHC Klasse I und II inkompatiblen Stammkombinationen (Dark Agouti (DA): RT1av1 auf LEW: RT1l und WF: RT1u auf LEW: RT1l) führte jedoch der adenovirale Gentransfer – auch bei Ko-Applikation mehrerer therapeutischer Gene – nicht zu einer signifikanten Verlängerung der Transplantatakzeptanz (Ritter et al., 1999, [siehe eigene Arbeiten]; M. Lehmann, Rostock, pers. Mitteilung). Die Ursache für die unterschiedlichen Resultate im Nieren- bzw. Herztransplantationsmodell in bezug auf das Überleben der allogenen Transplantate ist bislang nicht bekannt. Da jedoch – wie oben angedeutet – im Nierentransplantationsmodell gezeigt wurde, dass eine Rejektion nicht verhindert, wohl [Seite 11↓]aber schnell revertiert wird, könnte das Versagen dieses Ansatzes im Herztransplantationsmodell dadurch erklärt werden, dass Herzen gegenüber einer inflammatorischen Attacke eine kleinere funktionelle Reserve haben und so schneller irreversibel geschädigt werden. Eine andere Erklärung für das unterschiedliche Rejektionsverhalten könnte darin liegen, dass sich Herzmuskelzellen wesentlich besser mit rekombinanten Adenoviren transduzieren lassen als Nierenzellen (T. Ritter, unveröffentlichte Daten). Die daraus resultierende höhere Immunogenität des genetisch modifizierten Transplantates durch die Expression adenoviraler Proteine könnte die Ursache dafür sein, dass in den von uns untersuchten Herztransplantationsmodellen keine Verlängerung der Transplantatakzeptanz zu beobachten war. Es gibt in der Literatur allerdings Hinweise darauf, dass der adenovirale Gentransfer von IL-10 zu einer signifikanten, jedoch moderaten Verlängerung der Transplantatakzeptanz führt (Qin et al., 1997; David et al., 2000). In diesen Arbeiten wurden jedoch nur sog. schwache bzw. wenig-stringente Abstoßungsmodelle verwendet.

Die Transplantation von allogenen Inselzellen (aus dem Pankreas isoliert), die ex-vivo mit einem IL-10 kodierenden Adenovirus transduziert werden, in diabetische BB-Ratten führte ebenfalls nicht zu einer längerfristigen Normoglykämie (B. Kuttler, Greifswald, pers. Mitteilung). Die Kombination verschiedener therapeutischer Gene wird derzeit in mehreren Inselzell-Transplantationsmodellen auf ihre Wirksamkeit hin untersucht.

1.2. Kombinierte Adenovirus- und T-Zelltherapie verbessert die Überlebensrate von allogenen Transplantaten

Da die Wirksamkeit des Zytokin-Gentransfers mit Hilfe von rekombinanten Adenoviren in den verschiedenen Transplantationsmodellen differierte, stellte sich die Frage, ob eine Kombinationstherapie von adenoviralen mit anderen immunsuppressiven Therapien, z. B. Cyclosporin A, das Überleben allogener Transplantate verlängern kann. Wir konnten wiederum im MHC Klasse I und II inkompatiblen Nieren-Transplantationsmodell Wistar-Furth auf Lewis (WF:RT1u auf LEW:RT1l) zeigen, dass die kombinierte Anwendung von AdrIL-4 mit suboptimalen Dosen von Cyclosporin A (1,5 mg/kg Körpergewicht/Tag über einen Zeitraum von 10 Tagen) zu einer signifikanten Verlängerung der Überlebenszeit der transplantierten Tiere führte (AdIL-4/Cy A; Mittlere Überlebenszeit 48 Tage, n=3, Tiere zur Organentnahme getötet).

Neben der Anwendung von kommerziell erhältlichen Pharmaka haben wir uns auch mit dem Potenzial von regulatorischen T-Zellen zur Übertragung von Toleranz in Kombination mit dem adenoviralen Gentransfer von Zytokinen beschäftigt. Es ist bekannt, dass eine [Seite 12↓]kurzzeitige Behandlung von allogenen Transplantatempfängern (Ratte) mit einem nicht-depletierenden monoklonalen Antikörper, der gegen das CD4-Epitop auf T-Helfer Zellen gerichtet ist (anti-CD4, RIB5/2; z.B. 5 Injektionen à 10 mg/kg Körpergewicht über einen Zeitraum von 3 Wochen), eine donorspezifische Toleranz bewirken kann (Lehmann et al., 1993). Im Laufe dieser Toleranzinduktion werden offenbar regulatorische Zellen (in der Milz bzw. im Transplantat) gebildet, die in der Lage sind, diese donorspezifische Toleranz auf naive Tiere ohne vorherige Antikörper-Behandlung durch adoptiven Zelltransfer zu übertragen. Aus diesem Grund wurde diese Form der Toleranzinduktion auch als „infektiöse“ Toleranz bezeichnet. Dabei muss jedoch eine relativ hohe Anzahl von Zellen (50x106 Milzzellen) übertragen werden. Die Frage, die sich uns nun stellte, war, ob man die dafür nötige Zellzahl bei Anwendung einer weiteren immunmodulierenden Kombinationstherapie (z.B. Zytokin-Gentransfer und regulatorische Zellen) vermindern kann. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Überleben allogener Herztransplantate der Ratte (LBNF1:RT1l+n auf LEW:RT1l) signifikant verlängerte, wenn die Organe ex-vivo mit einem IL-4 exprimierenden Adenovirus transduziert wurden und zusätzlich eine suboptimale Dosis an regulatorischen Zellen appliziert wurde. Hierfür wurde ein Zehntel der optimalen Dosis an tolerierten Milzzellen (5x106) mit naiven Milzzellen (45x106) gemischt und dem Transplantatempfänger injiziert (50x106 Milzzellen, Mittlere Überlebenszeit >100 Tage, n=5; 5x106 Milzzellen, Mittlere Überlebenszeit 12,2 Tage, n=4; AdrIL-4 Gentransfer ohne Milzzellen, Mittlere Überlebenszeit 16,8 Tage, n=4; AdrIL-4 Gentransfer kombiniert mit suboptimaler Dosis (5x106 Milzzellen), Mittlere Überlebenszeit >60 Tage, n=5) (Ke et al., 2000; [siehe eigene Arbeiten]). Zudem konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene nachgewiesen werden, dass IL-4 und IL-10 im Transplantat erhöht waren, während IL-2 und IFN-γ reduziert waren.

Wie die oben erwähnten Daten zeigen, scheint sich eine Kombinationstherapie aus unterschiedlichen Toleranzinduktionsprotokollen in den tierexperimentellen Transplantationsstudien zu bewähren, die man durchaus als Alternative zu den derzeit in der Klinik verwendeten Immunsuppressiva betrachten könnte. Es soll hier noch einmal ausdrücklich darauf hingewiesen werden, dass es sich bei der ex-vivo Perfusion allogener Transplantate mit rekombinanten Adenoviren um eine einmalige Behandlung handelt. Zudem lassen sich durch die ex-vivo Perfusion die adenoviral vermittelten Immunreaktionen im Vergleich zu einer systemischen Applikation von adenoviralen Vektoren in Grenzen halten.


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1.3.  Adenoviraler Gentransfer von protektiven Molekülen verhindert den Ischämie-/Reperfusionsschaden

Wie bereits beschrieben, kann eine verlängerte Ischämie-/Reperfusionszeit eines Transplantates sowohl zu einer Verminderung der Organqualität als auch zu einer Reduktion der mittleren Überlebenszeit führen. Hinzu kommt, dass aufgrund der negativen Bilanz zwischen Organbedarf und Organspende vermehrt sowohl Transplantate von älteren Spendern als auch Organe schlechter Qualität zur Transplantation herangezogen werden müssen. Es ist jedoch bekannt, dass Organe von älteren Transplantatspendern und Organe minderer Qualität in ihrer Funktion eingeschränkt sind (Amersi et al., 1999; Tullius et al., 2000). Zudem scheinen diese sog. marginalen Organe auch empfindlicher gegenüber einer verlängerten Ischämie-/Reperfusionszeit zu sein. Der Schutz dieser Organe gegen Ischämie-/Reperfusionsschäden könnte dazu beitragen, dass mehr Organe ohne kritischen Funktionsverlust transplantiert werden können und könnte somit die Situation der Limitierung von Organspenden entschärfen.

Zerstörerische oxidative Prozesse scheinen eine der Hauptursachen für die Entstehung des Ischämie-/Reperfusionsschadens zu sein. Daraus resultieren irreversible Schäden an Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden. Um solchen Prozessen entgegenzuwirken, hat der Organismus anti-oxidative Mechanismen entwickelt, z.B. die Gruppe der Hitzeschock-Proteine. Dazu gehören auch die Hemoxygenasen (HO), die an dem Abbau von Hämoglobin in Biliverdin, Kohlenmonoxid (CO) und freiem Eisen beteiligt sind. Bisher sind drei Isoformen von HO-1 bekannt, wobei die induzierbare HO-1 eine besondere Rolle zu spielen scheint. HO-1 wird nach verschiedensten Stimuli hochreguliert und gilt als empfindlichster Marker für zellulären Stress. HO-1 scheint auch eine wichtige Rolle bei der Verhinderung der Transplantatrejektion zu spielen, denn Herztransplantate von HO-1 defizienten Mäusen werden schnell abgestoßen (Soares et al., 1998). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Vorbehandlung von Mäusen mit Kobaltporphyrin (CoPP), einem bekannten Induktor von HO-1, zu einer verlängerten Überlebenszeit von Herztransplantaten aus diesen Mäusen führt, wenn sie in allogene Rezipienten transplantiert wurden (Woo et al., 1998). Die Anwendung von Kobaltporphyrin ist jedoch aufgrund seiner schlechten Löslichkeit und seiner in höheren Dosen auftretenden Toxizität problematisch, so dass alternative Modelle zur HO-1 Induktion untersucht wurden. Mit Hilfe eines rekombinanten Adenovirus, der HO-1 (AdHO-1) als therapeutisches Transgen exprimiert (Otterbein et al., 1999), wurde am Beispiel eines Rattentransplantationsmodells für „marginale“ Lebern untersucht, ob die Hochregulation von HO-1 in „marginalen“ Lebern zu einer Verbesserung der Transplantatfunktion und -qualität führt. Das [Seite 14↓]Lebertransplantationsmodell wurde deshalb ausgewählt, weil sich Leberzellen besonders gut mit rekombinanten Adenoviren transduzieren lassen und erwartet wurde, dass möglichst viele Zellen eines Transplantates das therapeutische Transgen exprimieren sollten. Es konnte zunächst in einem ex-vivo Leberperfusionsmodell gezeigt werden, dass die gentherapeutisch behandelten Lebern (AdHO-1) einen deutlich verminderten Ischämie-/Reperfusionsschaden aufwiesen. Dies konnte anhand der gemessenen Parameter (Blutfluss in der Portalvene, Gallenproduktion, Transaminasen) eindrucksvoll belegt werden. Weiterhin konnte in einem isogenen Transplantationsmodell gezeigt werden, dass die AdHO-1 behandelten Lebern eine deutlich verlängerte Transplantatüberlebenszeit aufwiesen (Mittlere Transplantatüberlebenszeit Kontrolle: 14 Tage, n=10-11, bei ca. 40% der Tiere; Mittlere Transplantatüberlebenszeit AdHO-1: 14 Tage, n=10-11, ca. 80% der Tiere) (Amersi et al., 1999), siehe eigene Arbeiten). Ähnliche Ergebnisse brachte die Anwendung von CoPP sowohl im ex-vivo Perfusionsmodell als auch in den isogenen Transplantationsstudien (Amersi et al., 1999), siehe eigene Arbeiten). Mittlerweile liegen auch Untersuchungen in Nieren- bzw. Inselzell-Transplantationsmodellen vor, die zeigen, dass die Induktion von HO-1 zur Verbesserung der Organfunktion und somit auch zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit beiträgt (Tullius et al., 2001; Pileggi et al., 2001). Interessanterweise scheint auch die Überexpression von HO-1 mittels adenoviralem Gentransfer nicht nur im Lebertransplantationsmodell, sondern auch in anderen Modellen, bei denen nicht von einem effizienten Gentransfer ausgegangen werden kann, zu funktionieren (I. Anegon, Nantes, Frankreich, pers. Mitteilung). Dies wiederum wirft die interessante Frage nach dem eigentlichen Mechanismus der HO-1 vermittelten Protektion auf, die derzeit intensiv untersucht wird. Ebenfalls interessant war die Frage, ob die Induktion von HO-1 auch die akute Rejektion im allogenen Transplantationsmodell beeinflussen kann. Erste Daten weisen darauf hin, dass AdHO-1 Gentransfer die Schwere akuter Abstoßungsreaktionen im allogenen Lebertransplantationsmodell deutlich reduziert und zu einem Anstieg von Th2-Zytokinen IL-4 und IL-10 führt (Ke et al., 2001).

Neben den Hitzeschockproteinen scheinen auch andere Genprodukte, die sog. Anti-Apoptosegene, eine wichtige Rolle bei der Verhinderung der Transplantatrejektion zu spielen. Unter Apoptose (programmierter Zelltod) versteht man das kontrollierte Absterben von Zellen im Laufe der Embryonalentwicklung, der Homöostase und der Wundheilung, ohne dass dabei benachbarte Zellen oder Gewebe zerstört werden. Die Induktion von Apoptose scheint auch in bestimmten Krankheits- bzw. Wundheilungsprozessen eine kritische Rolle zu spielen (Thomson 1995; Wilson and Kim, 1998). Die Apoptose wird [Seite 15↓]durch die Aktivierung eines zelleigenen Selbstmordprogramms ausgelöst, dessen Grundmaschinerie in jeder Zelle vorhanden ist. Der apoptotische Prozess unterteilt sich in mindestens drei Phasen: eine Initiations-, eine Effektor- und eine Degradationsphase (Steller et al., 1995; Kroemer et al., 1997). Während der sehr heterogenen Initiationsphase erhält die Zelle ein „Todessignal“, wie z.B. das Ausbleiben von essentiellen Wachstumsfaktoren, die Ligation eines signalvermittelnden Rezeptors (z.B. Fas-Rezeptor (APO-1, CD95) oder TNFRI) oder subnekrotisch wirkende Schädigungen (Toxine, Strahlung) (Akbar and Salmon, 1997; Nagata 1997). Die Umsetzung in ein allgemeines Reaktionsmuster erfolgt in der zweiten Phase, die durch die Anwesenheit vieler Proteine (z.B. bcl-2) regulativ beeinflusst wird. Letztendlich kommt es dabei zur Erhöhung der Permeabilität der inneren Mitochondrienmembran und zum Ausstrom eines Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) (Susin et al., 1996; Kroemer et al., 1997). Durch die Freisetzung von AIF kommt es in der letzten Phase zur Aktivierung vieler katabolischer Enzyme, deren Wirken die typischen morphologischen Veränderungen, die für die Apoptose charakteristisch sind, zur Folge hat.

Das anti-apoptotisch wirkende Protein bcl-2 gehört zu einer großen Familie von Proteinen, die entweder Apoptose verhindern (z. B. bcl-2, bcl-xl) oder unterstützen (z. B. Bax, bcl-xs oder Bad) (Cory, 1995). Das Verhältnis zwischen anti-apoptotischen und pro-apoptotischen Proteinen bestimmt den Ausgang der Entscheidung über den Tod einer Zelle maßgeblich. Neben bcl-2 und bcl-xl konnte noch ein weiteres anti-Apoptosegen identifiziert werden, das sog. bag-1 Gen (Takayama et al, 1995). Es bindet an bcl-2 und verstärkt dessen anti-apoptotisches Potenzial.

Vor kurzem wurde gezeigt, dass die Transfektion von bcl-2 in bovine Korneaendothelzellen diese in-vitro vor Apoptose schützen kann (Joo et al., 1999). Weiterhin wurde gezeigt, dass die Applikation eines adenoviralen Vektors, der für das bcl-2 Gen kodiert, in einem syngenen Lebertransplantationsmodell die Induktion eines Ischämie-/Reperfusionsschadens signifikant verhinderte (Bilbao et al., 1999). Untersuchungen zur Applikation von Anti-Apoptosegenen im allogenen Transplantationsmodell wurden bisher noch nicht durchgeführt, könnten aber ein vielversprechender Ansatz in der Prävention der Transplantatabstoßung sein. Wir haben in unseren Untersuchungen das Anti-Apoptosegen eingesetzt, da, wie bereits beschrieben, bag-1 die anti-apoptotische Wirkung von bcl-2 verstärkt. Vor der Applikation von AdBag-1 im allogenen Transplantationsmodell wurde dieses Konstrukt, wie zuvor für HO-1 beschrieben, zunächst sowohl im ex-vivo Leberperfusionsmodell als auch in der isogenen [Seite 16↓]Lebertransplantation auf die Fähigkeit, Ischämie-/Reperfusionsschäden zu verhindern, untersucht. Und ähnlich wie bereits für HO-1 beschrieben, konnten wir nach dem Gentransfer von Bag-1 eine signifikante Verbesserung des Portalvenen-Blutflusses, der Gallenproduktion und der Leberfunktion feststellen. Zudem konnte die Transplantatüberlebensrate nach Gentransfer von Bag-1 auf 100% über einen Beobachtungszeitraum von 14 Tagen gesteigert werden, im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, in der die Applikation eines Reporter-Genkonstruktes (β-Galaktosidase) nur in 50% der Fälle zu einer Transplantatverlängerung führte (Sawitzki et al., zur Veröffentlichung eingereicht, [siehe eigene Arbeiten]).

Es sind weitere Untersuchungen geplant, in denen die kombinierte Applikation von Schutzproteinen (z.B. HO-1 und Bag-1) auf ihre Kapazität, den Ischämie-/Reperfusionsschaden noch weiter zu reduzieren, getestet werden soll. Zudem soll der Gentransfer von Anti-Apoptosegenen auch in allogenen Transplantationsmodellen zum Einsatz kommen.

1.4. Adenoviraler Gentransfer von immunmodulatorischen Molekülen reduziert die Anzeichen einer chronischen Rejektion

Wie bereits beschrieben, konnten wir zeigen, dass der adenovirale Gentransfer von immunregulatorischen Molekülen die akute Rejektion in einem allogenen Nierentransplantationsmodell signifikant verhindern kann. Neben der Problematik der akuten Rejektion spielt heute vor allem die Beherrschung der chronischen Transplantatabstoßung eine wichtige Rolle in der Klinik. Die chronische Rejektion ist gekennzeichnet durch einen schleichenden Funktionsverlust des Transplantates über einen längeren Zeitraum hinweg, der - am Beispiel der Niere - zu einem Verlust von Nephronen und einer zunehmenden Fibrosierung führt. Im Gegensatz zur akuten Transplantatabstoßung ist derzeit keine medikamentöse Behandlung der chronischen Transplantatabstoßung möglich. Als Ursachen der chronischen Rejektion werden sowohl immunologische als auch nicht-immunologische Mechanismen diskutiert (Hayry et al., 1993). Es ist bekannt, dass bei den immunologischen Mechanismen der chronischen Transplantatabstoßung proinflammatorische Zytokine eine wichtige Rolle spielen. Wir haben uns daher die Frage gestellt, ob die frühe Expression immunmodulatorischer Proteine – wie für die akuten Abstoßungsmodelle beschrieben – einen Einfluss auf die Entstehung einer chronischen Rejektion haben kann und deren Schwere reduzieren oder sie sogar ganz verhindern kann. Um diese Frage zu beantworten, haben wir im Modell der chronischen Rattennieren-Transplantatabstoßung den Gentransfer mehrerer [Seite 17↓]immunmodulatorischer Proteine (IL-10, IL-12p40 und TNFRp55-Ig) untersucht. Da nicht bekannt war, welche Auswirkungen der Gentransfer eines einzelnen therapeutischen Genkonstrukts auf die chronische Rejektion ausüben wird, haben wir – wie bereits beschrieben – die kombinierte Applikation von mehreren Konstrukten gleichzeitig durchgeführt.

Als Modell haben wir wiederum das allogene Nierentransplantationsmodell der Ratte gewählt. Bei den Untersuchungen zur chronischen Transplantatabstoßung verwendet man in der Regel ein sog. schwaches Abstoßungsmodell (Fisher F344:RT1lvl auf Lewis RT1l), in dem in den ersten 10 Tagen nach der Transplantation eine suboptimale Dosis an Cyclosporin A (1,5mg/kg Körpergewicht) appliziert wird. Dieses Behandlungsschema führt innerhalb von 6 Monaten zu einer chronischen Rejektion (Tullius et al., 2000).

Wir konnten zeigen, dass die Blockade von TNF-α (vermittelt vor allem durch das lösliche TNF-Rezeptor Konstrukt und durch den IL-10 Gentransfer) als auch von IL-12 (vor allem durch den Gentransfer der inhibitorischen p40 Untereinheit von IL-12 und durch den IL-10 Gentransfer) die Funktionsfähigkeit allogener Nierentransplantate signifikant verbessert. Dies konnte anhand mehrerer untersuchter Parameter (Proteine im Urin, Creatinin-Clearance, morphologische und immunhistologische Befunde) gezeigt werden (Yang et al., zur Veröffentlichung eingereicht). Besonders auffällig war die an Gewebeschnitten beobachtete signifikante Reduktion der transplantatinfiltrierenden Monozyten/Makrophagen im Vergleich zu Kontrollen. Im Gegensatz zur Überexpression von IL-10, IL-12p40 und TNFRp55-Ig führt die Überexpression von IFN- direkt nach der Transplantation zu einer deutlich beschleunigten Verschlechterung der Transplantatfunktion, was letztlich zum Tod der Versuchstiere führte (Yang et al., zur Veröffentlichung eingereicht).

Wir konnten somit zeigen, dass die Modulation einer Immunreaktion durch die lokale Überexpression von therapeutischen Molekülen zu einem frühen Zeitpunkt nach der Transplantation das Risiko der Entstehung einer chronischen Rejektion beeinflussen kann.

1.5. Reduktion unerwünschter Immunreaktionen von adenoviralen Vektoren nach in-vivo Applikation

Wie bereits beschrieben, sind rekombinante Adenoviren in besonderer Weise dafür geeignet, therapeutische Moleküle in Organe zu transferieren, da sie sowohl ruhende, ausdifferenzierte als auch proliferierende Zellen mit hoher Effektivität transduzieren können (Kay et al., 2001). Ein Nachteil beim adenoviralen Gentransfer besteht allerdings in der Induktion sowohl einer humoralen als auch einer zellulären Immunantwort. Dies [Seite 18↓]führt letztlich zu einer nur transienten Expression des therapeutischen Gens, da die adenoviral transduzierten Zellen vom Immunsystem des Transplantatempfängers aufgrund der Präsentation adenoviraler Peptide via MHC-Klasse I an der Zelloberfläche erkannt und eliminiert werden (Yang et al., 1995). Hinzu kommt, dass die Applikation von rekombinanten Adenoviren zu einer akuten Immunreaktion führt, die sowohl die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine als auch die Rekrutierung proinflammatorischer Zellen (Monozyten/Makrophagen, Granulozyten, NK-Zellen) beinhaltet (Brenner et al., 1999), was sich – wie oben bereits beschrieben – negativ auf die Organfunktion eines Transplantates auswirkt. Neben den transplantatschädigenden Einflüssen kann die Rekrutierung proinflammatorischer Zellen und deren Zytokine auch direkt auf den Gentransfer bzw. auf die eingesetzten Vektoren einwirken. Es wurde gezeigt, dass proinflammatorische Zytokine einen negativen Einfluss auf die Expression des therapeutischen Gens haben, wenn diese – wie in den meisten Fällen – über virale Regulationselemente (z. B. CMV-Promoter, SV40-Promoter) gesteuert werden (Qin et al., 1997; Bromberg et al., 1998, Ritter et al., 1999, [siehe eigene Arbeiten]). Insgesamt sind die oben beschriebenen immunologischen Reaktionen nach dem adenoviralen Gentransfer als schädlich für die Transplantatfunktion einzustufen. Es war daher wichtig, zu untersuchen, wie sich diese unerwünschten Immunreaktionen verhindern lassen.

Zunächst wurde untersucht, ob die Applikation von monoklonalen Antikörpern, die in der Lage sind, immunmodulierend zu wirken und Toleranz gegenüber allogenen Transplantaten zu induzieren, die Infiltration von inflammatorischen Zellen in das Transplantat verhindern kann und zu einer Verlängerung der Transgen-Expression führt. Für diese Studien wurde ein syngenes Herztransplantationsmodell (LEW:RT1l auf LEW:RT1l) gewählt. Nach der Organentnahme wurde das Organ ex-vivo mit einem adenoviralen Reporterkonstrukt (β-Galaktosidase) perfundiert und danach unter Toleranz-induzierender anti-CD4-Therapie transplantiert. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass sich die Expression des Transgens unter anti-CD4 Therapie signifikant verlängert (Schröder et al., 2000; [siehe eigene Arbeiten]). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der adenovirale Gentransfer in das Herztransplantat in den nicht-behandelten Kontrollen sowohl zu einer massiven Infiltration inflammatorischer Zellen als auch zur Produktion proinflammatorischer Zytokine führt, was wahrscheinlich die Ursache für den frühzeitigen Verlust des Transgens ist. Im Gegensatz dazu ist unter anti-CD4 Therapie die Infiltration dieser Zellen deutlich vermindert. Zudem ist sowohl die Produktion von TH1-Zytokinen (vor allem IFN-) von transplantatinfiltrierenden Zellen als auch die humorale [Seite 19↓]Immunantwort gegen adenovirale Partikel deutlich reduziert (Schröder et al., 2000; [siehe eigene Vorarbeiten]). Interessanterweise führt die anti-CD4 Therapie jedoch nicht zu einer signifikanten Reduktion der Produktion von TNF-α. Da jedoch, wie bereits erwähnt, TNF-α eine wichtige Rolle bei der Induktion eines Ischämie-/Reperfusionschadens nach der Entnahme eines Transplantates spielt, war es wichtig, zu untersuchen, ob mit gentherapeutischen Methoden eine lokale Hemmung der TNF-α Produktion erreicht werden kann. Wir konnten zeigen, dass syngene Herztransplantate eine signifikante Reduktion der Infiltration von proinflammatorischen Zellen (T-Zellen, Monozyten/Makrophagen, Granulozyten, NK-Zellen) aufwiesen, wenn ein adenovirales Konstrukt, welches für einen löslichen chimären TNF-Rezeptor, bestehend aus dem extrazellulären Teil des humanen TNFRp55-Rezeptors und der konstanten Region des murinen IgG1-Moleküls, kodiert, appliziert wird. Diese deutliche Reduktion von infiltrierenden Zellen führte auch dazu, dass auf transkriptioneller Ebene (mRNA) die Produktion von TNF-α gehemmt wurde (Ritter et al., 2000; [siehe eigene Arbeiten]). Die Applikation des löslichen chimären TNF-Rezeptors scheint somit ein geeignetes Werkzeug zu sein, sowohl die Induktion des Ischämie-/Reperfusionsschadens als auch Immunreaktionen gegen adenoviral transduzierte Zellen zu reduzieren.

Weitere Untersuchungen sollen zeigen, ob die Blockade von TNF-α auch in den allogenen Transplantationsmodellen effektiv angewendet werden kann.


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04.02.2005