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3.  Material und Methoden

3.1. Chemoimmuntherapie

3.1.1. Patientengut

Zwischen April 1993 und Dezember 2001 wurden 107 Patienten mit einem metastasierten NZK, die mit einer Chemoimmuntherapie behandelt worden waren, hinsichtlich der Ansprechraten und dem klinischen Verlauf retrospektiv analysiert. Das mediane Alter der 23 Frauen und 84 Männer betrug 58 Jahre (35 bis 73 Jahre). Alle Patienten hatten eine progressive metastatische Erkrankung. Es wurden nur Patienten ausgewertet, bei denen vorher eine Tumornephrektomie durchgeführt worden war. Die TNM-Klassifikation ergab 3 pT1, 21 pT2, 28 pT3a, 39 pT3b, 1 pT3c und 5 pT4 Karzinome. Bei 10 Patienten war die T-Kategorie nicht bekannt. Bei 19 Patienten wurde zum Zeitpunkt der Operation ein Lymphknotenbefall (pN+) diagnostiziert. Das Grading des Primärtumors war in 2 Fällen G1, in 64 Fällen G2, in 31 Fällen G3 und in 2 Fällen G4. Das Grading war bei 8 Patienten nicht bekannt. Die histologischen Befunde ergaben hellzellige Nierenzellkarzinome bei 59 Patienten. Des Weiteren wurden bei 7 Patienten sarkomatoide, bei 3 Patienten papilläre und bei einem Patienten ein chromophobes NZK festgestellt. Bei den anderen 37 Patienten war der histologische Subtyp nicht bekannt.

Bei insgesamt 68 Patienten lag eine Vorbehandlung vor. 42 Patienten wiesen in der Anamnese eine operative Metastasenentfernung auf. 7 Patienten waren vor Chemoimmuntherapie perkutan bestrahlt worden und 19 Patienten hatten bereits eine Immuntherapie mit einem anderen Therapieschema erhalten.

Von den 107 Patienten wurden 45 mit einer synchronen Metastasierung diagnostiziert. Bei 62 Patienten war die Metastasierung metachron nach einem Zeitintervall von 23 Monaten (3 bis 150 Monate).

Bei 36 der 107 Patienten (33,6 %) lag eine Metastasierung in einem Organsystem vor. Weitere 36 Patienten (33,6 %) wiesen einen metastatischen Befall von zwei Organsystemen und 35 Patienten (32,8 %) einen Befall von drei Organsystemen auf. Lungenmetastasen traten bei 81 Patienten (76 %) auf, gefolgt von Knochenmetastasen bei 25 Patienten (23 %) und Lebermetastasen bei 23 Patienten (21 %). Mediastinale Lymphknotenmetastasen traten bei 25 Patienten (23 %) und retroperitoneale Lymphknotenmetastasen bei 16 Patienten (15 %) auf. 19 Patienten (18 %) hatten lokale Rezidive. Andere Metastasenlokalisationen bei 38 Patienten (35 %) waren die Nebennieren, die kontralaterale Niere, die Pleura, die Schilddrüse oder das Peritoneum. Die Patientencharakteristika sind in Tabelle 6 dargestellt.


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Tab. 6) Patientencharakteristika

107 Patienten

medianes Follow-up

20 Monate

medianes Alter

58 Jahren (35 – 75)

weiblich : männlich

23 : 84

synchron : metachron

45 : 62

Tumornephrektomie

alle Patienten

Lymphknotenbefall

19 (17.7 %)

Grading > G 3

31 (29 %)

KPI > 80 %

21 (20 %)

metastasierte Organsysteme:

eins

zwei

drei oder mehr

36 (33.6 %)

36 (33.6 %)

35 (32.8 %)

Metastasenlokalisation:

Lungen

Skelett

Leber

Nebennieren

Pankreas

kontralaterale Niere

Lymphknoten (hilär, mediast.)

Lymphknoten (retroperitoneal)

Lokalrezidiv

andere

81 (76 %)

25 (23 %)

23 (21 %)

10 (9 %)

8 (7 %)

8 (7 %)

25 (23 %)

16 (15 %)

19 (18 %)

12 (11 %)

3.1.2. Therapieplan

Die Patienten erhielten die Chemoimmuntherapie überwiegend im Rahmen prospektiver Therapieprotokolle der Deutschen Gesellschaft zur Chemoimmuntherapie des metastasierten Nierenzellkarzinoms (DGCIN). Das Therapieprotokoll entspricht dem de facto Standard in Deutschland. Die Patienten waren über das Behandlungsprotokoll und die entsprechenden Nebenwirkungen aufgeklärt und hatten ihr schriftliches Einverständnis gegeben. Die Chemoimmuntherapie bestand aus bis zu 3 aufeinanderfolgenden 8wöchigen Zyklen von subkutan appliziertem IL-2, subkutan appliziertem IFN-α2a und intravenös appliziertem 5-FU. Ein Teil der Patienten erhielt zusätzlich peroral 13-cis-Retinsäure (13-CRA). Zwischen den Therapiezyklen wurde den Patienten eine drei- bis vierwöchige Erholungsphase gewährt.

Der Therapieplan ist in Tabelle 7 dargestellt. In der ersten Zyklushälfte wurden IL-2 und IFN-α2a kombiniert. IL-2 wurde an den Tagen 3, 4 und 5 der Wochen 1 und 4 in einer Dosierung von [Seite 30↓]zweimal 18 Mio IU täglich und an den Tagen 1, 3 und 5 der Wochen 2 und 3 in einer Dosierung von 9 Mio IU verabreicht. IFN-α2a wurde am Tag 1 der Wochen 1 und 4 und an den Tagen 1, 3 und 5 der Wochen 2 und 3 in einer Dosierung von 9 Mio IU gegeben. In der zweiten Zyklushälfte wurden IFN-α2a und 5-FU kombiniert. In den Wochen 5 bis 8 erhielten die Patienten IFN-α2a in einer Dosis von 18 Mio IU jeweils an den Tagen 1, 3 und 5. 5-FU (750 mg/kg KG) erhielten die Patienten als 30minütige Kurzinfusion jeweils am ersten Tag der Wochen 5 bis 8. Insgesamt 71 Patienten erhielten während jedes Zyklus an allen Tagen peroral 3 x 20 mg 13-CRA.

Um die Nebenwirkungen der Chemoimmuntherapie zu minimieren erhielten die Patienten eine Begleitmedikation, wie z.B. Paracetamol gegen Fieber, Metoclopramid gegen Übelkeit und Erbrechen oder Panthenol gegen Hautirritationen.

Die Therapie wurde abgebrochen wenn eine Progression der Erkrankung diagnostiziert wurde, wiederholt WHO Grad III/IV Toxizitäten auftraten oder die Patienten ihre Einverständniserklärung zurückzogen.

Tab. 7) Therapieplan ( 36 Mio IU IL-2 und 9 Mio IU IL-2, 18 Mio IU IFN-α2a und 9 Mio IU IFN-α2a, 750 mg/m² KÖF 5-FU)

Medikament

Wochen 1 und 4

Wochen 2 und 3

Wochen 5 bis 8

 

Mo

Di

Mi

Do

Fr

Mo

Di

Mi

Do

Fr

Mo

Di

Mi

Do

Fr

IL-2

  

 

 

     

IFN-α2a

    

 

 

 

 

5-FU

          

    

13-CRA

täglich von Mo bis So

täglich von Mo bis So

täglich von Mo bis So

3.1.3. Statistische Auswertung

Das Therapieansprechen wurde entsprechend der UICC Kriterien und basierend auf den radiologischen Untersuchungen (konventionelle Röntgendiagnostik, Computertomographie, Ganzkörperskelettszintigraphie und Magnetresonanztomographie) alle 2 ½ bis 3 Monate durchgeführt. Es wurden nur Patienten ausgewertet, die zumindest die ersten 4 Wochen des ersten Therapiezyklus absolviert hatten. Das Ansprechen wurde basierend auf den Auswertungen nach dem ersten Zyklus bewertet. Der Zeitraum des Ansprechens wurde vom Beginn der [Seite 31↓]Chemoimmuntherapie bis zum Zeitpunkt des Progresses bzw. zum Stichtag 30.06.2002 berechnet. Nebenwirkungen der Therapie wurden anhand der Patientenangaben während des stationären Aufenthaltes und der ambulanten Dispensairebetreuung erfasst.

Das Überleben der Patienten wurde vom Beginn der Therapie bis zum Zeitpunkt des Todes bzw. bis zum Zeitpunkt des Stichtages 30.06.2002 berechnet. Die Überlebenswahrscheinlichkeit wurde anhand der Kaplan-Meier-Methode berechnet und Gruppen wurden mit dem Log-Rank-Test verglichen [91,110]. Die Identifikation unabhängiger Prognosefaktoren erfolgte mittels multivariater COX-Regressionsanalyse unter Anwendung des Software-Programms SPSS (Scientific Package for Social Science, version 11.0 for Windows, SPSS, Chicago, IL, USA).

3.2. Chemoimmuntherapie und synchrone Bestrahlung

3.2.1. Patientengut

Zwischen Juni 1998 und Oktober 2001 wurden 20 Patienten, darunter 5 Frauen und 15 Männer, synchron mit einer Chemoimmuntherapie und perkutanen Bestrahlung behandelt und retrospektiv analysiert. Die Patienten waren alle tumornephrektomiert und hatte eine progrediente metastasierte Erkrankung. Die T-Kategorie ergab kein pT1-Karzinom, 5 pT2-, 14 pT3- und 1 pT4-Karzinom. Bei 4 Patienten lag ein Lymphknotenbefall zum Zeitpunkt der Operation vor. 13 Patienten hatten ein G2- und 7 Patienten hatten eine G3-Karzinom. Bei 12 Patienten ergab der histologische Befund ein hellzelliges Karzinom und bei weiteren 4 Patienten ein sarkomatoides Karzinom. Bei 4 Patienten war der histologische Subtyp nicht bekannt.

8 Patienten hatten eine synchrone Metastasierung und bei 12 Patienten traten die Metastasen metachron, nach einem Median von 22 Monaten (2 bis 54 Monate) auf.

Von den 20 Patienten wiesen 2 (10 %) eine Metastasierung in einem Organsystem auf, bei 7 Patienten (35 %) waren zwei Organsysteme und bei 11 Patienten (55 %) waren drei und mehr Organsysteme befallen. Lungenmetastasen traten bei 15 Patienten (75 %) auf, gefolgt von Skelettmetastasen bei 12 Patienten (60 %) und Lymphknotenmetastasen bei ebenfalls 12 Patienten (60 %), Nebennierenmetastasen bei 3 Patienten (15 %) und Lebermetastasen bei 2 Patienten (10 %).

Bei 16 Patienten lagen Symptome wie Schmerz oder Kompressionssymptome (z.B. neurologische Symptome, Subileus) vor, die durch Skelett- und Lymphknotenmetastasen oder lokale Rezidive bedingt waren.

Die Patienten wurden in 2 Gruppen eingeteilt. Die 11 Patienten der Gruppe 1 erhielten die kombinierte Therapie als „First-line“-Therapie, die anderen 9 Patienten der Gruppe 2 erhielten [Seite 32↓]die Therapie in einem „Second-line“-Konzept nach stattgehabter alleiniger Chemoimmuntherapie.

3.2.2. Therapieplan

Die Patienten erhielten das DGCIN-Standardprotokoll unter Verwendung von subkutanem IL-2, subkutanem IFN-α2a, intravenösem 5-FU und peroraler 13-CRA in bis zu drei aufeinanderfolgenden Zyklen. Das Behandlungsprotokoll ist in Tabelle 7, Seite 25 dargestellt. Die Therapie wurde beendet, wenn eine Progression der Erkrankung festgestellt wurde, wiederholt Nebenwirkungen nach WHO Grad III/IV auftraten oder die Patienten ihre Einverständniserklärung zurückzogen.

19 Patienten wurden mit einer perkutanen Strahlentherapie (EBRT) während des ersten Zyklus behandelt. Die EBRT wurde in Einzeldosen von 2 bis 3 Gy und einer Gesamtdosis von 30 bis 40 Gy unter Anwendung eines Linearbeschleunigers (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA, USA) mit 6 oder 20 MV Photonen appliziert. Die Patienten erhielten entweder eine 3D-konformale Bestrahlungstherapie (3D-CRT) oder eine konventionell, in Gegenfeldtechnik geplante Behandlung.

Bei einem Patienten wurde die Bestrahlung direkt vor der Chemoimmuntherapie durchgeführt. Ein weiterer Patient wurde nach chirurgischer Stabilisierung einer pathologischen Fraktur einer Skelettmetastase bestrahlt. Neunzehn Patienten hatten noch weitere Metastasen außerhalb des Strahlenfeldes. Die Bestrahlungstherapie wurde bei 9 Patienten mit Skelettmetastasen, 7 Patienten mit Lymphknotenmetastasen und weiteren 4 Patienten mit lokalen Rezidiven durchgeführt. Zwei Patienten erhielten während der drei Zyklen Chemoimmuntherapie eine Bestrahlung an einer zweiten metastatischen Lokalisation.

3.2.3. Statistische Auswertung

Das Therapieansprechen wurde entsprechend der UICC-Kriterien und basierend auf den radiologischen Untersuchungen (konventionelle Röntgendiagnostik, Computertomographie, Ganzkörperskelettszintigraphie und Magnetresonanztomographie) alle 2 ½ bis 3 Monate ausgewertet. Die Veränderung von Symptomen wurde anhand von Patientenbefragungen erfasst. Es wurde kein spezieller Symptomscore verwendet.

Die Dauer des Therapieansprechens und das Überleben der Patienten wurde vom Beginn der Therapie bis zum Zeitpunkt des Progresses oder Todes berechnet. Die Überlebenswahrscheinlichkeit wurde anhand der Kaplan-Meier-Methode kalkuliert und die Gruppen wurden mit dem Log-Rank-Test verglichen.


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3.3.  venösen Tumorthromben der Stadien III und IV (nach Staehler)

3.3.1. Patientengut

Im Zeitraum von Juli 1992 bis November 2000 wurden an der Klinik und Poliklinik für Urologie des Universitätsklinikums Charité 24 Patienten mit Nierenzellkarzinomen mit infradiaphragmal-suprahepatischem oder supradiaphragmalem Vena-cava-Befall (Stadium III und IV nach Staehler) operiert. Das mediane Alter der 10 weiblichen und 14 männlichen Patienten betrug 59,5 Jahre (49 bis 73 Jahre) zum Zeitpunkt der Diagnosestellung. Das mediane Follow-up betrug 23,5 Monate. Es lagen bei 13 Patienten infradiaphragmal-suprahepatische Vena-cava-Zapfen (Stadium III) und bei 11 Patienten supradiaphragmale Vena-cava-Zapfen (Stadium IV) vor. Bei 4 Patienten bestanden zum Zeitpunkt der Operation bereits Metastasen, bei 14 weiteren Patienten traten in der Nachbeobachtungszeit Metastasen (insgesamt 75 %) auf.

Als Kontrollgruppe dienten 75 Patienten mit Nierenzellkarzinomen ohne Vena-cava-Zapfen im Stadium III/IV. 11 der 75 Patienten hatten venöse Tumorthromben der Stadien I (4 Patienten) und II (7 Patienten). Aufgrund der anerkannten Meinung, dass eine Ausdehnung der Tumorzapfen im Stadium I und II keine prognostische Bedeutung besitzt, wurden diese Patienten in die Kontrollgruppe einbezogen [50,101,102,181]. Das mediane Alter aller 18 weiblichen und 57 männlichen Patienten betrug 60,0 Jahre (35 bis 74 Jahre). Das mediane Follow-up betrug 27,0 Monate. Bei 59 Patienten (79 %) bestanden bzw. entwickelten sich im weiteren Verlauf des Krankheitsgeschehens Metastasen. Damit unterschieden sich die Patienten der Kontrollgruppe in wesentlichen Merkmalen wie Alter, Follow-up und Metastasierung nicht von den Patienten mit Vena-cava-Zapfen im Stadium III und IV.

3.3.2. Präoperative Vorbereitung

Nach Einschätzung des Allgemeinzustandes erfolgte bei allen Patienten eine intensive präoperative Vorbereitung und Konditionierung. Die Diagnostik von Fernmetastasen erfolgte durch eine kraniale, thorakale und abdominelle CT und Ganzkörperskelettszintigraphie. Die Ausdehnung des Vena-cava-Zapfen wurde mittels MRT und Farbkodierter-Duplex-Sonographie der Vena cava inferior, Becken- und Beinvenen (zum Ausschluss von Appositionsthromben) und ggf. Echokardiographie ermittelt. Die kardiopulmonale und vaskuläre Einschätzung der Patienten erfolgte mittels Lungenfunktionstest, konventioneller Röntgen-Thorax-Aufnahme und Farbkodierter-Duplex-Sonographie der extrakraniellen Gefäße.


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3.3.3.  Intraoperative Technik – Vena-cava-Zapfen im Stadium III

3.3.4. Intraoperative Technik – Vena-cava-Zapfen im Stadium IV

3.3.5. Postoperatives Management

Die Patienten wurden postoperativ auf der Intensivstation überwacht. Bei unkompliziertem Verlauf wurde ab 2. postoperativem Tag mit Kostaufbau und progressiver Mobilisation begonnen. Die Drainage-Entfernung erfolgte in der Regel am 3. oder 4. postoperativen Tag. Die Entlassung der Patienten in die ambulante Nachsorge erfolgte nach einem medianen stationären Aufenthalt von 29 Tagen (14 bis 35 Tage).


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3.3.6.  Chemoimmuntherapie

Bei insgesamt 7 von 18 metastasierten Patienten der Gruppe mit Vena-cava-Zapfen und 41 von 59 metastasierten Patienten der Kontrollgruppe wurde eine Chemoimmuntherapie nach dem Standardprotokoll der DGCIN unter Anwendung von subkutanem IL-2, subkutanem IFN-α2a und intravenösem 5-FU entsprechend des Protokolls (dargestellt in Tabelle 7, Seite 25) durchgeführt.

3.3.7. Statistische Auswertung

Das Überleben der Patienten mit Vena-cava-Zapfen und der Vergleichsgruppe wurde ab Operationszeitpunkt berechnet. Bei Patienten mit Vena-cava-Befall und Metastasen erfolgte die Berechnung ab dem Zeitpunkt des Auftretens von Fernmetastasen. Die Überlebenswahrscheinlichkeit wurde mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mit dem Log-Rank-Test ermittelt. Die Identifikation unabhängiger Prognosefaktoren erfolgte mittels multivariater COX-Regressionsanalyse unter Anwendung des Software-Programms SPSS (Scientific Package for Social Science, Version 11.0 for Windows, SPSS, Chicago, IL, USA).

3.4. Tumor M2-Pyruvatkinase (TU M2-PK)

3.4.1. Patientengut

Die Untersuchungen zur TU M2-PK erfolgten in zwei verschiedenen Serien1. Die Untersuchungen der ersten Serie erfolgten an Patienten mit verschiedenen nicht-metastasierten und metastasierten urologischen Tumoren und wurden an Heparinplasma durchgeführt. Eine Gesamtanzahl von 57 gesunden Probanden mit einem medianen Alter von 51 Jahren diente dabei als Kontrollgruppe. Die TU M2-PK wurde an Patienten mit Nierenzellkarzinomen, Urothelkarzinomen, Prostatakarzinomen und benigner Prostatahyperplasie (BPH) untersucht.


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Die Aufteilung der Patienten gestaltete sich wie folgt:

NZK

63 Patienten

51 nicht-metastasiert,

medianes Alter 57 Jahre

  

12 metastasiert,

medianes Alter 58 Jahre

Urothelkarzinom

36 Patienten

24 nicht-metastasiert, oberflächlich, und

  

6 nicht-metastasiert, infiltrierend, med. Alter 61 Jahre

 

6 metastasiert,

medianes Alter 68 Jahre

Prostatakarzinom

58 Patienten

31 nicht-metastasiert,

medianes Alter 61 Jahre

  

27 metastasiert,

medianes Alter 64 Jahre

BPH

28 Patienten

 

medianes Alter 65 Jahre

In der zweiten Serie erfolgten die Untersuchungen nur an Patienten mit metastasierten Nierenzellkarzinomen. Hierbei wurden Proben von insgesamt 68 Patienten gewonnen (9 weibliche Patienten, 59 männliche Patienten, medianes Alter 61 Jahre, 36 bis 77 Jahre). Alle Patienten waren tumornephrektomiert und die Diagnose NZK war histologisch gesichert. Bei 17 Patienten bestand lokalisiertes NZK (pT1/2), bei 42 Patienten lag ein lokal fortgeschrittenes NZK (pT3/4) vor und bei 9 Patienten konnte die initiale T-Kategorie nicht ermittelt werden. 11 Patienten wiesen primär Lymphknotenmetastasen auf. Von den 68 Patienten wiesen 2 ein hoch differenziertes NZK (G1) auf, bei 36 Patienten wurde ein mäßig differenziertes NZK (G2) diagnostiziert und bei 18 Patienten lag ein entdifferenziertes NZK (G3) vor. Bei 12 Patienten lagen keine Informationen zum Grading des Primärtumors vor.

Die Verteilung hinsichtlich der metastatisch befallenen Organsysteme verhielt sich wie folgt: 17 Patienten hatten ein befallenes Organsystem, 26 Patienten hatten Metastasen in 2 Organsystemen und 25 Patienten wiesen Metastasen in 3 oder mehr Organsystemen auf.

Die Metastasen traten bei 56 Patienten in den Lungen auf (82 %), gefolgt von retroperitonealen oder mediastinalen/hilären Lymphknotenmetastasen bei 30 Patienten (44 %), Lebermetastasen bei 22 Patienten (32 %), Knochenmetastasen bei 19 Patienten (28 %) und lokalen Rezidiven bei 7 Patienten (10 %). Zusätzlich Metastasenlokalisationen waren das Pankreas, die kontralaterale Niere, das Gehirn und die Haut.

Von den 68 Patienten hatten 24 eine synchrone Metastasierung, bei den 44 anderen Patienten trat die Metastasierung metachron nach einem medianen Intervall von 23 Monaten (6 bis 156 Monate) auf.


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50 der 68 Patienten erhielten im Verlauf eine Chemoimmuntherapie laut Protokoll (siehe Tabelle 7, Seite 25). Bei 11 Patienten wurden synchron zur Chemoimmuntherapie lokale Rezidive, Lymphknotenmetastasen oder Knochenmetastasen palliativ perkutan bestrahlt. Bei 3 weiteren Patienten wurden zwischen den Chemoimmuntherapie-Zyklen Operationen von Knochenmetastasen zur Stabilisierung von drohenden Frakturen durchgeführt.

Bei 8 der 18 nicht-behandelten Patienten konnte die Therapie auf Grund einer raschen Progression mit Verschlechterung des Allgemeinzustandes nicht durchgeführt werden, 2 Patienten brachen die Therapie auf Grund von Nebenwirkungen ab und weitere 8 Patienten standen zur Nachbeobachtung nicht zur Verfügung. Bei diesen 18 Patienten konnte die TU M2-PK nicht im Verlauf bestimmt werden.

Bei den 50 Patienten, die mit einer Chemoimmuntherapie behandelt wurden, bestand ein Nachbeobachtungszeitraum von mindestens 2½ bis 3 Monaten, entsprechend einem Zyklus Chemoimmuntherapie. Bei 30 Patienten betrug die Beobachtungszeit 5 Monate entsprechend 2 Therapiezyklen. Während dieser Zeit wurden die TU M2-PK Werte in regelmäßigen Abständen analysiert und dann mit dem bildgebend-dokumentierten Behandlungsergebnis verglichen. Eine Durchuntersuchung mit Computertomographie, Ganzkörperskelettszintigraphie, Thorax-Röntgen in wie Ebenen oder Magnetresonanztomographie wurde alle 2½ bis 3 Monate durchgeführt. Die Beurteilung des Behandlungsergebnisses erfolgte nach den UICC-Richtlinien. Ein Abbruch der Therapie erfolgte, wenn die Durchuntersuchung eine Progredienz der Erkrankung ergab.

Bei den Patienten mit einer synchronen Erkrankung erfolgte die Bestimmung der TU M2-PK nach Operation des Primärtumors und vor dem Beginn der Chemoimmuntherapie. Bei den anderen Patienten wurde der Marker als Routineuntersuchung während der Nachbeobachtung bestimmt oder als Ausgangswert gemessen, wenn per bildgebender Diagnostik Metastasen diagnostiziert wurden.

3.4.2. Messung der TU M2-PK

Die Proben der ersten Serie wurden als Heparinplasma gewonnen, 15 Minuten bei 1500 x g zentrifugiert und dann bei – 80 °C gelagert. Die Analyse der Proben erfolgte mit einem kommerziell erhältlichen ELISA-Kit, das auf der Anwendung von zwei spezifisch bindenden monoklonalen Antikörpern basiert, die nicht mit den anderen Isoenzymen der Pyruvatkinase (M1-, M2-, L-, R-type PK) kreuzreagieren (Fa. Schebo Tech GmbH, Wettenberg, Deutschland). Die Blutproben wurden prinzipiell vor jeglichen therapeutischen Eingriffen (operative Eingriffe, Chemoimmuntherapie, Hormontherapie, Chemotherapie oder Strahlentherapie) entnommen.


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Im Gegensatz zu den Untersuchungen der ersten Serie erfolgte die Bestimmung der TU M2-PK in der zweiten Serie entsprechend der überarbeiteten Herstellerempfehlung aus EDTA-Plasma. Die Plasmen wurden für 15 Minuten bei 1500 x g zentrifugiert und dann bei – 80 ° C gelagert. Das o.g. ELISA-Kit kam zur Anwendung. Entsprechend der Herstellerempfehlung wurde ein Cut-off von 15 kU/l benutzt.

3.4.3. Statistische Auswertung

Für die Verlaufsbeurteilung wurden die initialen TU M2-PK-Werte mit den Werten der Nachbeobachtungsphase verglichen. Die statistische Auswertung beider Serien erfolgte mit dem Software-Programm GraphPad 3.0L (PRISM, San Diego, USA). Die verschiedenen Gruppen nicht-parametrischer Daten wurden mit dem MANN-WHITNEY-Test und dem nicht-parametrischen ANOVA-Test nach KRUSKAL-WALLIS verglichen.

3.5. HSP72-Zellmembranexpression2

3.5.1. Zelllinien und Kulturbedingungen

In den Versuchen wurden die humane Nierenkarzinomlinie ACHN (ATCC CRL-1611) und die humane, hormonunabhängige Prostatakarzinomlinie PC-3 (ATCC CRL-1435) genutzt. Die ACHN Zellen wurden in Minimum Essential Medium Eagle mit nicht-essentiellen Aminosäuren (MEM) und die PC-3 Zellen in RPMI 1640 Medium kultiviert. Die Medien enthielten 10 % FKS, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml), Natriumpyruvat (1 mM), L-Glutamin (2 mM) und HEPES (10 mM). Die Kultur der Zellen erfolgte in einem Zellinkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C.

3.5.2. Isolation und Kultivierung von Primärkulturen3

Die Gewinnung der Gewebeproben erfolgte intraoperativ nach Entfernung der tumortragenden Niere während der Tumornephrektomie. Nach Eröffnen des Organs wurden aus dem präparierten Tumor etwa 4 bis 8 cm3 große Stücke steril entnommen und in Transportpuffer (PBS mit Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 µg/ml) und Amphotericin B (250 µg/ml)) eingelegt [Seite 39↓]und unter Kühlung in Eiswasser in die Forschungsabteilung transportiert. Die umgehende Aufarbeitung des Gewebes erfolgte in Anlehnung an die von Stephens et al. beschriebene Methode [184]. Zunächst wurden die Tumorstücke für 20 min bei 37 °C in Penicillin/Streptomycinlösung inkubiert. Danach wurde das Gewebe getrocknet, gewogen und dann mechanisch in ca. 1 mm³ große Stückchen zerkleinert. Dann erfolgte die Inkubation des Tumorgewebes in Kollagenase (2,5 mg/ml) für 2 ½ Stunden bei 37 °C im Vertikalrüttler. Nach Zugabe von MEM-Medium und Resuspension, Zentrifugation bei 1200 U/min für 6 min, Aufnahme in 30 ml MEM-Medium und erneuter Resuspension wurde die Tumorzellsuspension steril durch Gaze filtriert. Dann wurden die gewonnenen Einzelzellen erneut resuspendiert und bei 1200 U/min für 6 min zentrifugiert. Die Elimination für Erythrozyten erfolgte durch die Resuspension in Lysepuffer (0,155 M NH4Cl, 0,01 M KHCO3, 0,0027 M EDTA, pH 7,4 mit 4 N NaOH), erneuter mehrfacher Zentrifugation bei 1200 U/min für 6 min und anschließender Aufnahme in MEM-Medium. Dann erfolgte die Kultivierung der Tumorzellen in hoher Dichte in 75 cm2 Zellkulturflaschen in einem Zellinkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Die Reduktion von Fibroblasten konnte durch eine fraktionierte Trypsinierung erzielt werden.

3.5.3. Verifizierung der epithelialen Herkunft der Zellen4

Zur Verifizierung ihrer epithelialen Herkunft wurden die Zellen immunhistochemisch mit einem anti-CK18-Antikörper (MU 143 UC, BioGenex, Hamburg, Deutschland) gefärbt und die Expression von CK18 dann mit der Streptavidin-Alkalische-Phosphatase-Methode visualisiert Dazu wurden die Zellen auf Micro-Slids inkubiert, dann fixiert, gewaschen und anschließend mit einem spezifischen anti-CK18-Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur gefärbt und erneut mehrfach gewaschen. Anschließend wurden die Präparate mit sekundären Ziege-anti-Maus- und Ziege-anti-Kaninchen Antikörpern (Dianova, Hamburg, Deutschland) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach erfolgte die Inkubation mit Streptavidin-Alkalische-Phosphatase (Dianova, Hamburg, Deutschland) und die Visualisierung der CK18-Expression mit Substrat/Chromogen-Lösung (Neufuchsin/Naphtol-Biphosphat). Die Präparate wurden gewaschen, in einer aufsteigenden Alkoholreihe behandelt und eingedeckt. Die semiquantitative Einschätzung der CK18-Expression erfolge wie in Abschnitt „Semiquantitative Erfassung der HSP72-Expression“, Kapitel 3.6.4 Seite 40, beschrieben.


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3.5.4.  Hyperthermieexposition

Die Hyperthermiebehandlung wurde mit einem Präzisionswasserbad bei Temperaturen zwischen 41,8 bis 43,5 °C (± 0.1 °C) für 1 bis 3 Stunden durchgeführt. Nach Hyperthermieexposition wurden die Zellen wieder in den Inkubationsschrank verlagert und dort während der Erholungsphase inkubiert. Je nach Dauer der Erholungsphase (meist 16 Stunden) wurden die Zellen dann für die geplanten Experimente weiterverwendet.

3.5.5. Durchflusszytometrische Untersuchungen

Die behandelten Zellen und Kontrollzellen wurden nach den geplanten Zeitpunkten während der Erholungsphase nach Hyperthermieexposition mit HBSS gewaschen und dann mit einem Zellschaber vorsichtig abgelöst, in Medium resuspendiert und zweimal gewaschen. 106 Zellen wurden in 100 µl RPMI aufgenommen und erneut resuspendiert und mit den primären Antikörpern für 90 min bei 4 °C inkubiert. Es wurden folgende Antikörper und Isotyp-Kontroll-Antikörper in je 50 µl Flowzytometrielösung (PBS mit 2 % FKS und 0,1 % NaN3) verwendet: anti-HSP72-AK (C92F3A-5, Stressgen Corp., Victoria, BC, Kanada; IgG1, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland), anti-MHC-Klasse-I, (W6/32, DAKOCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland; IgG2a, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland). Dann wurde das Pellet resuspendiert, der Sekundärantikörper (Ziege-anti-Maus, F2650, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) dazugegeben und die Zellen für 30 min bei 4 °C inkubiert. Die Zellen wurden an einem Durchflusszytometer (FACScan, Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) quantitativ gemessen. Die Daten wurden mit dem Programm ModFit (Verity Software, Topsham, MA, USA) analysiert. Der Prozentsatz spezifisch gefärbter Zellen wurde berechnet aus der Differenz der Anzahl positiv gefärbter Zellen minus der Anzahl isotypgefärbter der Zellen.

3.5.6. Membranpräparation

Zur Präparation der Membranfraktion wurden die behandelten und nicht-behandelten Zellen mit dem Zellschaber gesammelt, mit PBS gewaschen und zentrifugiert. Dann wurden die Zellen in 3 mM Phosphat-gepufferter Saccharose-Lösung aufgenommen und anschließend mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Nach Zentrifugation (2000 x g, 4 min bei 4 °C) wurden die Überstände gepoolt und bei 11.000 x g bei 4 °C für 25 min zentrifugiert. Danach wurden die aufgenommenen Überstände erneut bei 20.000 x g und 4 °C für 45 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in PBS aufgenommen und bis zur Western Blot Analyse in flüssigem Stickstoff gelagert.


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3.5.7.  Western Blot

Die Zellen wurden in der Erholungsphase mit dem Zellschaber gesammelt und durch 4 Frier-Tau-Zyklen lysiert. Dann wurde der Proteingehalt mit der Bradford-Methode bestimmt [28]. 40 µg pro Probe wurden auf 12,5 % SDS-Gel separiert und auf Nitrozellulose transferiert. Die Membranen wurden mit 10 % FKS und 10 % bovinem Serumalbumin in TBS (10 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 8,0) für 3 Stunden bei Raumtemperatur geblockt. Die Blots wurden dann einmal in TBS mit 0,5 % Tween-20 und dreimal mit TBS gewaschen und für eine Stunde mit einem anti-HSP72-AK (C92F3A-5, StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Kanada) inkubiert. Danach erfolgte die Inkubation mit einem Alkalische-Phosphatase-konjugierten Sekundär-AK. Die Blots wurden gewaschen und in 0.45 mM 5-Brom-4-chlor-3-Indolylphosphat (BCIP, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) und 0.27 mM Nitroblautetrazolium (NBT, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA), in AP-Puffer (100 mM TRIS, 100 mM NaCl, and 5 mM MgCl2, pH 9.5) inkubiert, bis sich die Banden entwickelten.

3.5.8. Isolation von NK-Zellen

Die Isolation von NK-Zellen erfolgte durch negative Selektion anhand der von Voshol et al. beschriebenen Methode [203]. Aus je 60 bis 80 ml Blut von gesunden Probanden wurden periphere Blutlymphozyten (PBL) per Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation (Histo-Paque, Dichte 1,077, Zentrifugation bei 400 x g für 30 min) aus der Interphase gewonnen. Dann wurden die Zellen dreimal in RPMI-Medium (angereichert mit 25 mM HEPES, 5 % hitzeinaktiviertem FKS, 2 mM L-Glutamine, Penicillin/Streptomycin) gewaschen. Nach Resuspension wurden 1 bis 1,5 x 107 Zellen pro ml Medium aufgenommen. Zur Elimination der Monozyten wurde deren Eigenschaft zur Adhärenz an Plastikmaterial genutzt. Die Zellen wurden für eine Stunde in Plastik-Zellkulturflaschen (75 cm2) in einem Inkubationsschrank bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert und danach wurden die nicht-adhärenten Zellen gesammelt. Der nächste Schritt galt der Reduzierung von B-Lymphozyten auf der Basis ihrer Bindung an Nylon-Wolle. Nylon-Wolle (Typ 200L, Du Pont de Nemours, Wilmington, DE, USA) wurde in PBS gewaschen. Dann wurden Filtrationssäulen vorbereitet (0,6 g getrocknete Nylonwolle in einer 10 ml Spritze) und autoklaviert. Vor der Filtration wurden die Säulen mit RPMI-Medium gewaschen und für 1 Stunde präinkubiert. Dann wurden 25 bis 30 x 107 Zellen in 1 bis 2 ml Medium auf die Säule aufgebracht und für 45 min bei 37 °C inkubiert. Die nicht-adhärenten Zellen wurden dann mit 25 ml vorgewärmten Medium ausgewaschen und für den nächsten Schritt vorbereitet. Die T-Lymphozyten wurden per anti-CD3-Panning eliminiert. Dazu wurden 3 x 107 Zellen in 30 µl einer anti-CD3-Antikörper-Lösung (anti-Leu-4, Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) [Seite 42↓]aufgenommen und 45 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden danach in PBS mit 5 % FKS gewaschen und in einer Konzentration von 107 Zellen per ml PBS/FKS aufgenommen. Für das Panning wurden sterile Petrischalen (10 cm ∅) mit 10 ml einer Lösung aus einem Ziege-anti-Maus IgG-Antikörper (5 µg/ml, M2650, Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen, Deutschland) in PBS über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Petrischalen wurden nach dem Coating dreimal mit PBS/FKS gewaschen. Für das Panning wurden 3 ml der Zellsuspension per Petrischale aufgetragen und für 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Schalen vorsichtig geschüttelt und für weitere 45 min inkubiert. Die nicht-adhärenten Zellen wurden in Medium aufgenommen und die Petrischalen zweimal mit Medium gewaschen. Die Zellen wurden dann in RPMI-Medium aufgenommen und dreimal gewaschen. Die selektionierten Zellen wurden als aufgereinigte NK-Effektorzellfraktion für weitere Experimente genutzt. Die Zellen wurden in RPMI-Medium mit IL-2 (100 IU/ml) für 72 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Die phänotypische Verifikation der NK-Zellen (CD3-, CD16+ und CD56+) erfolgte durchflusszytometrisch unter Anwendung der Simultest-Lösung von Becton Dickinson (Mountain View, CA, USA), die die monoklonalen Antikörper anti-Leu-4 (anti-CD3, Fluorescein-markiert) und anti-Leu11c (anti-CD16) und anti-Leu-19 (anti-CD56, beide PE-markiert) enthält. Nach Färbung der NK-Zellfraktion mit der Simultest-Lösung erfolgte die Zweifarb-Durchflusszytometrie an einem FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA).

3.5.9. In vitro zellvermittelte Lyseexperimente

Die in vitro zellvermittelten Lyseexperimente erfolgten unter Anwendung des dafür standardisierten Zytotoxizitäts-Testkits Tox-7 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen, Deutschland). Dieses Testkit basiert auf der lysebedingten LDH-Freisetzung der Zielzellen und weist mit dem 51Crom-Release-Assay vergleichbare Resultate auf. Die Durchführung der in vitro Lyseexperimente erfolgte in ausgewählten Effektor-zu-Zielzell-Verhältnissen (1: 5, 1: 10, 1: 20 und 1: 40). Die Zellen wurden mit einem Zellschaber vorsichtig von der Kulturflaschenboden gelöst und dreimal in Medium gewaschen. Für Blockungsexperimente wurden die Zielzellen mit einem anti-HSP72-Antikörper (C92F3A-5, Stressgen Corp., Victoria, BC, Kanada) präinkubiert. Je 5000 unbehandelte und hyperthermiebehandelte Zellen (ACHN oder PC-3 Zellen) in 100 µl Medium wurden in 96-Loch-Platten (Rundboden) aufgetragen. Je nach Effektor-zu-Zielzell-Verhältnis wurden IL-2 stimulierte NK-Zellen in einem Volumen von 100 µl Medium [Seite 43↓]dazugegebenen. Die Zellen wurden zentrifugiert und für 2 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Dann wurden die LDH-Lösung laut Herstelleranweisung dazugegeben, die Proben wurden für 20 min bei Dunkelheit und Raumtemperatur inkubiert die Fluoreszenz bei 490 nm gemessen. Die spezifische Lyse wurde mit folgender Formel berechnet:

Die spontane LDH-Freisetzung wurde mit der folgenden Formal berechnet:

3.6. zytoplasmatische HSP72-Expression

3.6.1. Karzinom- und Normalgewebe

Für die Untersuchungen wurden in Paraffin eingebettete Gewebeproben von 53 Nephrektomiepräparaten mit Nierenzellkarzinomen und 10 histologisch gesicherten Metastasen von 6 dieser Patienten aus der Tumorbank des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums Charité verwendet. Von 21 Patienten wurde neben der Untersuchung des Karzinomgewebes auch das normale Nierenparenchymgewebe analysiert.

Die operative Behandlung der Patienten erfolgte in 52 Fällen an der Klinik für Urologie des Universitätsklinikums Charité und in einem Fall an der Urologischen Abteilung des St.-Hedwigs-Krankenhauses Berlin im Zeitraum 1992 bis 1999.

Das Staging der Nierenzellkarzinome erfolgte auf der Basis der TNM-Klassifikation von 1997 [66]. Die Befunde vor 1997 wurden demzufolge nachklassifiziert.

Die Beurteilung des Tumorgradings wurde anhand der an der WHO angelehnten Mainzer Klassifikation durchgeführt [189]. Es wurde der Gesamttumor analysiert und der jeweils höchste Grad, unabhängig seiner quantitativen Ausbreitung angegeben.

Die histopathologische Subtypisierung der Nierenzellkarzinome erfolgte auf der Grundlage der UICC Klassifikation von 1997 [185]. Dabei wurden der häufig auftretende hellzellige Subtyp, sowie die papillären, chromophoben, und nicht-klassifizierbaren Nierenkarzinomtypen unterschieden. Ductus-Bellini-Karzinome (Sammelrohrkarzinome) wurden nicht in die immunhistochemische Analyse einbezogen.


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3.6.2.  Patientengut

Es wurden insgesamt die Präparate von 53 Patienten mit Nierenzellkarzinomen untersucht. Das mediane Alter der Patienten zum Zeitpunkt der Erstdiagnose betrug 57 Jahre (34 bis 72 Jahre). Das Patientenkollektiv bestand aus 14 weiblichen und 39 männlichen Patienten. Die histopathologischen Befunde ergaben pT1-Karzinome in 8 Fällen (15,1 %), pT2-Karzinome in 7 Fällen (13,2 %) und pT3-Karzinome in 38 Fällen (71,7 %). Ein pT4 NZK wurde nicht diagnostiziert. Zum Zeitpunkt der Operation lag bei 7 Patienten ein Lymphknotenbefall vor, der in 2 Fällen als pN1 und in 5 Fällen als pN2 klassifiziert wurde.

Bei 21 Patienten (39,6 %) bestand synchron mit dem Zeitpunkt der Erstdiagnose bereits eine metastasierte Erkrankung. Bei 12 Patienten lag eine pulmonale Metastasierung vor, je ein weiterer Patient wies eine mediastinale, hepatische, adrenale und ossäre Metastasierung und eine Patientin retroperitoneale Lymphknotenmetastasen auf. Ein weiterer Patient hatte eine Metastasierung in den Lungen und in der Leber und 3 Patienten wiesen Metastasen in drei und mehr Organsystemen auf.

Das Grading lautete G1 bei 3 Patienten (5,7 %), G2 bei 34 Patienten (64,1 %) und G3 bei 16 Patienten (30,2 %).

Bei den histologischen Subtypisierungen wurde lediglich zwischen hellzelligen und nicht-hellzelligen NZK unterschieden. Bei 43 Patienten (81,1 %) wurde ein hellzelliges NZK diagnostiziert und 10 Patienten (18,9 %) wiesen ein nicht-hellzelliges NZK auf.

Bei 52 von 53 konnten Daten zum weiteren klinischen Verlauf erfasst werden. Die medianeNachbeobachtungszeit betrug 33 Monate (2 bis 108 Monate). Im Verlauf entwickelten weitere 15 Patienten Fernmetastasen nach einem medianen Zeitraum von 20 Monaten (5 bis 82 Monate).

Damit ergab sich für den gesamten Beobachtungszeitraum eine Anzahl von 36 Patienten mit Fernmetastasen. Von 6 Patienten mit Metastasen wurden 10 Metastasen (5 Lungenmetastasen, 3 ossäre Metastasen, eine Metastase in der Restniere und eine Metastase im Omentum majus) immunhistochemisch bezüglich ihrer HSP72-Expression untersucht.

Von den 36 metastasierten Patienten wurden 24 mit einer Chemoimmuntherapie mit der Dreifachkombination von IL-2, IFN-α2a und 5-FU behandelt. Je nach Ansprechen, erhielten die Patienten ein bis drei Therapiezyklen. Das primäre Therapieergebnis wurde nach dem ersten Zyklus nach den UICC Kriterien beurteilt und mit der HSP72-Expression des Primärtumors korreliert.


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3.6.3.  Immunhistochemische Untersuchungen5

Ca. 5 – 7 µm dicke Paraffinschnitte wurden auf speziell oberflächenbehandelte Objektträger aufgebracht (SuperFrost®Plus Microscope Slides, Menzel&Gläser, Braunschweig, Deutschland) und über Nacht bei 45 °C im Brutschrank getrocknet. Danach erfolgte die Entparaffinierung in Xylol für 2 x 10 min sowie anschließend in absolutem Ethylalkohol, 50 %igem Ethylalkohol und Aqua dest. Eine weitere Vorbehandlung der Präparate fand nicht statt.

Die immunhistochemische Färbung begann mit der Inkubation der Präparate mit dem monoklonalen Primärantikörper gegen das 72 kDa HSP (RPN 1197, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland), der in einer Verdünnung von 1 : 150 für 30 min bei Raumtemperatur eingesetzt wurde. Anschließend wurde nicht gebundener Antikörper aus den Präparaten mit Pufferlösung ausgewaschen. In einem weiteren Schritt wurden die Präparate mit einem sekundären Kaninchen-anti-Maus-IgG-Brückenantikörper (DAKOCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) und dem APAAP-Komplex (Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase, DAKOCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) über 30 min bei Raumtemperatur behandelt. Dazwischen wurden die Präparate mit Puffer gewaschen. Der Vorgang der Färbung mit dem Brückenantikörper und dem APAAP-Komplex wurde zur Erhöhung der Sensitivität zwei weitere Male für jeweils 15 min wiederholt.

Der Nachweis der APAAP erfolgte mit Chromogen (DAKOCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) für zweimal 15 min bei Raumtemperatur. Um endogene Enzymaktivitäten zu reduzieren, wurde dem Chromogen 0,25 mmol/l Levamisol (DAKOCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) zugesetzt.

Nach erneutem Waschen der Präparate erfolgte eine schwache Gegenfärbung der Zellkerne mit Meyer´s Hämalaun (Einwirkzeit 1 min), um die Orientierung am Präparat zu erleichtern. Danach wurden die Präparate noch einmal gewaschen, durch eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert und mit Eukitt eingedeckt. Die Spezifität der Immunfärbung wurde durch das Mitführen von je einer Negativkontrolle pro Schnitt gesichert, bei der anstatt des Primärantikörpers lediglich das hochgereinigte Verdünnungsmedium (DAKOCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) für die Primärantikörper zur Anwendung kam.


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3.6.4.  Semiquantitative Erfassung der HSP72-Expression

Die immunhistochemische Erfassung der HSP72-Expression erfolgte semiquantitativ mittels lichtmikroskopischer Analyse. Je nach Ausprägung der Rotfärbung wurden 4 Intensitätsstufen unterschieden:

0 – keine Anfärbung der Zellen

1 – schwache aber eindeutige Rotfärbung der Zellen

2 – mäßige Anfärbung der Zellen

3 – intensive Rotfärbung der Zellen

Pro Karzinomareal wurden mit dem Lichtmikroskop bei einer 200fachen Vergrößerung 30 Gesichtsfelder ausgewertet. Als Ergebnis wurde jeweils die mittlere Färbeintensität pro Schnitt angegeben. Es wurden nur solche Präparate in die Untersuchung einbezogen, bei denen eine kontrastreiche Immunfärbung mit einer schwachen Hintergrundfärbung vorlag, 3 Präparate wurden nicht berücksichtigt. Nekrosen, Blutungen, narbige Degenerationszonen oder Verkalkungen wurden nicht beurteilt. Die Auswertung erfolgte bei 200facher Vergrößerung (Objektiv 20fach, Okular 10fach) in den jeweils am stärksten angefärbten Karzinomarealen. Positiv- und Negativkontrollen wurden mitgeführt.

3.6.5. Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte deskriptiv. Grundlage der Berechnungen waren die mathematischen Mittelwerte der Färbeintensitäten der beurteilten Gesichtsfelder pro einzelnem Präparat.

Die Berechnung der Sensitivität, Spezifität und maximalen Effizienz der Methode erfolgte mit einer ROC-Analyse. Der berechnete Cut-Off mit der höchsten Sensitivität und Effizienz wurde für weitere Analysen zugrunde gelegt.

Die Berechnung der Überlebenswahrscheinlichkeiten der Patienten erfolgte nach der Kaplan-Meier-Methode. Unterschiede zwischen verschiedenen Gruppen wurden mit dem Log-Rank-Test berechnet. Das Überleben der Patienten wurde ab Zeitpunkt der Erstdiagnosestellung berechnet. Bei den Patienten, die mit einer Chemoimmuntherapie behandelt worden waren, erfolgte die Ermittlung der Überlebenszeit ab Beginn der Therapie.

In univariaten Analysen wurde der Einfluss bestimmter Prognoseparameter auf das Überleben der Patienten ermittelt. Die Daten der univariaten Analyse wurden in einer multivariaten Analyse weiter verarbeitet, um unabhängige Prognoseparameter zu ermitteln. Zur Anwendung kamen die Statistikprogramme GraphPad 3.0L, GrahRoc (PRISM, San Diego, CA, USA) und SPSS (Scientific Package for Social Science, Version 11.0 for Windows, SPSS, Chicago, IL, USA).


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3.7.  HSP70-Peptid-Komplexe

3.7.1. Zelllinien und Kulturbedingungen

In den Untersuchungen kamen die murine Melanomlinie B16-F1 (ATCC CRL-6323), die humane Nierenkarzinomlinie ACHN (ATCC CRL-1611) und primärkultivierte Nierenkarzinomzellen zur Anwendung. Die Kultivierung der ACHN-Zellen erfolgte nach den im Abschnitt 3.5.1, Seite 33 und die Gewinnung und Kultivierung der Primärkulturen nach den im Abschnitt 3.5.2, Seite 33 der beschriebenen Bedingungen. Die murinen B16-F1-Zellen wurden in Dulbecco’s modified Eagle’s Medium unter Zugabe von10 % FKS, Penicillin (100 U/ml), Streptomyzin (100 µg/ml), Natriumpyruvat (1 mM), L-Glutamin (4 mM) und kultiviert. Die Kultur der Zellen erfolgte in einem Zellinkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.

3.7.2. Anreicherung von HSP70-Peptid-Komplexen

Die Aufreinigung von HSP70-Peptid-Komplexen erfolgte auf der Basis der hohen Affinität von HSP70-ADP-Komplexen zu Peptiden durch ADP-Affinitätschromatographie. Dazu wurde das Tumorzellpellet in hypotonem Puffer (10 mM NaHCO3, 0,5 mM PMSF, pH 7,1) aufgenommen, inkubiert und homogenisiert. Das Lysat wurde anschließend bei 100,000 x g für 60 min zentrifugiert und der Überstand gewonnen. Es erfolgte der Pufferwechsel (Puffer „S“: 20 mM TRIS-Azetat, 20 mM NaCl, 15 mM ß-Mercaptoethanol, 3 mM MgCl2, 0,5 mM PMSF, pH 7,5) per Gelfiltration mit einer PD-10 Säule. Anschließend wurde das Lysat auf eine ADP-Agarosesäule (5 ml) aufgetragen, die vorher mit Puffer „S“ äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 2 ml Puffer „S“ unter Zusatz von 0,5 M NaCl und nachfolgend 3 ml Puffer „S“ gewaschen und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die HSP70-Peptid-Komplexe wurden nach nochmaliger 30minütiger Inkubation mit 25 ml Puffer „S“ unter Zusatz von 3 mM (ACHN- und primäre NZK-Zellen) oder 60 mM ADP (B16-F1-Zellen) in 1ml Fraktionen eluiert. Es erfolgte ein erneuter Pufferwechsel zu Phosphatpuffer mittels Gelfiltration. Die Bestimmung des Proteingehaltes im Eluat erfolgte mittels der Bradford-Methode [28].

3.7.3. Western Blots

Die Western-Immunoblots zum Nachweis von HSP70 im ADP-Affinitätschromatographieeluat wurden nach der im Abschnitt 3.5.7, Seite 36 beschriebenen Methode durchgeführt. Als monoklonaler Antikörper kam ein anti-HSP70-AK (N27F3-4, anti-HSP72/73, StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Kanada) zur Anwendung.


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3.7.4.  Tierexperimentelle Untersuchungen

Die präliminäre tierexperimentelle Studie erfolgte nach den Richtlinien des „Animal Care and Use Educational Program“ der University of New Mexico, Health Sciences Center. Es wurde ein prophylaktischer Vakzinationsansatz gewählt. Dazu wurden syngene C57BL/6 (-H2b) Mäuse zweimal wöchentlich über 4 Wochen mit aufgereinigten HSP70-Peptid-Komplexen, die aus murinen Melanomzellen der B16-F1-Linie gewonnen wurden, vakziniert. Am Beginn der dritten Behandlungswoche wurden den Tieren jeweils 105 B16-F1 Zellen in die linke Flanke injiziert. Die Messung des Tumorwachstums erfolgte bis zum 22. Tag nach Tumorzellinokulation zweidimensional in zweitägigen Abständen.


Fußnoten und Endnoten

1 Die Untersuchungen der ersten Serie erfolgten im Forschungslabor der Klinik für Urologie unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. K. Jung. Die Untersuchungen der zweiten Serie wurden im Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie, Campus Mitte, Universitätsklinikum Charité, unter der Leitung von Frau Dr. B. Brux durchgeführt.

2 Die experimentellen Arbeiten erfolgten auf der Basis eines DAAD-Stipendiums des Habilitanden an der University of New Mexico, Albuquerque, NM, USA, unter der wissenschaftlichen Betreuung von Prof. P.L. Moseley, MD, Chief, Division of Allergy, Pulmonary and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine. Die weiterführenden experimentellen Untersuchungen in Deutschland wurden gesondert gekennzeichnet.

3 Das Thema wurde von Herrn D. Meier im Rahmen einer Promotion bearbeitet. Die Isolation und Kultivierung der Primärkulturen erfolgte in der Forschungsabteilung der Klinik für Urologie. Die durchflusszytometrischen Untersuchungen wurden am Institut für Medizinische Immunologie, Campus Mitte, Universitätsklinikum Charité unter Mitarbeit von Herrn Dr. F. Kern durchgeführt.

4 Die Untersuchungen erfolgten im Institut für Pathologie, Campus Mitte, Universitätsklinikum Charité, unter der Betreuung von Frau OÄ Dr. B. Rudolph.

5 Die Untersuchungen wurden am Institut für Pathologie, Campus Mitte, Universitätsklinikum Charité durch den Doktoranden Herrn Cand.-Med. S. Richter unter der wissenschaftlichen Anleitung von Herrn Prof. Dr. S. Hauptmann durchgeführt.



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10.06.2004