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4.  Ergebnisse

4.1. Klinischer Teil

4.1.1. Chemoimmuntherapie beim metastasierten Nierenzellkarzinom

Therapieansprechen

Nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 20 Monaten konnten 104 von 107 Patienten hinsichtlich des Therapieansprechens ausgewertet werden. Insgesamt hatten 7 Patienten den ersten Zyklus nicht komplett beendet. Bei 3 Patienten erfolgte keine Therapieauswertung, da sie bereits während der ersten 4 Zykluswochen die Therapie abbrachen. Davon erlitt ein Patient einen akuten Myokardinfarkt mit Todesfolge, der zweite Patient beendete die Therapie wegen zu starker Nebenwirkungen und der dritte Patient zog seine Einverständniserklärung nach zwei Therapiewochen zurück. Bei 4 weiteren Patienten, die die Therapie erst in der zweiten Zyklushälfte nach hochdosierter IL-2-Gabe abbrachen, erfolgte die Auswertung hinsichtlich des Therapieansprechens.

Insgesamt wurde ein objektives Ansprechen bei 23 Patienten (22,1 %, 95 % CI 14,6 – 31,3) mit einem progressionsfreien Intervall von 13 Monaten (5 – 112 Monate) beobachtet. Komplette Remissionen traten bei 8 Patienten (7,7 %) mit einer medianen Dauer von 37,5 Monaten (9 – 112 Monate) auf. Partielle Remissionen wurden bei 15 Patienten (14,4 %) mit einem progressionsfreien Intervall von 8 Monaten (5 – 38 Monate) erzielt.

Bei einer weiteren Gruppe von 48 Patienten (46,2 %) kam es zu einer Stabilisierung der Erkrankung mit einem progressionsfreien Intervall von 8 Monaten (4 – 46 Monate). Nur 33 Patienten (31,7 %) blieben auch unter Therapie progredient. Diese Patienten erhielten keinen zweiten Zyklus Chemoimmuntherapie. Die Gesamtansprechraten sind in Tabelle 8 dargestellt.

Tab. 8) Ansprechverhalten nach Chemoimmuntherapie

 

auswertbare Patienten (n = 104)

Remissionsrate

progressionsfreies Intervall (Monate)

CR

8

7,7 %

37.5 (9 – 112)

PR

15

14,4 %

8 (5 – 38)

CR + PR

23

22,1 %

13 (5 – 112)

SD

48

46,2 %

8 (4 – 46)

PD

33

31,7 %

-

(CR = komplette Remission, PR = partielle Remission, SD = Stabilisierung, PD = Progression)


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Die Remissionen traten am häufigsten bei Lungenmetastasen auf (20 Patienten), gefolgt von Lymphknotenmetastasen (8 Patienten), lokalen Rezidiven, Skelettmetastasen und Lebermetastasen (jeweils 3 Patienten).

Überleben

Nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 20 Monaten waren noch 35 der 104 Patienten am Leben. 7 dieser Patienten hatten weiterhin keinen Anhalt auf Metastasen (NED, no evidence of disease). Bei 28 weiteren Patienten bestanden Metastasen (alive with tumor). Das mediane Überleben aller Patienten lag bei 19 Monaten. Die Ein-, Zwei- und 5-Jahresüberlebensrate lag bei 70, 40 und 17 % (siehe Abbildung 1).

Abb. 1)Überlebenswahrscheinlichkeit für 104 Patienten

Es bestand eine signifikante Beziehung zwischen dem Therapieansprechen und dem Überleben. Patienten mit einer CR (n=8), einer PR (n=15) und Patienten mit einer Stabilisierung (n=48) hatten ein medianes Überleben von 83, 31 bzw. 23 Monaten. Im Vergleich dazu lag das mediane Überleben bei Patienten ohne Ansprechen (PD, n=33) bei nur 7 Monaten (p<0,0001, Log-Rank-Test, siehe Abbildung 2).


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Abb. 2)Überlebensanalyse in Abhängigkeit vom Ansprechverhalten

Toxizität/Nebenwirkungen

Die Chemoimmuntherapie wurde insgesamt gut toleriert. Die Nebenwirkungen wie Fieber, Schüttelfrost, Übelkeit, Hypotonie, Gewichtsverlust und Hautirritationen traten überwiegend als WHO Grad I und II Toxizitäten auf. 7 Patienten konnten den ersten Zyklus nicht vollständig beenden. Ein Patient mit einem sarkomatoiden NZK war bereits während des ersten Zyklus im massiven Progress. Bei den 6 anderen Patienten führte das Auftreten schwerer Nebenwirkungen zum Abbruch der Therapie. Drei Patienten verstarben unter Therapie. Ein Patient verstarb infolge eines akuten Myokardinfarktes, der zweite Patient erlitt eine akute Lungenembolie auf der Basis einer nicht bekannten tiefen Beinvenenthrombose und der dritte Patient war unter Therapie progredient und verstarb direkt nach dem ersten Zyklus unter dem Bild eines septischen Schocks mit Multiorganversagen.

Die Therapie musste bei 21 Patienten (20 %) temporär wegen WHO Grad III Toxizitäten unterbrochen werden, zeitweilige Dosisreduktionen waren bei weiteren 20 Patienten (19 %) notwendig.

Insgesamt wurden alle Patienten im Durchschnitt mit 2,0 Therapiezyklen behandelt. Bei 43 Patienten, die mit einer Remission oder zumindest einer Stabilisierung auf die Therapie ansprachen, wurde das Therapieprotokoll mit der Gesamtzahl von 3 Zyklen vollständig angewandt.


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Einfluss von 13-CRA auf das Therapieergebnis

Die zusätzliche Einfluss von 13-CRA auf den Behandlungseffekt der Chemoimmuntherapie wurde bei insgesamt 72 Patienten mit einem Karnofsky-Performance-Index (KPI) von mindestens 80 % retrospektiv analysiert. 36 Patienten erhielten die Dreifachkombination von IL-2, IFN-α2a und 5-FU. Die anderen 36 Patienten erhielten eine Vierfachkombination unter Zugabe von 13-CRA (3 x 20 mg) täglich über einen gesamten Therapiezyklus. Beide Gruppen waren hinsichtlich wesentlicher Patientenmerkmale vergleichbar. Die wichtigsten Patientencharakteristika sind in Tabelle 9 aufgeführt.

Tab. 9) Patientencharakteristika beider Therapiegruppen

Patientencharakteristika

Dreifachtherapie

Vierfachtherapie

Anzahl der Patienten

36

36

medianes Follow-up

16 Monate

17 Monate

medianes Alter

57 Jahre (35 – 71)

56 Jahre (35 – 72)

weiblich : männlich

10 : 26

5 : 31

synchron : metachron

17 : 19

12 : 24

Tumornephrektomie

alle Patienten

alle Patienten

Lymphknotenbefall

7 (19 %)

7 (19 %)

Grading > G 3

10 (28 %)

10 (28 %)

KPI > 80 %

alle Patienten

alle Patienten

metastasierte Organsysteme

eins

zwei

drei oder mehr

14 (38 %)

11 (31 %)

11 (31 %)

15 (42 %)

8 (22 %)

13 (36 %)

Lokalisation der Metastasen

Lungen

Skelett

Leber

Nebenniere

Lymphknoten

lokale Rezidive

andere

28 (78 %)

7 (19 %)

7 (19 %)

4 (11 %)

11 (31 %)

2 (14 %)

9 (25 %)

28 (78 %)

8 (22 %)

4 (11 %)

3 (8 %)

19 (53 %)

2 (6 %)

17 (47 %)

35 Patienten mit der Dreifachtherapie konnten und 34 Patienten mit der Vierfachkombination konnten hinsichtlich des Therapieansprechens ausgewertet werden. Bei einem Patienten wurde [Seite 53↓]die Therapie wegen eines akuten Myokardinfarktes und bei den beiden anderen Patienten wegen hoher, persistierender Nebenwirkungen abgebrochen. Damit konnte bei insgesamt 69 Patienten eine Auswertung vorgenommen werden.

Zwischen den Patientengruppen gab es hinsichtlich des Therapieansprechens keine signifikanten Unterschiede (p=0,4800, Fisher’s Exakt-Test). Objektive Remissionen traten in 34,3 % (95 % CI 19,1-52,2) in der Gruppe der Dreifachtherapie und in 26,4 % (95 % CI 12,9-44,4) in der Gruppe der Vierfachtherapie auf. Das Ansprechverhalten beider Gruppen ist in Tabelle 10 dargestellt.

Tab. 10) Ansprechverhalten nach Chemoimmuntherapie (Dreifachtherapie) und unter Zugabe von 13-CRA (Vierfachtherapie)

 

Dreifachtherapie, n = 35

Vierfachtherapie, n = 34

Remissionsrate

progressionsfreies

Intervall (Monate)

Remissionsrate

progressionsfreies

Intervall (Monate)

CR

4

(11,4 %)

63,5

(13 – 112)

3

(8,8 %)

13

(9 – 45)

PR

8

(22,9 %)

9,5

(5 – 38)

6

(17,6 %)

7,5

(5 – 17)

SD

15

(42,9 %)

8

(5 – 46)

17

(50 %)

10

(4 – 22)

PD

8

(22,8 %)

  

8

(23,6 %)

  

Die Überlebensanalyse nach der Kaplan Meier Methode ergab ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Therapiegruppen (p=0,9353, Log-Rank-Test). Das mediane Überleben betrug in beiden Gruppen 21 Monate. Die Ein- und Drei-Jahres-Überlebensraten lagen in der Dreifachtherapiegruppe bei 76 % und 32 % gegenüber 82 % und 37 % für die Patientengruppe der Vierfachkombination (siehe Abb. 3).


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Abb. 3)Überlebenswahrscheinlichkeiten beider Therapiegruppen

Uni- und multivariate Analysen

Der Einfluss verschiedener Faktoren auf das Überleben der Patienten wurde anhand von uni- und multivariaten Analysen geprüft. Es wurden folgende Faktoren untersucht: Alter der Patienten, Geschlecht der Patienten, KPI vor Therapiebeginn (< 80 % versus > 80 %), T-Kategorie des Primärtumors (pT1/2 versus pT3/4), N-Status bei Operation (pN0 versus pN1/2), Grading des Primärtumors (G1/2 versus G3/4, Präsenz von Lungen- bzw. Skelettmetastasen, Zeitpunkt zwischen Auftreten der Metastasen (< 2 Jahre versus > 2 Jahre) sowie die Anzahl der befallenen Organsysteme (ein Organsystem versus 2 oder mehr Organsysteme).

Der KPI hatte einen signifikanten Einfluss auf das Überleben der Patienten. Abbildung 4 demonstriert die Überlebenswahrscheinlichkeit für Patienten mit einem KPI von > 80 % (n=83) gegenüber Patienten mit einem KPI von < 80 % (n=21). Das mediane Überleben lag bei Patienten mit einem hohen KPI mit 23 Monaten deutlich über dem von Patienten mit einem KPI von < 80 % mit nur 7 Monaten (p=0,0001, Log-Rank-Test).


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Abb. 4)Überlebenswahrscheinlichkeit bei Patienten mit einem KPI > bzw. < 80 %.

Neben dem KPI ergab sich auch für das histologische Grading des Primärtumors eine signifikante Beziehung zum Überleben der Patienten. Die Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit vom Grading ist in Abbildung 5 dargestellt. Bei Patienten mit einem primären Grading G1/2 (n=64) betrug die mediane Überlebenszeit 25 Monate im Gegensatz zu den Patienten mit G3/4 Karzinomen (n=32) mit 14 Monaten (p=0,0231, Log-Rank-Test). Bei 8 Patienten lag keine Information zum primären Grading vor.

Abb. 5)Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit vom Grading des Primärtumors


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Die Ergebnisse der multivariaten Analyse sind in Tabelle 11 aufgeführt. Lediglich der KPI und der Zeitraum bis zur Diagnose der Fernmetastasen erwiesen sich als signifikante Faktoren, die mit einer ungünstigen Prognose assoziiert waren. Die Anzahl der befallenen Organsysteme war ein marginal signifikanter prognostischer Faktor.

Tab. 11) Ergebnisse der multivariaten Analyse (* = signifikant).

Faktor

p-Wert

relatives Risiko

95 % CI

Karnofsky-Performance-Index < 80 %

< 0,0001*

6,351

3,251 – 12,381

Zeitraum bis zur Metastasierung < 2 Jahre

0,009*

2,425

1,244 – 4,729

Anzahl der befallenen Organsysteme > 1

0,087

1,642

0,931 – 2,896

4.1.2. Chemoimmuntherapie und synchrone Bestrahlung

Bei insgesamt 20 Patienten wurde die Chemoimmuntherapie mit IL-2, IFN-α2a, 5-FU und 13-CRA mit einer perkutanen Bestrahlung von Skelettmetastasen oder Lymphknotenmetastasen bzw. lokalen Rezidiven synchron kombiniert. Diese Kombinationstherapie erfolgte bei 11 Patienten als „first-line“-Therapieansatz und bei 9 Patienten als „second-line“-Ansatz nach vorangegangener Chemoimmuntherapie und erneuter Progression bei diesen Patienten.

Ergebnisse bei den „first-line“ Patienten

Das mediane Alter der 11 Patienten (3 Frauen und 8 Männer) betrug 61 Jahre (35 – 69 Jahre). 6 Patienten hatten eine synchrone und 5 Patienten eine metachrone Metastasierung, die nach einem medianen Intervall von 23 Monaten (2 – 48 Monate) diagnostiziert wurde. Die Patienten wurden im Durchschnitt mit 2 Therapiezyklen behandelt. Bei 5 Patienten wurden Skelettmetastasen bestrahlt, bei 5 weiteren Patienten wurden Lymphknotenmetastasen und einem Patient ein lokales Rezidiv mit einer Gesamtdosis zwischen 30 bis 40 Gy bestrahlt. 8 Patienten wiesen zusätzlich Symptome wie Schmerzen bzw. einen Subileus auf. Es wurde eine objektive Remissionsrate von 27,3 % (95 % CI 6.0-61,0) erzielt. Dabei traten 2 CR (18 %) und 1 PR (9 %) und zusätzlich 5 Stabilisierungen (SD, 46 %) auf. Patienten mit einer CR oder PR zeigten ein längeres progressionsfreies Intervall als Patienten mit einer SD (27 Monate versus 6 Monate). Nur 3 Patienten blieben unter der Therapie progredient. Es gab eine gute Korrelation zwischen dem Ansprechen an der Bestrahlungslokalisation und dem allgemeinen Ansprechen. Bei 7 von 8 [Seite 57↓]Patienten wurde ein deutlicher Rückgang der Symptome beobachtet, die sich in einer Reduzierung der Schmerzmedikation äußerte.

Ergebnisse bei den „second-line“ Patienten

9 Patienten (2 Frauen und 7 Männer) wurden mit der Kombinationstherapie als „second-line“ Ansatz behandelt. Bei 7 Patienten trat die Metastasierung metachron nach einem Intervall von 21 Monaten (3 – 54 Monate) auf. Alle Patienten waren progredient nach vorangegangener Chemoimmuntherapie und einem Intervall von 15 Monaten (2 – 45 Monate). Das mediane Alter der Patienten war 55 Jahre (48 – 72 Jahre). Die Patienten erhielten im Durchschnitt 1,3 Zyklen Chemoimmuntherapie. Bei 4 Patienten wurden Skelettmetastasen bestrahlt, bei 3 weiteren Patienten lokale Rezidive und bei 2 Patienten Lymphknotenmetastasen. 7 der 9 Patienten hatten Symptome wie Schmerzen, Dyspnoe und neurologische Symptome. Bei diesen multipel vorbehandelten Patienten wurde keine objektive Remission beobachtet. Es konnte jedoch bei 5 Patienten (56 %) eine Stabilisierung mit einer medianen Dauer des progressionsfreien Intervalls von 8 Monaten (3 – 22 Monate) erzielt werden.

Überleben

Nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 11,5 Monaten (4 – 32 Monate) waren 6 der 20 Patienten (20 %) noch am Leben. Ein Patient war weiterhin in einer CR und die anderen Patienten hatten Metastasen. Das mediane Überleben aller Patienten betrug 11 Monate. Die Ein- und Zwei-Jahres-Überlebensrate betrug 50 % und 35 %.

Das mediane Überleben bei den „first-line“-Patienten lag bei 12 Monaten. Patienten, die auf die Therapie mit einer CR, PR oder SD reagierten (n=8) hatten mit 15 Monaten ein signifikant verlängertes Überleben als Patienten ohne Ansprechen (n=3) mit 7 Monaten (p=0,0049, Log-Rank-Test, siehe Abbildung 6). Die Ein- und Zwei-Jahresüberlebenswahrscheinlichkeit aller Patienten lag bei 55 % und 27 %.


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Abb. 6)Überlebenswahrscheinlichkeit bei den „first-line“ Patienten.

Bei den „second-line“-Patienten betrug das mediane Überleben 11 Monate. Bei den Patienten mit einer Stabilisierung (n=5) war der Median nach 36 Monaten der Nachbeobachtung noch nicht erreicht. Bei den progredienten Patienten (n=4) betrug das mediane Überleben 6 Monate. Dieser Unterschied war nicht signifikant (p=0,1012, Log-Rank-Test, siehe Abbildung 7). Die Ein- und Zwei-Jahres-Überlebensrate betrug jeweils 44 %.

Abb. 7)Überlebenswahrscheinlichkeit bei den „second-line“ Patienten.

Toxizität/Nebenwirkungen

Die Nebenwirkungen der Therapie waren im Vergleich zur alleinigen Chemoimmuntherapie kaum erhöht. Symptome wie Fieber, Schüttelfrost, Übelkeit, Hypotonie, Gewichtsverlust und [Seite 59↓]Hautirritationen traten überwiegend als WHO Grad I und II Toxizitäten auf. Bei 2 Patienten musste die Therapie nach dem ersten Zyklus abgebrochen werden. Ein Patient entwickelte eine Autoimmun-Thrombozytopenie und der zweite Patient litt unter therapieresistenter Übelkeit. Bestrahlungs-assoziierte Nebenwirkungen im Sinne einer moderaten aktinischen Ösophagitis traten bei zwei Patienten auf, bei denen mediastinale Lymphknoten bestrahlt wurden.

4.1.3. Therapie von Patienten mit venösen Tumorthromben der Stadien III und IV (nach Staehler)

Peri- und postoperative Ergebnisse

Im Zeitraum von Juli 1992 bis November 2000 wurden an unserer Klinik 24 Patienten mit einem NZK und Extension eines Tumorthrombus in die Vena cava inferior im Stadium III und IV nach Staehler operiert. Von diesen Patienten wiesen 13 Patienten ein pT3b, 10 Patienten ein pT3c und ein Patient ein pT4 Nierenzellkarzinom auf. Ein Lymphknotenbefall wurde bei 3 Patienten diagnostiziert (2 Patienten pN1, ein Patient pN2). Bei 20 Patienten wurden zum Zeitpunkt der Operation keine Fernmetastasen festgestellt, bei 4 Patienten waren zu diesem Zeitpunkt Fernmetastasen bekannt. Die histologischen Befunde der Primärtumoren ergaben 20 hellzellige, 2 papilläre und 2 chromophobe NZK. In 18 Fällen wurde ein G2 Karzinom und in 6 Fällen ein G3 Karzinom festgestellt.

Die peri- und postoperative Mortalität der Patienten mit Vena-cava-Zapfen im Stadium III und IV betrug 4 %. Die Mortalität für die 13 Patienten im Stadium III betrug null Prozent. Von den 11 im Stadium IV operierten Patienten verstarb eine adipöse Patientin (9 % im Stadium IV) am 21. postoperativen Tag an einer Sepsis mit Multiorganversagen infolge einer Duodenalperforation, Pankreatitis und Pneumonie.

In Tabelle 12 sind peri- und postoperative Komplikationen aufgeführt. Als postoperative Phase wurden die ersten 30 Tage definiert. Insgesamt traten bei 12 Patienten (50 %) schwere Komplikationen auf. Für Patienten im Stadium III betrug die Komplikationsrate 31 % und für Patienten im Stadium IV 73 %.


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Tab. 12)Komplikationen (n=24)

Patient / Geschlecht / Alter

Stadium

Komplikationen

C. K. / w / 59 Jahre

III

Pleuraerguss, NNR-Insuffizienz

H. B. / m / 56 Jahre

III

tiefe Beinvenenthrombose

E. M. / m / 55 Jahre

III

akutes Nierenversagen

H. M. / m / 68 Jahre

III

Pleuraerguss, Pneumonie

R. B. / w / 67 Jahre

IV

Durchgangssyndrom, NNR-Insuffizienz

W. M. / m / 49 Jahre

IV

Querschnittssyndrom, Durchgangssyndrom

R. T. / w / 62 Jahre

IV

Durchgangssyndrom, TIA

W. G. / m / 69 Jahre

IV

akutes Nierenversagen

H. G. / m / 57 Jahre

IV

Durchgangssyndrom, perihepatisches Hämatom

A. S. / w / 73 Jahre

IV

Duodenalperforation, Pneumonie, Exitus letalis

P. K. / m / 53 Jahre

IV

systemische Candida-Infektion

W. A. / m / 70 Jahre

IV

tiefe Beinvenenthrombose

In Tabelle 13 sind perioperative Kriterien wie stationäre Aufenthaltsdauer, Dauer des Aufenthaltes auf der Intensivstation, Operationsdauer, die Dauer des kardiopulmonalen Arrests und die Anzahl der intraoperativ transfundierten Erythrozytenkonzentrate aufgeführt.

Tab. 13)Peri- und postoperative Ergebnisse aller Patienten (n=24).

 

Median

Min. – Max.

prä- und postop. stationäre Aufenthaltsdauer (Tage)

29

14 – 54

Intensivstation (Tage)

4

1 – 19

OP-Dauer (Stunden:Minuten)

6:18

3:05 – 11:50

kardiopulmonaler Arrest (Minuten, n=11)

20

9 – 35

intraop. transfundierte Ery-Konzentrate (Anzahl)

11,5

4 – 84

Progression und Überleben der Patienten

Das kalkulierte Überleben aller Patienten (n=24) ab Operation ist in Abbildung 8 dargestellt. Das mediane Überleben betrug 45 Monate und unterschied sich damit nicht signifikant von den Patienten der Kontrollgruppe ohne Vena-cava-Zapfen mit 50 Monaten. Das mediane progressionsfreie Intervall in der Zapfen-Gruppe lag bei 10 Monaten und war damit signifikant kürzer als in der Kontrollgruppe mit 15 Monaten (p=0,0302, Log-Rank-Test, Daten nicht [Seite 61↓]gezeigt). Die Ein-, Drei- und Fünf-Jahres-Überlebensraten der gesamten Gruppe betrugen 92 %, 57 % und 33 %.

Abb. 8)Überlebensanalyse der 24 Patienten mit venösen Tumorthromben im Vergleich zu den 75 Patienten der Kontrollgruppe. Das mediane Überleben unterschied sich nicht signifikant (50 Monate ohne Zapfen vs. 45 Monate mit Zapfen, p=0,3522, Log-Rank-Test).

Von den 20 Patienten, die zum Zeitpunkt der Operation keine metastasierte Erkrankung aufwiesen, entwickelten 14 in der weiteren Nachbeobachtung Fernmetastasen. Damit waren 18 von 24 Patienten im metastasierten Stadium (75 %). Von den 18 Patienten erhielten 7 eine Chemoimmuntherapie (CIT). Die anderen 11 Patienten, deren Nachbetreuung nicht in unserer Klinik stattfand, wurden nicht mit einer systemischen Immuntherapie behandelt. Von den 11 Patienten erfolgte bei 2 Patienten die operative Entfernung von Metastasen und ein Patient wurde bestrahlt. Die Ein- und Drei-Jahres-Überlebensraten zwischen den Gruppen unterschieden sich signifikant. Das mediane Überleben der behandelten Patienten war mit 37 Monaten signifikant gegenüber den nicht behandelten Patienten mit 10 Monaten verlängert (siehe Abbildung 9). Die Ein- und Drei-Jahres-Überlebensraten in der Gruppe mit Chemoimmuntherapie betrugen 86 % und 64 % und in der Gruppe ohne Therapie 36 % und 36 %. Beide Kurven unterschieden sich signifikant im Breslow-Test (p=0,05) und marginal im Log-Rank-Test (p=0,1270).


[Seite 62↓]

Abb. 9)Überlebenswahrscheinlichkeit bei 18 metastasierten Patienten. Das mediane Überleben betrug 37 Monate mit Chemoimmuntherapie (CIT) vs. 10 Monate ohne CIT. Die Unterschiede waren im Log-Rank-Test marginal signifikant (p=0,1270). Im Breslow-Test wurde das Signifikanzniveau erreicht (p=0,0500).

Multivariate Analyse

Die Evaluierung statistisch unabhängiger Prognosefaktoren wurde durch eine multivariate Analyse mittels Cox-Regression durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 dargestellt. Lediglich das Auftreten von Metastasen (p=0,002) erwies sich als statistisch relevanter Prognosefaktor mit einem signifikanten Einfluss auf das Überleben der Patienten. Lymphknotenstatus und Vena-cava-Befall (Stadium III und IV) hatten keine signifikante prognostische Wertigkeit.

Tab. 14)Multivariate Analyse zum Einfluss verschiedener Faktoren auf das Überleben der Patienten (* = signifikant).

Faktor

p-Wert

relatives Risiko

95 % CI

M1

0,002*

2,6

1,4 – 4,8

Vena-cava-Zapfen

0,259

1,4

0,8 – 2,8

N+

0,624

1,2

0,5 – 2,8


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4.1.4.  Tumor M2-Pyruvatkinase (TU M2-PK) beim Nierenzellkarzinom

Zur Charakterisierung der diagnostischen Wertigkeit der tumorspezifischen Form der Pyruvatkinase (TU M2-PK) erfolgte zunächst die Bestimmung dieses biologischen Markers bei Patienten mit lokalisierten und metastasierten urologischen Tumoren und im Vergleich dazu bei Patienten mit einer BPH in einer ersten Serie.

In der zweiten Serie erfolgte die Messung der TU M2-PK als begleitende Untersuchung bei Patienten, bei denen eine Chemoimmuntherapie durchgeführt wurde, um die Eignung des Biomarkers als Verlaufsparameter beim metastasierten NZK zu ermitteln.

In der ersten Serie bestanden keine statistisch signifikanten Differenzen in der Gruppe gesunder Probanden zwischen Frauen (22,0 ± 9,7 kU/l) und Männern (22,3 ± 17,1 kU/l), so dass die beiden Gruppen als eine Kontrollgruppe (22,1 ± 13,4 kU/l) zusammengefasst werden konnten. Es bestand eine Normalverteilung (p<0,05, Kolmogorov-Smirnov-Test). Die 95%ige obere Referenzgrenze betrug 44,2 kU/l.

Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die Daten der Patienten mit Nierenzell-, Urothel- und Prostatakarzinomen sowie benignen Prostatahyperplasien analysiert und in Abbildung 10 dargestellt.

Abb. 10)Übersicht der Konzentrationen der TU M2-PK im Plasma von Kontrollpersonen und Patienten mit BPH, Prostatakarzinom (PCA), Urothelkarzinom (UCA) und Nierenzellkarzinom (NZK), (m – metastasiert). Es sind Einzelwerte und Mediane dargestellt. Signifikante Unterschiede bestanden nur bei den Nierenzellkarzinomgruppen untereinander und zu den Kontrollpersonen.


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Der einzige statistische Unterschied zwischen gesunden Kontrollen und den anderen Gruppen wurde beim NZK detektiert. Beim lokalisierten, nicht-metastasierten NZK war die TU M2-PK signifikant erhöht (39,0 ± 19,9 kU/l vs. 22,1 ± 13,4 kU/l, Median von 34,0 kU/l vs. Median von 19,5 kU/l, p < 0,001). Beim metastasierten NZK waren die Unterschiede noch deutlicher und signifikante Erhöhungen des Markers bestanden sowohl für die Kontrollgruppe (56,3 ± 21,8 kU/l vs. 22,1 ± 13,4 kU/l, Median von 55,0 kU/l vs. Median von 19,5 kU/l, p < 0,001), aber auch zur Gruppe des nicht-metastasierten NZK (56,3 ± 21,8 kU/l vs. 39,0 ± 19,9 kU/l, Median von 55,0 kU/l vs. Median von 34,0 kU/l,p < 0,05).

Es bestand eine zusätzliche, signifikante Abhängigkeit des Markers zur T-Klassifikation des Primärtumors. Bei Patienten mit einem T2-NZK betrug die TU M2-PK 32,4 ± 10,4 kU/l im Vergleich zu 51,9 ± 34,1 kU/l bei Patienten mit einem T3-Karzinom (p < 0,05).

Basierend auf der 95%igen oberen Referenzgrenze lag die Sensitivität der TU M2-PK beim nicht-metastasierten NZK jedoch nur bei 27,5 %, beim metastasierten NZK betrug die Sensitivität 66,7 %.

Für die beiden anderen urologischen Tumorentitäten konnten keine signifikanten Unterschiede, sowohl bei der nicht-metastasierten, als auch bei der metastasierten Erkrankung festgestellt werden (siehe Abbildung 10). Bei Patienten mit BPH bestanden ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe bzw. zur Gruppe der Patienten mit Prostatakarzinomen.

In der zweiten Untersuchungsserie konnten TU M2-PK-Werte von insgesamt 68 Patienten mit metastasierten NZK nach Tumornephrektomie und vor Behandlung der Metastasen analysiert werden. Die Daten wurde hinsichtlich der Anzahl positiver, d.h. oberhalb des angegebenen Cut-off von 15 kU/l gelegener Werte, dem Unterschied zwischen synchroner und metachroner Metastasierung, der Tumormasse, dem Geschlecht der Patienten, der Anzahl befallener Organsysteme, dem histologischen Subtyp, dem Grading des Primärtumors und der Relation zwischen dem Tumormarker und dem Ansprechen auf die Therapie hin untersucht.

Der Mittelwert der TU M2-PK betrug bei den insgesamt 68 Patienten 32,4 kU/l ± 35,5 kU/l (Median von 22,9 kU/l). Bei 48 Patienten waren die Werte höher als der empfohlene Cut-off von 15 kU/l (Sensitivität 71 %) und haben damit die metastasierte Erkrankung detektiert (siehe Abbildung 11).


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Abb. 11)Darstellung aller 68 TU M2-PK-Werte (Einzelwerte und Median). Bei 48 Patienten lag der Wert oberhalb des empfohlenen Cut-offs von 15 kU/l, was einer Sensitivität von 71 % entspricht.

Es konnte ein signifikanter Unterschied hinsichtlich der zellulären Differenzierung zwischen G2 und G3 Nierenkarzinomen nachgewiesen werden (siehe Abbildung 12). Die TU M2-PK-Werte bei G2-Karzinomen lagen signifikant unter denen von G3-Karzinomen (28,2 kU/l ± 24,1 kU/l vs. 52,8 kU/l ± 55,2 kU/l, Median von 21,7 kU/l vs. Median von 37,0 kU/l, p = 0.0198, Mann-Whitney-Test).

Abb. 12)Darstellung des signifikanten Unterschiedes zwischen G2 (n = 36) und G3 (n = 18) Nierenzellkarzinomen. Bei 2 Patienten lag ein G1-Karzinom vor und bei 12 Patienten war das primäre Grading nicht bekannt.

Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den 24 Patienten mit einer synchronen Erkrankung und den 44 Patienten mit einer metachronen Erkrankung (45,1 kU/l ± 51,8 kU/l vs. [Seite 66↓]25,5 kU/l ± 19,7 kU/l, Median von 23,7 kU/l vs. Median von 22,7 kU/l). Bei 30 von 44 Patienten (68 %) waren die TU M2-PK-Werte zum Zeitpunkt der Diagnose von Metastasen über den Cut-off erhöht.

Der Unterschied zwischen Patienten mit einer geringen (n = 22) und hohen (n = 46) Tumormasse waren nur als Tendenz erkennbar (21,0 kU/l ± 12,8 kU/l vs. 37,9 kU/l ± 41,3 kU/l, Median von 21,4 kU/l vs. Median von 23,7 kU/l). Es bestanden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Anzahl der metastasierten Organsysteme, dem histologischen Subtyp des Primärtumors und dem Geschlecht der Patienten.

Tabelle 15 demonstriert die verschiedenen Sensitivitäten, die auf der Basis des empfohlenen Cut-offs berechnet wurden. Danach betrug die Sensitivität insgesamt 71 %. Die Sensitivität war am höchsten bei den nicht-behandelten Patienten (94 %), bei Patienten mit einem schlechten Grading (94 %) und bei Patienten mit einer erneuten Progression der Erkrankung nach Chemoimmuntherapie (100 %).

Tab. 15)Sensitivität der TU M2-PK bei den verschiedenen Subgruppen der Patienten.

 

n

Sensitivität

alle Patienten

68

71 %

metachrone Patienten

44

68 %

synchrone Patienten

24

75 %

unbehandelte Patienten

18

95 %

G2 Karzinome

36

61 %

G3 Karzinome

18

94 %

behandelte Patienten

50

62 %

erneute Progression

9

100 %

Die Analyse der TU M2-PK-Verläufe unter Chemoimmuntherapie war eine weiterer, wesentlicher Aspekt der zweiten Untersuchungsreihe. Die nach jedem Therapiezyklus durchgeführten Staging-Untersuchungen der 50 Patienten ergaben bei 4 Patienten komplette Remissionen (CR), bei 8 Patienten partielle Remissionen (PR) und bei 26 Patienten einen stabilen Erkrankungsverlauf. 12 Patienten sprachen auf die Chemoimmuntherapie primär nicht an (PD). Von den 4 CR-Patienten waren 3 primär TU M2-PK-negativ und blieben auch im weiteren Zeitraum der Nachbeobachtung negativ (Daten nicht dargestellt). Die Daten bei den 8 [Seite 67↓]PR-Patienten zeigten im Verlauf eine Tendenz zu absteigenden Werten der TU M2-PK, die Unterschiede waren jedoch über den Verlauf von 8 Monaten nicht signifikant (siehe Abbildung 13a). Bei den Patienten mit einer Stabilisierung blieben die TU M2-PK-Werte, entsprechend der radiologischen Ergebnisse der Staging-Untersuchungen über 8 Monate unverändert (siehe Abbildung 13b). Die Patienten mit einer Progression unter Chemoimmuntherapie wiesen keine signifikanten Veränderungen des Tumormarkers über den Zeitraum von 5 Monaten auf (siehe Abbildung 13c).


[Seite 68↓]

Abb. 13)Verläufe der TU M2-PK Untersuchungen unter Chemoimmuntherapie, 13a – Patienten mit PR, 13b – Patienten mit SD, 13c – Patienten mit PD, in Klammern die jeweilige Probenanzahl zum Untersuchungszeitpunkt.

Bei 9 Patienten kam es nach Chemoimmuntherapie zu einer erneuten Progression der Erkrankung. Diese Patienten wiesen alle TU M2-PK-Werte oberhalb des Cut-offs von 15 kU/l auf (Mittelwert 53,2 kU/l ± 36,3 kU/l, Median von 31,0 kU/l, Sensitivität 100 %, siehe Tabelle 15).

Auf der Basis der Verlaufsuntersuchungen wurde der positive Vorhersagewert (positiver prädiktiver Wert), definiert als Relation der Anzahl richtig positiver Werte während der Nachbeobachtung zu der Anzahl aller Werte der Nachbeobachtung inklusive falsch positiver Werte, berechnet. Als falsch positive Werte wurden diejenigen Werte bezeichnet, bei denen keine Korrelation mit den Resultaten der Staging-Untersuchungen vorlagen. Der positive prädiktive Wert der Verlaufsuntersuchungen für alle Patienten (n = 50) betrug 0,68.


[Seite 69↓]

4.2.  Experimenteller Teil

4.2.1. Zellmembranexpression des induzierbaren 72 kDa Hitzeschockproteins beim Nierenzellkarzinom

Die Untersuchungen hatten das Ziel, die basale und stressinduzierte Zellmembranexpression des induzierbaren 72 kDa HSP auf Zelllinien und Primärkulturen zu untersuchen und Zusammenhänge zwischen der HSP72-Membranexpression und der Lyse durch IL-2-stimulierter NK-Zellen herzustellen.

Zunächst wurden Untersuchungen an den Zelllinien ACHN (humanes Nierenzellkarzinom) und PC-3 (humanes Prostatakarzinom) durchgeführt. Die Induktion der HSP-Synthese erfolgte durch eine Hyperthermieexposition von 41,8 °C für 180 Minuten mit einer Erholungsphase von 16 bis 18 Stunden.

Nach nicht-letaler Hyperthermieexposition konnte an ACHN, kaum jedoch an PC-3-Zellen durchflusszytometrisch eine HSP72-Expression auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Abbildung 14 zeigt charakteristische Beispiele für beide Zelllinien.

Abb. 14)Logarithmische Darstellung der Fluoreszenzintensität bei ACHN und PC-3 Zellen nach nicht-letaler Hyperthermieexposition von 41,8 °C für 180 Minuten (___) im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (·····). Während bei ACHN Zellen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität zu verzeichnen war, blieb das Signal bei PC-3 Zellen nahezu unverändert.

Die durchflusszytometrischen Daten der ACHN Zellen konnten durch Western-Blots mit aufgereinigten Zellmembranfraktionen bestätigt werden. Abbildung 15 zeigt die entsprechenden Ergebnisse.


[Seite 70↓]

Abb. 15)HSP72-Western-Immunoblots von einem Lysat hyperthermierter ACHN-Zellen als positive Kontrolle (nach Hyperthermie von 43,5 °C für 60 Minuten (A) und gepoolter Membranfraktionen von ACHN-Zellen nach nicht-letaler Hyperthermie von 41,8 °C für 180 Minuten (B). Die Erholungsphase betrug jeweils 16 Stunden. Säule S repräsentiert molekulare Markerproteine als Standard.

In weiteren Versuchen wurde die Abhängigkeit der HSP72-Membranexpression von einer passiven Inkubation mit HSP72 untersucht. Die passive Inkubation von ACHN-Zellen erfolgte mit einem Lysat hyperthermierter ACHN-Zellen, um den möglichen Einfluss einer passiven Anlagerung von HSP72 an die Zellmembranen intakter, hyperthermierter Zellen zu prüfen. Die Ergebnisse sind als linearisierter Mittelwert der Fluoreszenzintensität in Prozent bezogen auf die Kontrolle von jeweils 3 unabhängigen Experimenten in Abbildung 16 dargestellt.

Abb. 16)Darstellung der linearisierter Mittelwerte der Fluoreszenzintensitäten als Prozent bei Kontrollen und hyperthermierten ACHN-Zellen und jeweiliger passiver Inkubation mit HSP72. Die Fluoreszenzintensität der Kontrollen wurde 100 % gesetzt. Es konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden zwischen den hyperthermierten Zellen und den Zellen, die neben der Hyperthermie noch passiv mit HSP72 inkubiert worden waren.

Nachfolgend wurde die zeitliche Dynamik der HSP72-Membranexpression auf den ACHN-Zellen untersucht. Hierzu wurden die Zellen mit einer Hyperthermie von 41,8 °C für 180 Minuten behandelt und nach 0, 2, 4, 8, 12, 16, 24 und 48 Stunden gesammelt, durchflusszytometrisch untersucht und mit nicht-hyperthermierten Kontrollzellen verglichen. [Seite 71↓]Die Ergebnisse sind in Abbildung 17 als linearisierte Mittelwerte der Fluoreszenzintensität in Prozent bezogen auf den Ausgangswert nicht-hyperthermierter Kontrollzellen dargestellt.

Abb. 17)Zeitliche Dynamik der HSP72-Membranexpression auf ACHN-Zellen gemessen zwischen 0 bis 48 Stunden nach Hyperthermiebehandlung. Es zeigte sich ein Maximum im Bereich von 8 bis 16 Stunden (K=nicht-hyperthermierte Kontrolle).

Um zu überprüfen, ob die Hyperthermieapplikation einen Einfluss auf die Präsentation von MHC-Molekülen und damit potentiell auf die Lyse durch NK-Zellen hat, wurde der zeitliche Verlauf der MHC-Expression nach Hyperthermieexposition mit dem gleichen Protokoll ermittelt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 18 dargestellt.

Abb. 18)Zeitliche Dynamik der MHC-Expression auf ACHN-Zellen zwischen 0 bis 48 Stunden. Der Vergleich mit dem Ausgangswert nicht-hyperthermierter Zellen (K) zeigt, dass es insbesondere zum den Zeitpunkten 0 und 2 Stunden zu einem Abfall der MHC-Expression kommt. Aufgrund von nur 2 Einzelexperimenten pro Zeitpunkt lag statistische Signifikanz nicht vor.

In weiterführenden Experimenten wurden NK-Zellen von zwei gesunden Probanden durch negative Selektion angereichert, für 72 Stunden in IL-2 kultiviert und für Lyseexperimente [Seite 72↓]genutzt. Die Abbildung 19 demonstriert das durchflusszytometrische Ergebnis der NK-Zellanreicherung für 2 charakteristische Versuche.

Abb. 19)Anreicherung von NK-Zellen aus peripherem Blut (PBL=periphere Blutlymphozyten) durch negative Selektion und Nachweis mit der Simultest-Lösung (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Bei Proband 1 gelang eine Anreicherung von 14,6 % auf 76,8 % (obere Bilder) und bei Proband 2 von 14,0 % auf 87,5 % (untere Bilder).

Die Ergebnisse der Lyseexperimente sind nachfolgend dargestellt. Hierzu wurden nach 3tägiger Inkubation mit IL-2 die NK-Zellen mit hyperthermierten und nicht-hyperthermierten ACHN- oder PC-3-Zellen in verschiedenen Effektor- und Zielzellkonzentrationen koinkubiert und dann die Zielzelllyse mit einem Assay bestimmt, das auf der LDH-Freisetzung aus den Zielzellen beruht.


[Seite 73↓]

Abb. 20)Lyseexperimente mit hyperthermierten und nicht-hyperthermierten ACHN- und PC-3-Zellen als Zielzellen und IL-2-stimulierten NK-Zellen von 2 Probanden
( Kontrolle, Hyperthermie, mAb-blockiert).

HSP72-positive, hyperthermierte Zellen wurden signifikant stärker lysiert als die nicht-hyperthermierten Kontrollen (ANOVA, Mann-Whitney-Test, p<0,05). Wenn HSP72 mit einem monoklonalen Antikörper neutralisiert wurde, ging die Lyse wieder fast auf das Ausgangsniveau zurück. Bei den HSP72-negativen PC-3-Zellen gab es zwischen hyperthermierten und nicht-hyperthermierten Zellen keine Unterschiede.

Auf der Basis der an der Nierenkarzinomlinie nachgewiesenen Präsenz des stressinduzierbaren HSP72 auf der Zelloberfläche und der damit verbundenen erhöhten Lyse durch IL-2-stimulierte NK-Zellen erfolgte in weiteren Untersuchungen die Analyse von HSP72 auf der Zelloberfläche von kurzzeitkultivierten primären Nierenkarzinomzellen. Insgesamt wurden die Tumorzellen von 29 Patienten untersucht. Bei 16 von den 29 Patienten wurden gleichzeitig auch normale renale Zellen untersucht. Die epitheliale Herkunft der Tumor- und Normalzellen wurde [Seite 74↓]immunhistochemisch mit einem anti-Zytokeratin-18-Antikörper bei jeder 5. Probe verifiziert (Daten nicht gezeigt).

Die Abbildung 21 demonstriert die durchflusszytometrischen Ergebnisse von zwei repräsentativen Einzelzellsuspensionen von Tumorzellen jeweils basal und nach nicht-letaler Hyperthermieexposition von 41,8 °C für 3 Stunden.

Abb. 21)Darstellung der basalen und hyperthermieinduzierten HSP72-Expression auf Nierenkarzinomzellen. Bei Probe 1 lässt sich eine deutliche basale Expression mit einer nochmaligen Steigerung nach Hyperthermie im Vergleich zur Isotyp-Kontrolle nachweisen. Bei Probe 2 ist die basale Expression gering, nach Hyperthermie kommt es jedoch auch hier zu einem Anstieg der Fluoreszenzintensität.

Für insgesamt 29 Einzelzellsuspensionen von Karzinomzellen wurden entsprechende Untersuchungen durchgeführt und die basale und hyperthermieinduzierte HSP72 Expression im Vergleich zu Isotyp-Kontrollen ermittelt. Abbildung 22 zeigt die Daten der 29 Proben.


[Seite 75↓]

Abb. 22)Basal wiesen 27 Proben eine HSP72-Expression im Vergleich zu den Isotyp-Kontrollen auf. Die Hyperthermieexposition führte zu einer signifikanten Steigerung der HSP72-Expression (p<0,0001, Wilcoxon-matched-pairs-Test).

Des Weiteren wurde aus den Basisdaten das Ausmaß der HSP-Induktion berechnet (siehe Abbildung 23).

Abb. 23)Aus den Daten der basalen und stressinduzierten HSP72-Expression wurde der jeweilige Faktor der Intensitätserhöhung ermittelt (0- bis 13,3fach).

Die Daten wurden weiterhin auf Zusammenhänge mit der TNM-Klassifikation und dem Grading des Primärtumors untersucht. Bezüglich N-Kategorie und Grading gab es keine signifikanten Beziehungen. Bei der T-Kategorie gab es Unterschiede zwischen T1 und T2/3 Nierenzellkarzinomen. T2/3 Tumoren wiesen basal eine tendenziell, und nach Hyperthermie eine signifikant höhere HSP72-Membranexpression auf (siehe Abbildung 24). Das Ausmaß der Induktion war von der T-Kategorie unabhängig.


[Seite 76↓]

Abb. 24)HSP72-Membranexpression in Abhängigkeit von der T-Kategorie (Mann-Whitney-Test, p=0,0079).

Bei einer Metastasierung zeichnete sich eine tendenziell geringere basale HSP72-Expression ab. Die Unterschiede waren signifikant nach Hyperthermieapplikation (siehe Abbildung 25). Auch hier ergab sich kein Zusammenhang zum Faktor des Anstieges der HSP72-Expression.

Abb. 25)HSP72-Membranexpression in Abhängigkeit von der Metastasierung (Mann-Whitney-Test, p=0,0313).

Des Weiteren wurde untersucht, ob die HSP72-Membranexpression einen Einfluss auf das Überleben der Patientengruppe haben könnte. Dabei wurden die basale und die Hyperthermie-induzierte Membranexpression sowie der Faktor des Anstieges analysiert.

Unter Anwendung verschiedener Cut-offs ergaben sich keine signifikanten Beziehungen zwischen dem Überleben und der basalen HSP72-Expression sowie dem Faktor der HSP-Induktion.


[Seite 77↓]

Dagegen war bei einem Cut-off von > 100 % die Hyperthermie-induzierte HSP72-Expression mit einem signifikant verlängerten Überleben assoziiert (siehe Abbildung 26, p=0,0369, Log-Rank-Test).

Abb. 26)Überleben der Patienten in Abhängigkeit der hyperthermieinduzierten HSP72-Membranexpression. Das mediane Überleben betrug 66 Monate in der Gruppe HSP72 < 100 % und wurde in der anderen Gruppe in der Nachbeobachtungsphase nicht erreicht p=0,0369, Log-Rank-Test).

Die Expression von MHC-Molekülen wurde ebenfalls untersucht. Hier zeigten sich keine signifikanten Veränderungen zwischen nicht-behandelten und hyperthermierten Zellen (Abbildung 27, p=0,4143).

Abb. 27)Darstellung der basalen und Hyperthermie-induzierten Expression (41,8 °C für 180min) von MHC-Molekülen an Nierenkarzinomzellen. Die Unterschiede sind nicht signifikant (p=0,4143, Wilcoxon-matched-pairs-test).


[Seite 78↓]

Es wurden zusätzlich 15 benigne Proben bezüglich der HSP72-Expression untersucht. Diese Proben repräsentieren gesundes Nierengewebe. Abbildung 28 zeigt, dass auch bei diesen Proben eine basale und Hyperthermie-induzierte HSP72-Expression nachzuweisen war.

Abb. 28)Basale und stressinduzierte HSP72-Expression an benignen epithelialen Nierenzellen (p=0,0302, Wilcoxon-matched-pairs-test).

4.2.2. Zytoplasmatische Expression des induzierbaren 72 kDa Hitzeschockproteins beim Nierenzellkarzinom

In der vorliegenden Untersuchung wurden 53 Präparate von Patienten mit Nierenzellkarzinomen und 10 Präparate von Metastasen des NZK und 17 tumorfreie Präparate mit Normalgewebe immunhistochemisch bezüglich der Expression von HSP72 untersucht.

In den Präparaten mit normalen Gewebeabschnitten waren die Tubuluszellen konstant angefärbt. Vereinzelt wurden auch solitäre Zellen in den Glomerula angefärbt. Alle anderen Strukturen des normalen Nierengewebes zeigten keine HSP72-Expression.

Das Nierenzellkarzinomgewebe wies eine heterogene HSP72-Expression auf. Das Verhalten in den Metastasen vom NZK zeigte ein ähnliches Expressionsmuster.

Die nachfolgenden Abbildungen demonstrieren die unterschiedlich starken anti-HSP72-Anfärbungen in normalem Nierengewebe und in den beschriebenen 4 Ausprägungsgraden in Karzinomarealen (siehe Kapitel 3.6.4, Seite 40), und am Beispiel einer repräsentative Metastase.


[Seite 79↓]

Abb. 29)Darstellung repräsentativer Färbungen in Nierengewebe je nach Ausprägungsgrad (200fache Vergrößerung): a – Normalgewebe mit HSP72-Expression in den Tubulusepithelzellen; b – Karzinomgewebe ohne HSP72-Expression (Intensitätsgrad 0); c – Karzinomgewebe mit schwacher Expression (Intensitätsgrad 1), d – Karzinomgewebe mit mäßiger Expression (Intensitätsgrad 2); e – Karzinomgewebe mit starker Expression (Intensitätsgrad 3); f – pulmonale Metastase mit starker Expression (Intensitätsgrad 3).

In der weiteren Auswertung wurden die arithmetischen Mittelwerte der HSP72-Expression verwendet und mit Tumor- und Patientenparametern korreliert.

Die mittlere HSP72-Expression im Karzinomgewebe der 53 Proben betrug 1,47 ± 0,7. Im Vergleich dazu lagen die Werte bei den 10 Metastasen (5 Lungenmetastasen, 3 ossäre Metastasen, eine Metastase in der Restniere und eine Metastase im Omentum majus) bei 1,54 ± [Seite 80↓]0,69. Es bestand kein signifikanter Unterschied zwischen den Primärtumoren und den Metastasen.

Es bestand keine Korrelation zwischen der HSP72-Expression und dem Alter bzw. dem Geschlecht der Patienten (Daten nicht gezeigt).

Ebenso zeigten sich keine signifikanten Zusammenhänge zwischen der HSP72-Expression und der T-Kategorie sowie dem Grading des Primärtumors (Daten nicht gezeigt).

Auch der histologische Typ (hellzellige versus nicht-hellzellig) wies keine signifikanten Beziehungen zur HSP72-Expression auf (Daten nicht gezeigt).

Bezüglich der Metastasierung wurden einerseits Patienten mit Lymphknotenmetastasen und andererseits Patienten mit Fernmetastasen unterschieden.

Bei Patienten mit Lymphkotenmetastasen war die HSP72-Expression nicht signifikant gegenüber Patienten ohne Lymphknotenmetastasen verändert.

Signifikante Unterschiede fanden sich jedoch beim Vergleich von Patienten ohne Fernmetastasen gegenüber Patienten, die zum Zeitpunkt der Erstdiagnose oder im weiteren Verlauf der Erkrankung Fernmetastasen entwickelten. Die 17 Patienten ohne Metastasen wiesen signifikant höhere Werte der HSP72-Expression auf als 36 Patienten mit Metastasen (Mittelwert von 1,85 ± 0,41 vs. Mittelwert von 1,29 ± 0,74). Das Signifikanzniveau betrug im Mann-Whitney-Test 0,0052 (siehe Abbildung 30).

Abb. 30)Darstellung der HSP72-Expression bei Patienten ohne (M0) und mit (M1) Fernmetastasen. Es wurden Einzelwerte und Mediane abgebildet.

Zusätzlich wurden die 10 untersuchten Metastasen mit der jeweiligen HSP72-Expression der korrespondierenden 6 Primärkarzinome verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 [Seite 81↓]dargestellt. Zwischen Primärkarzinomen und Metastasen konnten keine signifikanten Unterschiede ermittelt werden (Mann-Whitney-Test, p=0,2198).

Tab. 16) Darstellung der HSP72-Expression von Metastasen und den korrespondierenden Primärtumoren.

Kategorie

N

Mittelwert

SD

Median

Min - Max

M1

10

1,54

0,69

1,60

0,2 – 2,3

Primär-NZK

6

1,1

0,91

0,85

0,3 – 2,8

In weiteren Auswertungen wurde die HSP72-Expression der Primärtumoren von 24 Patienten mit einer metastasierten Erkrankung untersucht, die eine Chemoimmuntherapie mit IL-2, IFN-α2a und 5-FU erhalten hatten. Bei den 24 Patienten wurden 4 CR (16,6 %) und 2 PR (8,4 %) erzielt. Die Rate objektiver Remissionen betrug 25,0 % mit einer medianen Dauer von 17 Monaten. Bei 18 Patienten wurden keine objektiven Remissionen registriert, 13 Patienten (54 %) hatten einen stabilen Erkrankungsverlauf mit einem medianen progressionsfreien Intervall von 8 Monaten. Bei 5 Patienten (21 %) sprach die Therapie nicht an. Die HSP72-Expression bei den 6 Patienten mit einer Remission war signifikant erhöht gegenüber 18 Patienten ohne Remission (Mittelwert von 1,78 ± 0,65 vs. Mittelwert von 0,99 ± 0,72, p=0,0255, Mann-Whitney-Test). In Abbildung 31 sind die Werte für die 24 Patienten angegeben

Abb. 31)Patienten mit objektiven Remissionen wiesen eine signifikant höhere HSP72-Expression auf, als Patienten die stabil blieben oder nicht auf die Therapie ansprachen. Es wurden Einzelwerte und Mediane abgebildet.


[Seite 82↓]

Auf der Basis der signifikanten Ergebnisse zwischen den Patienten mit einer Metastasierung und denen mit einer Chemoimmuntherapie wurden eine ROC-Analyse für beide Gruppe durchgeführt, um Cut-offs der HSP72-Expression für die eine jeweils 90 und 95%ige Sensitivität und Spezifität und die maximale Effizienz zu berechnen. Die Daten sind in den Tabellen 17 und 18 dargestellt.

Tab. 17)Beziehung zwischen Sensitivität und Spezifität verschiedener HSP72-Cut-offs für das Gesamtüberleben.

 

Kalkulation für Cut-off =

Sensitivität

Spezifität

Effizienz

max. Effizienz

1,4

0,84

0,73

0,78

Sensitivität 90 %

1,5

0,89

0,63

0,73

Spezifität 90 %

0,9

0,52

0,9

0,75

Sensitivität 95 %

1,7

0,95

0,57

0,71

Spezifität 95 %

0,7

0,42

0,97

0,75

Tab. 18)Beziehung zwischen Sensitivität und Spezifität verschiedener HSP72-Cut-offs für das Ansprechen auf eine Chemoimmuntherapie (CR/PR vs. SD/PD).

 

Kalkulation für Cut-off =

Sensitivität

Spezifität

Effizienz

max. Effizienz

1,4

0,83

0,83

0,83

Sensitivität 90 %

1,7

0,89

0,5

0,79

Spezifität 90 %

1,4

0,83

0,83

0,83

Da die ROC-Analyse bei einem HSP72-Cut-off von 1,7 (Fettdruck in den Tabellen 17 und 18) und mit einer Sensitivität von 95 bzw. 90 % gute Ergebnisse für die Spezifität und die Effizienz ergab, wurde dieser Cut-off für die Berechnungen des Einflusses der HSP72-Expression auf das Überleben der Patienten zu Grunde gelegt.

Mit uni- und multivariaten Analysen wurde anschließend der Einfluss verschiedener Parameter, wie:

auf die Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten (n=52) untersucht.

In der univariaten Analyse erwiesen sich die T-Kategorie (p=0,0263, Log-Rank-Test), der Metastasierungsstatus (p=0,0004, Log-Rank-Test) und die HSP72-Expression (p=0,0040, Log-Rank-Test) als signifikant. Des Weiteren hatte die HSP72-Expression einen signifikanten Einfluss auf jene Patienten, die eine Chemoimmuntherapie erhalten hatten (p=0,0454, Log-Rank-Test). Die Daten sind in den Abbildungen 32 bis 35 dargestellt.

Abb. 32)Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der T-Kategorie mit Angabe der Patienten „at risk“. Das mediane Überleben für die Gruppe T1/2 wurde nicht erreicht. Es lag in der Gruppe T3/4 bei 43 Monaten, (p=0,0216, Log-Rank-Test).


[Seite 84↓]

Abb. 33)Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der Metastasierung mit Angabe der Patienten „at risk“. Das mediane Überleben für die Gruppe M0 wurde nicht erreicht. Es lag in der Gruppe M1 bei 43 Monaten, (p=0,0004, Log-Rank-Test).

Abb. 34)Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der HSP72-Expression mit Angabe der Patienten „at risk“. Das mediane Überleben für die Gruppe HSP72 > 1,7 wurde nicht erreicht. Es lag in der Gruppe HSP72 < 1,7 bei 43 Monaten, (p=0,0040, Log-Rank-Test).


[Seite 85↓]

Abb. 35)Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit bei Patienten, die eine Chemoimmuntherapie erhalten hatten in Abhängigkeit der HSP72-Expression mit Angabe der Patienten „at risk“. Das mediane Überleben für die Gruppe HSP72 > 1,7 wurde nicht erreicht. Es lag in der Gruppe HSP72 < 1,7 bei 14 Monaten (p=0,0454, Log-Rank-Test). Das Ansprechverhalten wurde in dieser Darstellung nicht berücksichtigt. Bei 3 der 5 Patienten mit einem HSP-Wert > 1,7 traten jedoch objektive Remissionen unter Chemoimmuntherapie auf.

Die Ergebnisse der multivariaten Analyse sind in Tabelle 19 dargestellt. Es zeigte sich, dass die HSP72-Expression neben der T-Kategorie und dem Grading als unabhängiger prognostischer Faktor mit dem höchsten Signifikanzniveau einen signifikanten Einfluss auf das Überleben der Patienten hatte (p=0,019). Die Metastasierung führte bei der geringen Anzahl von Patienten mit vielen zensierten Werten und der Tatsache, dass in der Gruppe der nicht-metastasierten Patienten kein Event (Todesfall) bei den Patienten auftrat, in der Cox-Regression nicht zu plausiblen Ergebnissen. Für die Metastasierung konnte die Cox-Regression daher nicht angewandt werden [70,212].

Mit einer Kreuztabelle (siehe Tab. 20) kann jedoch demonstriert werden, dass eine hochsignifikante Korrelation zwischen der HSP72-Expression und dem Metastasierungsstatus bestand (p=0,001, Mantel-Haenszel-Test). Eine geringe HSP72-Expression war hochgradig mit dem Auftreten von Metastasen assoziiert. Bei 23 von 25 Patienten mit einem HSP72-Wert unterhalb des Cut-offs traten Metastasen auf.


[Seite 86↓]

Tab. 19)Multivariate Analyse (* = signifikant).

Faktor

p-Wert

relatives Risiko

95 % CI

HSP72-Expression

0,004*

6,467

1,818 – 23,009

T-Kategorie

0,031*

5,104

1,157 – 22,507

Grading

0,043*

2,766

1,032 – 7,413

Tab. 20)Kreuztabelle (HSP72-Expression und Metastasierungsstatus, p=0,001, Mantel-Haenszel-Test).

 

HSP72 > 1,7

HSP72 < 1,7

Summe

M0

14

2

16

M1

13

23

36

Summe

27

25

52

4.2.3. Anreicherung von HSP70-Peptid-Komplexen

Ein grundlegendes Problem bei der klinischen Anwendung von HSP70-Peptid-Komplexen als Tumorvakzine besteht in der Notwendigkeit des Vorhandenseins einer ausreichenden Menge von Tumorzellen für die HSP70-Peptid-Aufreinigung. Das Tumorgewebe wird in der Regel aus dem Primärtumor oder Metastasen nach chirurgischer Extirpation bzw. aus Punktionsmaterial gewonnen. In diesem Ergebnisteil erfolgt die prinzipielle Darstellung des Anreicherungsprozesses von HSP70-Peptid-Komplexen, der potentiell für Vakzinationskonzepte aber auch für weitere Peptidanalysen und die Generierung synthetischer Vakzinen Anwendung finden kann.

Unsere Arbeitsgruppe hat sich methodisch mit der Aufreinigung von HSP70-Peptid-Komplexen befasst. HSP70 benötigt zur Bindung von Peptiden ADP als Kofaktor und besitzt eine ATPase-Aktivität [106]. Wird ATP zu ADP hydrolysiert, führt dies zur Freisetzung der an HSP70 gebundenen Peptide. Methoden zur Aufreinigung von HSP70 ohne gebundene Peptide nutzen daher die Affinität von HSP70 zu ATP; das Protein kann per ATP-Affinitätschromatographie isoliert werden [143].

Die methodische Ausnutzung der ADP-Affinitätschromatographie für die Aufreinigung von immunogenen HSP70-Peptid-Komplexen aus Tumorzellen wurde von unserer Arbeitsgruppe etwa zeitgleich mit einer anderen Arbeitsgruppe etabliert und patentiert [146,177,204,205,206]. [Seite 87↓]Durch die Anreicherungsmethode besteht einerseits die Möglichkeit der effizienten und kostengünstigen Aufreinigung der Komplexe für Vakzinationszwecke, andererseits werden nach Abspaltung der an HSP70 gebundenen Peptide mit ATP diese einer weiteren Analyse zur Identifikation und Charakterisierung (z.B. Massenspektrometrie, Sequenzanalyse) zugänglich gemacht. Abbildung 36 demonstriert schematisch die einzelnen Arbeitsschritte für die Aufreinigung von HSP70-Peptid-Komplexen aus Tumorgewebe.

Abb. 36)Grundprinzip der Anreicherung von HSP70-Peptid-Komplexen

Die Untersuchungen zur Aufreinigung von HSP70-Peptid-Komplexen wurden an der murinen Melanomlinie B16-F1 durchgeführt. Abbildung 37 zeigt Western-Immunoblots von Eluaten der Affinitätschromatographie, die spezifisch gegen HSP70 gefärbt wurden.

Abb. 37)Fraktionen (1 – 12, je 1 ml) der Affinitätschromatographie mit spezifischer Färbung gegen HSP70 (Antikörper N27F3-4, Stressgen Corp., Victoria, BC, Kanada, Probeneinsatz 50 µl).

Nach erfolgreichen Voruntersuchungen zur Detektion von HSP70 im Chromatographieeluat wurde die HSP70-Peptid-Vakzine mit dem gering immunogenen murinen Melanom B16-F1 in einem prophylaktischen Vakzinationsansatz getestet. Dazu wurden syngene C57BL/6 (-H2b) Mäuse zweimal wöchentlich über 4 Wochen vakziniert. Am Beginn der dritten Behandlungswoche wurden den Tieren jeweils 105 B16-F1 Zellen injiziert. Die Messung des Tumorwachstums erfolgte bis zum 22.Tag nach Tumorzellinokulation. Die in vivo Experimente [Seite 88↓]zeigten am Ende des Beobachtungszeitraumes ein signifikant verringertes Tumorwachstum bei den vakzinierten Tieren (0,5 ± 0,24 cm² (n=6) versus 3,1 ± 0,8 cm² (n=5), ANOVA, p < 0,05) [158].

In weiteren Schritten wurden aus der humanen NZK-Linie ACHN und primärem Nierenkarzinomgewebe von Patienten HSP70-Peptid-Komplexe entsprechend des Protokolls aufgearbeitet. Abbildung 38 zeigt die Fraktionen des ADP-Affinitätschromatographieeluats exemplarisch für die Zelllinie ACHN und eine repräsentative NZK-Probe. Es ergab sich eine Anreicherung von ca. 100 bis 250 µg Protein pro g Feuchtgewicht der Tumorzellen bzw. des Tumorgewebes.

Abb. 38)Eluate der ADP-Affinitätschromatographie.

Von den im Eluat der ADP-Affinitätschromatographie enthaltenen HSP70-Peptid-Komplexen können durch die Behandlung mit ATP und anschließender Ultrafiltration (< 3 kDa) die Peptide abgetrennt, nachgewiesen und für weitere Untersuchungszwecke und Analysen zu Verfügung gestellt werden. In Abbildung 39 ist das HPLC-Spektrum bereits in Abbildung 38 aufgeführten Nierenkarzinomprobe nach der Abtrennung der Peptide von HSP70 mit ATP dargestellt.


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Abb. 39)HPLC der an HSP70-gebundenen Peptide einer Nierenkarzinomprobe nach ADP-Affinitätschromatographie, ATP-Inkubation und < 3 kDa Ultrafiltration. Das breit verschmierte UV-Profil weist auf eine hohe Komplexität der HSP70 assoziierten Peptide hin. Die Bereitstellung der Abbildung erfolgte freundlicherweise durch Herrn R. Demine und Herrn Prof. Dr. P. Walden, Klinik und Poliklinik für Dermatologie, Universitätsklinikum Charité.

Die Strukturaufklärung der in den einzelnen Fraktionen der HPLC gewonnenen Peptide kann per Massenspektrometrie und Sequenzanalyse hinsichtlich der Masse und Aminosäurensequenz erfolgen. Die immunologische Relevanz einzelner, entschlüsselter Peptide kann über die intrazelluläre IFN-γ-Freisetzung in vitro stimulierter T-Lymphozyten beurteilt werden.

Dieser methodische Ansatz erlaubt prinzipiell, identifizierte und biologisch aktive Peptide synthetisch herzustellen, erneut hinsichtlich ihrer biologischen Wirksamkeit zu prüfen und dann potentiell für Peptid- oder Protein-Peptid-Vakzinen einzusetzen.


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10.06.2004