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5.  Diskussion

5.1. Klinischer Teil

In dieser Arbeit wurden die Daten von 107 nicht-selektionierten Patienten mit metastasierten Nierenzellkarzinomen analysiert, die im Zeitraum von April 1993 bis Dezember 2001 an unserer Klinik mit einer Chemoimmuntherapie auf der Basis von subkutan appliziertem IL-2 und IFN-α2a sowie intravenös appliziertem 5-FU behandelt worden waren.

Bei 103 auswertbaren Patienten wurde eine Rate objektiver Remissionen von 22,1 % mit einer medianen Dauer von 13 Monaten, einem medianen Überleben von 19 Monaten und einer kalkulierten 5-Jahres-Überlebensrate von 17 % erzielt. Des Weiteren lagen Stabilisierungen bei einem Anteil von 46,2 % mit einer medianen Dauer von 8 Monaten vor. Damit konnte bei knapp 70 % der Patienten die progrediente Tumorerkrankung zumindest zeitweise gestoppt werden.

Die Kombination der Zytokine erfolgte auf der Basis klinischer Daten der letzten 15 bis 20 Jahre, die für IL-2 und IFN-α2a die beste Wirksamkeit als Einzelsubstanz bei der Behandlung des metastasierten NZK gezeigt haben [14,34,214]. Die zusätzliche Gabe von 5-FU wird in der Literatur kontrovers diskutiert, die Zusammenfassung bisheriger klinischer Daten deutet jedoch auf eine weitere Effektuierung durch die Dreifachkombination in Bezug auf das primäre Ansprechen auf eine Immuntherapie hin [14,34].

Die retrospektiv beobachteten objektiven Remissionen sind vergleichbar mit den Ergebnissen von Dutcher und Samland [45,164]. Dutcher erzielte bei 50 Patienten mit der Dreifachtherapie eine Rate objektiver Remissionen von 18 % mit einer medianen Dauer von 8 Monaten und einer medianen Überlebenszeit von 17,5 Monaten bei gleichen Therapieschemata jedoch unter Anwendung von IFN-α2b [45]. Bei Samland et al. lag die Rate von Remissionen in einer retrospektiven Analyse von 37 Patienten bei 19,1 % [164]. Die Überlebenswahrscheinlichkeiten waren nahezu identisch mit 70 % nach einem Jahr und 30 %, gegenüber 37 % in unserer Analyse, nach 3 Jahren. In einer weiteren Studie von Allan et al. wurde 5-FU in einer Dosierung von 200 mg/m² als kontinuierliche venöse Infusion appliziert [2]. Die Dosen von IL-2 und IFN-α2a wurden bezogen auf das von Atzpodien et al. publizierte klassische Dreifachschema, nicht verändert. In dieser Studie mit 42 Patienten wurde eine objektive Ansprechrate von 40 % mit einem medianen Überleben von 18 Monaten erreicht [2].

Unsere Therapieergebnisse sind im Vergleich nicht so hoch wie die publizierten Daten anderer deutscher Autoren, die über Ansprechraten von bis zu 40 % berichteten [15,80,108]. Ein wesentlicher Grund dafür kann im Patientenkollektiv begründet liegen, das in unserer Studie einen 20 %igen Anteil von Patienten mit einem Karnofsky-Index von unter 80 % aufwies. In [Seite 91↓]anderen Studien wurden beispielsweise nur Patienten mit einem Karnofsky-Index von mindestens 80 % rekrutiert[15,80]. Die Patienten ohne Ansprechen auf die Therapie hatte ein medianes Überleben von nur 7 Monaten, im Gegensatz dazu standen die Patienten mit einer Stabilisierung oder Remission der Erkrankung, die ein medianes Überleben von 27 Monaten aufwiesen. Samland et al. berichteten in ihrem Patientenkollektiv über ein 33monatiges medianes Überleben bei Patienten mit einer Stabilisierung oder Remission [164]. Berücksichtigt man nur die Patienten mit einer Stabilisierung, so lag hier das Überleben bei 23 Monaten. Damit kommt zum Ausdruck, dass auch Patienten mit einer Stabilisierung der Erkrankung potentiell von der Therapie im Sinne einer Überlebensverlängerung profitieren können. In unserer retrospektiven Analyse konnten wir beobachten, dass nur 31,7 % der Patienten primär nicht mit einer Remission oder Stabilisierung auf die Therapie ansprachen.

Die Ergebnisse der Drei- bzw. Vierfachtherapie mit IL-2, IFN-α2a, 5-FU und 13-CRA werden in der Literatur kontrovers diskutiert. In den USA spielt IFN-α2 kaum eine Rolle bei der Behandlung von Patienten mit metastasierten Nierenzellkarzinomen. Die Patienten werden überwiegend mit intravenös appliziertem IL-2 behandelt. Dieses Therapiekonzept wurde kürzlich als therapeutischer Standard empfohlen [56]. Ein wesentlicher Nachteil der intravenösen IL-2 Therapie ist das Auftreten einer signifikanten Anzahl von Nebenwirkungen, die teilweise eine intensivmedizinische Betreuung der Patienten notwendig machen. Es sind jedoch 5- bzw. 10-Jahres-Überlebensraten zwischen 10 bis 20 % für den intravenösen Ansatz publiziert worden [54]. Französische Arbeitsgruppen berichteten über eine geringe Effektivität der Dreifachkombination, die in prospektiven Studien getestet wurde [137,152]. Eine Multi-Center-Studie mit 131 Patienten verglich den Effekt von 5-FU auf die Kombination von IL-2 und IFN-α2a. In der Gruppe der Dreifachtherapie wurden keine CR und nur 5 PR beobachtet [137]. In einer weiteren Studie von Ravaud mit 105 auswertbaren Patienten traten nur in 1,8 % der Fälle objektive Remissionen auf [152]. Aus beiden Studien wurde geschlussfolgert, dass der angewandte Behandlungsplan von IL-2, IFN-α2a und 5-FU klinisch nicht effektiv sei.

Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass die kumulativen Dosen der Zytokine deutlich unterhalb der im klassischen Dreifachschema angewandten Dosierungen lagen. Die IL-2-Dosis pro Zyklus lag bei 80 % der in unserer Studie angewandten Dosis (216 Mio IU IL-2 versus 270 Mio IU IL-2) und die IFN-α2a Dosis betrug nur 25 % (!) der in unserem Schema eingesetzten Dosis (72 Mio IU versus 288 Mio IU). Demgegenüber erfolgte die Gabe von 5-FU nicht sequentiell in der zweiten Hälfte eines Therapiezyklus, sondern durchgängig während des gesamten Zyklus mit einer kumulativen Dosis von 6000 mg/m² und betrug damit das Doppelte [Seite 92↓]der Dosis des klassischen Schemas (3000 mg/m²). Die höheren Dosen und die kontinuierliche Gabe von 5-FU während der Therapie könnten als eine potentielle Ursache dafür gelten, dass mit diesem Behandlungsschema insgesamt schlechtere Therapieergebnisse erzielt wurden. Elias et al. berichteten über eine Remissionsrate von 11 % bei insgesamt 38 Patienten. Auch in dieser Studie war die Zytokindosierung geringer und der Behandlungsplan modifiziert [48].

Die Toxizität der Chemoimmuntherapie lag in unserer Untersuchung in einem mit aktuellen Literaturdaten vergleichbaren Bereich. Es traten bei 21 Patienten zeitweise Therapieunterbrechungen wegen persistierender WHO Grad III/IV Toxizitäten auf. Des Weiteren wurden bei 20 Patienten Dosisreduktionen vorgenommen. Insgesamt wurde die Therapie gut toleriert und konnte, bis auf Ausnahmefälle, ambulant durchgeführt werden. Dies zeigte sich auch daran, dass die mittlere Anzahl von Zyklen in unserem Patientenkollektiv bei 2,0 lag und 43 von 104 Patienten (41,3 %), unter Berücksichtigung ihres Therapieansprechens, die gesamte Behandlung mit 3 vollständigen Zyklen erhielten.

In unserer retrospektiven Auswertung wurden durch eine multivariate Analyse weiterhin Faktoren identifiziert, die mit einem kürzeren Überleben assoziiert waren. Wie aus Tabelle 10, Seite 48 hervorgeht, war insbesondere ein geringer Karnofsky-Performance-Index hochgradig mit einer schlechten Prognose assoziiert. Dies deutet auf die Bedeutung dieses Parameters auch hinsichtlich der Therapieentscheidung zur Durchführung einer Chemoimmuntherapie hin. Der Allgemeinzustand der Patienten und das Vorhandensein von Symptomen finden als prognostische Parameter breite Akzeptanz [174].

Eine weiterer Versuch zur Optimierung des Behandlungsprotokolls erfolgte durch den zusätzlichen peroralen Einsatz von 13-CRA. In vitro konnte gezeigt werden, dass 13-CRA die antiproliferativen Effekte von IFN-α verstärkt [79,192] und eine erste Studie wies auf einen positiven Einfluss von 13-CRA auf die Kombination mit IFN-α2a hin [120]. Motzer et al. testeten einer Phase-II-Studie an 44 Patienten die Kombination von IFN-α2a und 13-CRA. Von 43 auswertbaren Patienten wiesen 13 eine objektive Remission auf, was höher war, als die Ansprechrate einer historischen Patientenserie derselben Arbeitsgruppe, die mit einer IFN-α2a Monotherapie behandelt worden war [120]. Diese ermutigenden Ergebnisse konnten nachfolgend in einer prospektiven Phase-III-Studie mit 284 Patienten jedoch nicht reproduziert werden [123]. Die Ansprechraten, 6 % für die IFN-α2a Monotherapie und 12 % für die Kombination, und das mediane Überleben von 15 Monaten in beiden Gruppen unterschieden sich nicht signifikant voneinander [123]. Stadler und Mitarbeiter veröffentlichten 1998 die Ergebnisse einer weiteren Phase-II-Studie, in der IFN-α2a mit IL-2 und 13-CRA kombiniert [Seite 93↓]wurde. Es wurden eine CR und 7 PR (17 %) beobachtet [178]. In einem sehr komplexen Therapieschema wurde von Atzpodien et al. in einer Phase-I/II-Studie die Dreifachtherapie von IL-2, IFN-α2a und 5-FU mit Vinblastin und 13-CRA kombiniert [12]. Es wurde über eine objektive Ansprechrate von 42 % (17 % CR und 25 % PR) bei einer geringen Anzahl von 24 Patienten mit einem guten Performance-Status berichtet. Zusätzlich trat bei weiteren 54 % der Patienten eine Stabilisierung ein. Das therapeutische Konzept wurde in dieser Form jedoch nicht fortgeführt.

In unserer retrospektiven Analyse bei Patienten mit einem guten Karnofsky-Performance-Index lag die Rate objektiver Remissionen bei 34,3 % bei der Dreifachtherapie gegenüber 26,4 % für den Arm der Vierfachtherapie und unterschied sich nicht signifikant. In beiden Gruppen lag der Anteil progressiver Patienten etwa bei 23 %. Das mediane Überleben war mit 21 Monaten für beide Gruppen identisch. Damit lässt sich aus unseren Daten kein Vorteil der Vierfachkombination gegenüber dem klassischen Dreifachtherapieschema ableiten. Die zusätzliche Toxizität von 13-CRA bezog sich in überwiegendem Maße auf moderate Haut- und Schleimhautirritationen.

Zu ähnlichen Ergebnissen kam das auch DGCIN 1995 Protokoll, dass die Dreifachtherapie mit der Vierfachtherapie und zusätzlich mit der Kombination Interferon-α2a/Vinblastin in einer prospektiven, dreiarmigen Studie an insgesamt 341 Patienten verglich. Hier zeigte sich kein signifikanter Unterschied bezüglich der Ansprechraten und des medianen Überlebens in beiden Therapiearmen, die IL-2 enthielten. Die IL-2-haltigen Schemata waren nicht hinsichtlich der Ansprechraten, jedoch bezüglich des medianen Gesamtüberlebens dem Kombinationsschema von IFN-α2a/Vinblastin überlegen (medianes Überleben von 25+ und 27+ Monaten für die Dreifach- bzw. Vierfachkombination versus 16 Monate für IFN-α2a/Vinblastin. Der IFN-α2a/Vinblastin-Arm war in dieser Studie jedoch mit 63 Patienten numerisch unterrepräsentiert [17].

In einer weiteren Subgruppe von 20 Patienten mit lokalen Rezidiven bzw. retroperitonealen Lymphknotenmetastasen oder Skelettmetastasen wurde der Einfluss einer synchronen Kombination von Chemoimmuntherapie und perkutaner Bestrahlung retrospektiv in einem „First-line“- und „Second-line“-Behandlungskonzept untersucht. Patienten mit diesen Metastasenlokalisationen weisen häufig Symptome wie Schmerzen, neurologische Symptome, Kompressionssymptome oder einen Subileus auf und haben insgesamt eine schlechte Prognose. Weiterhin konnte durch verschiedene Autoren belegt werden, dass insbesondere [Seite 94↓]Skelettmetastasen, aber auch lokale Rezidive schlecht auf den systemischen Ansatz der Chemoimmuntherapie ansprechen [80,108,115,164].

Die Rationale für den synchronen Einsatz einer systemischen Immuntherapie und einer lokalen Bestrahlung ergab sich aus tierexperimentellen Daten verschiedener Autoren am murinen RENCA-Modell [36,46,138,217,218]. Zusammengefasst ergaben die Daten eine verbesserte therapeutische Effizienz der Kombinationsbehandlung, die in einer Reduktion der Anzahl von Metastasen und der Größe der Primärtumoren und einem signifikant verlängerten Überleben resultierten. Interessanterweise konstatierten die Autoren einen systemischen Effekt der lokalen Bestrahlung, der die Wirksamkeit von IL-2 oder IFN-α verbesserte. Es wird vermutete, dass der therapeutische Synergismus vornehmlich über folgende Veränderungen vermittelt wird:

Derzeit liegen kaum klinische Daten zum synchronen Einsatz einer perkutanen Bestrahlung und systemischen Chemoimmuntherapie beim metastasierten NZK vor. Bis dato beinhalteten die Therapiekonzepte für das klinische Management von symptomatischen ossären Metastasen die palliative Bestrahlung als Monotherapie oder das operative Vorgehen [41,44,58,63,86,172,187]. Bei der palliativen Bestrahlung steht die Schmerzlinderung eindeutig im Vordergrund und kann, zumindest zeitweise, auch bei einer großen Anzahl von Patienten erreicht werden. Fossa et al. berichteten über eine Verbesserung der Schmerzen bei 16 von insgesamt 19 behandelten Patienten (84 %). Der Zeitraum der Strahlenwirkung betrug jedoch nur 5 Monate [58]. DiBiase et al. erzielten symptombezogene palliative Therapieerfolge bei 86 von 104 Patienten mit symptomatischen ossären Metastasen mit einer medianen Dauer von 6 Monaten [41]. Die operativen Ergebnisse zur Behandlung von Skelettmetastasen des NZK sind nicht ermutigend. Verschiedene Gruppen haben ein medianes Überleben von 10 bzw. 12 Monaten bei operativ behandelten Patienten angegeben und auf den hohen Wert einer guten Patientenselektion hingewiesen [44,63]. Die operative Mortalität und Morbidität, das Ausmaß der ossären Metastasierung, der Zeitpunkt der Diagnose der ossären Metastasen (synchron oder metachron), die allgemeine Prognose des Patienten und mögliche Reduktion der Lebensqualität sollten bei der Indikationsstellung zur Operation Berücksichtigung finden.


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Das klinische Management von ossären Metastasen wurde mit der Einführung der systemischen Immuntherapie erneut zur Diskussion gestellt. Es zeigte sich jedoch, dass insbesondere bei Skelettmetastasen Remissionen unter Immuntherapie schwierig zu beurteilen und nur in Einzelfällen zu erzielen waren [59,115]. Im Gegenteil, einige Autoren konnten in uni- bzw. multivariaten Analysen die Präsenz von Skelettmetastasen als Faktor identifizieren, der mit einer schlechten Prognose und kürzerem Überleben der Patienten assoziiert war [108,164].

Die klinische Rationale für den kombinierten Einsatz von Immuntherapie und Bestrahlung ergab sich folglich nicht nur vor dem Hintergrund experimenteller Daten, sondern vor allem auch aus der klinischen Notwendigkeit, das Management dieser Subgruppe von Patienten zu verbessern. In diesem Zusammenhang ist die erste klinische Arbeit zu werten, die sich mit dieser Fragestellung beschäftigt hat. Brinkmann et al. haben 12 Patienten retrospektiv untersucht, die wegen einer metastasierten Erkrankung mit einer systemischen Chemoimmuntherapie behandelt und andererseits wegen symptomatischer ossärer Metastasen bei 9 Patienten oder lokaler Rezidive bei 3 Patienten perkutan bestrahlt worden waren. Erstaunlicherweise konnten bei 4 Patienten komplette Remissionen (33 %) und bei einem weiteren Patienten eine partielle Remission (8 %) erzielt werden. Nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 28 Monaten waren noch 9 der 12 Patienten (75 %) am Leben. Alle Patienten hatten eine Linderung der Schmerzbeschwerden ab 2 Wochen nach Therapiebeginn [32]. Diese Ergebnisse sind besser im Vergleich zur alleinigen Chemoimmuntherapie und deuten, ähnlich wie experimentell am murinen Modelltumor demonstriert, auf einen synergistischen Effekt beider Behandlungsformen hin.

Die Rate objektiver Remissionen in unserer retrospektiven Serie der „first-line“-behandelten Patienten betrug 27 %, eine Stabilisierung der progredienten Erkrankung konnte bei 46 % erzielt werden. Damit konnte bei über 70 % der Patienten der progrediente Erkrankungsverlauf zumindest zeitweise gestoppt werden. Die Rate objektiver Remissionen ist in unserer Serie etwas geringer als im Patientenkollektiv der o.g. Untersuchung. Als Ursache kann einerseits angesehen werden, dass unsere Gruppe 3 Patienten beinhaltete, bei denen ein sarkomatoides NZK diagnostiziert wurde. Die sarkomatoid, entdifferenzierte Form des NZK ist bekanntermaßen mit einer schlechten Prognose verbunden. Andererseits lag die kumulative Bestrahlungsdosis bei Brinkmann et al. in einem Bereich von 40 bis 50 Gy und damit etwas höher als bei unseren Patienten mit 30 bis 40 Gy [32].

Bei den 9 Patienten, die im Sinne eines „Second line“-Konzeptes behandelt worden waren, konnte keine objektive Remission beobachtet werden. Es wurde jedoch bei 5 Patienten der progrediente Verlauf der Erkrankung für einen medianen Zeitraum von 8 Monaten gestoppt. Bei [Seite 96↓]den 4 Patienten im Progress konnte kein direkter Zusammenhang zwischen dem Ansprechen auf die „First-line“-Chemoimmuntherapie und dem Versagen der Kombinationstherapie nachgewiesen werden. 2 der 4 Patienten waren jedoch schon nach der „first-line“-Therapie im Progress. DiBiase und Mitarbeiter konnten kürzlich für Patienten mit symptomatischen Knochenmetastasen zeigen, dass objektive Remissionen einer dosiseskalierenden Strahlentherapie signifikant von einem guten KPI (> 70 %) und der Anwendung höherer biologisch effektiver Dosen von über 50 Gy abhängig waren [41]. Die 9 Patienten in unserer zweiten Subgruppe waren alle massiv vorbehandelt. 4 dieser Patienten wiesen einen KPI von < 70 % auf und die Strahlendosen lagen hier in einem Bereich von 30 bis 40 Gy. Dies kann zumindest partiell die Erklärung dafür bieten, dass keine objektiven Remissionen beobachtet wurden.

Abb. 40)CT-Aufnahme einer 35jährigen Patientin mit einem metastasierten NZK, pT3a G3 pN2 M0, Zustand nach R2-Operation und nachfolgend progredienten retroperitonealen Lymphknotenmetastasen mit Schmerzen und drohendem Ileus. Die Patientin wurde mit 3 Zyklen Chemoimmuntherapie und synchroner perkutaner Bestrahlung im ersten Zyklus behandelt. Es wurde eine CR erzielt. Die CT-Aufnahmen zeigen den retroperitonealen Befund vor (linkes Bild) und nach (rechtes Bild) kombinierter Therapie. Die Patientin ist auch 47 Monate nach Therapiebeginn in der CR.

Abbildung 40 zeigt CT-Aufnahmen einer 35jährigen Patientin, die wegen monströser retroperitonealer Lymphknotenmetastasen mit der Kombination von Chemoimmuntherapie und Bestrahlung behandelt wurde.

Insgesamt wurde die Therapie bei den 20 Patienten gut und mit den für die Chemoimmuntherapie üblichen Nebenwirkungen toleriert. Bei 2 Patienten aus der „First-line“ Therapiegruppe musste die Therapie abgebrochen werden. Bei einem Patienten trat eine schwere [Seite 97↓]Autoimmun-Thrombozytopenie am Beginn des zweiten Zyklus auf. Bei einem weiteren Patienten wurde die Therapie wegen einer Verschlechterung des Allgemeinzustandes abgebrochen.

Bei 2 Patienten wurden strahlenbedingte Nebenwirkungen beobachtet. Diese Patienten entwickelten nach Bestrahlung mediastinaler Lymphknotenmetastasen jeweils eine moderate Ösophagitis.

Unsere Daten deuten, im Zusammenhang mit den Ergebnissen von Brinkmann et al., auf einen möglichen synergistischen Effekt der Kombination von perkutaner Strahlentherapie und systemischer Chemoimmuntherapie bei Patienten mit ossären Metastasen, Lymphknotenmetastasen oder lokalen Rezidiven hin. Unsere Beobachtungen untermauern das aggressive therapeutische Konzept bei tolerabler Toxizität und weisen auf die Notwendigkeit der Durchführung weiterer klinischer Studien zur prospektiven Prüfung dieses Behandlungskonzeptes hin.

An unserer Klinik wurden zwischen 1992 und 2000 24 Patienten mit NZK und einem Vena-cava-Zapfen im Stadium III und IV operiert und nachbetreut und retrospektiv hinsichtlich des der perioperativen Ergebnisse, des Einflusses des Tumorthrombus auf das Überleben und der Ergebnisse der im metastasierten Stadium durchgeführten Immuntherapie untersucht.

Unsere perioperative Morbiditätsrate lag mit 31 % bei Patienten im Stadium III und 73 % bei Patienten im Stadium IV im Bereich von in der Literatur angegebenen Daten, wobei sich eine deutliche Zunahme schwerer Komplikationen bei atrialer Tumorthrombus-Ausdehnung nachweisen ließ [167,180]. Ähnliche Ergebnisse beobachteten Staehler et al. mit 37 % Komplikationen im Stadium III und 76 % im Stadium IV (inklusive Mortalität bei 50 %) [180]. Gschwend berichtete über eine vergleichbar hohe peri- und postoperative Komplikationsrate bei Patienten mit Vena-renalis- oder Vena-cava-Befall, wobei in dieser Analyse nur ein Patient mit atrialer Vena-cava-Ausdehnung operiert worden war [65].

Die intra- und postoperative Mortalität wird mit etwa 9 % bis 50 % speziell für Patienten im Stadium IV der Vena-cava-Invasion angegeben [92,180,181]. In unserer Serie lag die Mortalität mit 9 % im Stadium IV (ein Patient von 11) im unteren Bereich der in der Literatur angegebenen Daten.

Multivariate Analysen zur Identifikation prognostischer Faktoren, insbesondere der Rolle der Ausdehnung der Tumorzapfen sind in einer Reihe von Studien durchgeführt worden [50,135,180,196]. Danach scheint die kraniale Ausdehnung des Vena-cava-Thrombus keinen Einfluss auf das Überleben der Patienten zu haben. Dies konnten wir auch in unserer Analyse [Seite 98↓]durch den Vergleich mit einer Kontrollgruppe ohne Vena-cava-Zapfen bestätigen. Beide Gruppen unterschieden sich nicht hinsichtlich des Überlebens (siehe Abb.8, Seite 56). In Übereinstimmung mit den Befunden von Staehler, erwies sich jedoch der Metastasierungsstatus als signifikanter Prognosefaktor [181]. Im Gegensatz zu Literaturbefunden war in unserem Patientengut der Lymphknotenstatus ohne Einfluss auf das Überleben der Patienten. Als Ursache dafür kann die Tatsache angesehen werden, dass lediglich drei Patienten Lymphknotenmetastasen aufwiesen und nur ein Patient in das Stadium pN2 klassifiziert wurde.

Während noch vor wenigen Jahren das Vorhandensein von Fernmetastasen als relative Kontraindikation zur Durchführung einer Operation insbesondere bei Patienten mit Vena-cava-Zapfen im Stadium IV galt, wird heute eine Erweiterung der OP-Indikation auch bei diesen Patienten diskutiert. Die Rationale für dieses therapeutisch-aggressive Vorgehen ergibt sich aus verbesserten Operationstechniken unter Anwendung orthotoper Lebertransplantationstechniken mit „Mercedes“-Inzision, Pringle Manöver (Abklemmen des Ligamentum hepatoduodenale) und extremer Lebermobilisierung, die den langstreckigen anterolateralen Zugang zur Vena cava erleichtern [37,167]. Andererseits bietet die Einbeziehung der Immuntherapie in das gesamte Behandlungskonzept eine sinnvolle therapeutische Option für Patienten mit Fernmetastasen. Staehler und Brkovic haben in ihrer 11jährigen Serie von 66 operierten Patienten mit Vena-cava-Zapfen 16 Patienten mit Fernmetastasen operiert, die ein medianes Überleben von 10,5 Monaten mit einer Ein- bzw. Zwei-Jahres-Überlebensrate von 46 und 17 % aufwiesen [180]. In der Studie von Naitoh dagegen wurden 31 Patienten mit NZK mit Vena-cava-Befall und synchroner Metastasierung retrospektiv untersucht [135]. Von den 31 Patienten konnten 25 (80 %) einer nachfolgenden Immuntherapie zugeführt werden, bei einem weiteren Patienten war zum Zeitpunkt der Publikation die Therapie noch nicht begonnen worden. Nur bei 5 Patienten war die Durchführung einer Immuntherapie aufgrund eines raschen Progresses der Tumorerkrankung nicht möglich. Die 5-Jahres-Überlebensrate betrug für alle Patienten 17 %. Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen dem Überleben und der Durchführung einer Immuntherapie (p=0,042), während sich die Präsenz von Lungenmetastasen (p=0,058) und ein niedriges Grading (p=0,077) als marginal-signifikante Prognosefaktoren erwiesen, die in einer multivariaten Analyse mit einem verlängerten Überleben assoziiert waren.

Unsere Ergebnisse legen im Zusammenhang mit aktuellen Literaturdaten ein aggressives Therapiekonzept bei Patienten mit NZK und Vena-cava-Zapfen im Stadium III und IV nach Staehler unter Kombination von Operation und nachfolgender Immuntherapie bei dem Auftreten von Metastasen nahe. Dieses Vorgehen lässt sich aus der Tatsache ableiten, dass die kraniale Ausdehnung der venösen Tumorzapfen per se keine prognostische Relevanz besitzt. Mit der [Seite 99↓]Entwicklung verbesserter Operationstechniken einerseits und den zunehmenden Erfahrungen mit der systemischen Immuntherapie im metastasierten Stadium andererseits wurden jedoch Voraussetzungen geschaffen, die zu akzeptablen Langzeit-Überlebensraten der Patienten führen. Die Therapieentscheidung sollte dennoch in jedem einzelnen Fall individuell getroffen werden und sich am Allgemeinzustand, dem Vorhandensein von Komorbiditäten und dem Ausmaß der Metastasierung orientieren.

In den Untersuchungen wurde zusätzlich der Wert der tumorspezifischen Form der M2-Pyruvatkinase (TU M2-PK) als biologischer Marker evaluiert. In einer ersten Serie erfolgte zunächst die Analyse bei verschiedenen urologischen Tumoren. Es konnten signifikant erhöhte Konzentrationen beim nicht-metastasierten und metastasierten NZK, jedoch nicht beim Urothelkarzinom, beim Prostatakarzinom oder bei der benignen Prostatahyperplasie nachgewiesen werden. Für das Nierenzellkarzinom steht derzeit kein klinisch brauchbarer biologischer Marker zur Verfügung, der die Erstdiagnose und Verlaufskontrolle bei dieser Erkrankung vereinfacht. Durch die zunehmende Diagnostik kleinerer maligner renaler Raumforderungen und dem damit verbundenen höheren Anteil an organerhaltenden Operationsmethoden („nephron-sparing-surgery“), gewinnt die lokale Tumorkontrolle zunehmend an Bedeutung. Die Strategie des Organerhalts setzt jedoch eine regelmäßige bildgebende Nachbeobachtung der Patienten oder die Anwendung eines gleichwertigen und verlässlichen biologischen Markers voraus. In ca. 20 bis 30 % der Patienten treten bereits zum Zeitpunkt der Erstdiagnose Fern- oder Lymphknotenmetastasen auf, die oft zu einer nachfolgenden immunmodulatorischen Behandlung der Patienten nach Tumornephrektomie führen. Sowohl für die Nachbeobachtung von Risikopatienten, als auch während der Therapie der metastasierten Erkrankung wäre die Anwendung eines biologischen Markers hilfreich.

Die tumorspezifische Form der Pyruvatkinase konnte immunhistochemisch beim Nierenkarzinom nachgewiesen werden [53,208]. Neuere Studien belegen auch den Nachweis des Proteins im peripheren Blut von Patienten mit einem NZK [142,159,201,207]. Auch in unserer Studie war die TU M2-PK im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen signifikant erhöht, die Unterschiede im Plasma der Patienten waren am Deutlichsten beim metastasierten NZK. Dies kann als Ausdruck der erhöhten Tumorlast im fortgeschrittenen Stadium und der damit verbundenen erhöhten Freisetzung des Enzyms in das Plasma gewertet werden. Oremek et al. erzielten in einer Studie ähnliche Ergebnisse, als das Robson Stadium, das indirekt auch die Tumormasse repräsentiert, mit dem Biomarker korreliert wurde. Patienten mit einem hohen Robson-Stadium (lokal fortgeschrittene oder metastasierte Erkrankung) wiesen signifikant [Seite 100↓]höhere TU M2-PK-Werte auf [142]. Wechsel et al. beobachteten einen signifikanten Zusammenhang mit dem Robson-Stadium, aber auch mit dem zellulären Grading und dem Metastasierungsstatus. In dieser Studie betrug die Sensitivität der TU M2-PK für lokalisierte NZK 60 % und stieg bei Tumoren im Stadium Robson III und IV auf 71, bzw. 100 % an [207]. Im Gegensatz dazu betrug die in unserer ersten Serie gemessene Sensitivität auf der Basis der 95%igen oberen Referenzgrenze nur 27,5 % für nicht-metastasierte, und 66,7 % für metastasierte Nierenkarzinome. Diese Unterschiede können, zumindest partiell damit begründet werden, dass in unserer Studie Heparinplasma verwendet wurde. Von Hugo et al. konnte kürzlich gezeigt werden, dass Lymphozyten geringe Mengen der TU M2-PK in Serum und Heparinplasma freisetzen können, nicht jedoch in EDTA-Plasmaproben [81].

Unsere Daten verdeutlichen, dass die TU M2-PK als unspezifischer metabolischer Marker maligner Zellen nicht für die Frühdiagnose maligner renaler Raumforderungen geeignet scheint. Eine potentielle Bedeutung des Biomarkers lässt sich für die Verlaufskontrolle bei Patienten mit metastasierten Nierenkarzinomen ableiten. Die Bedeutung der TU M2-PK beim fortgeschrittenen NZK wurde in einer zweiten Serie untersucht.

In der ersten Serie wurde die TU M2-PK auch bei Patienten mit Prostatakarzinomen, Urothelkarzinomen und der benignen Prostatahyperplasie analysiert. Die Untersuchungen zu Prostatakarzinom und BPH erfolgten zur Fragestellung der Optimierung der Diskrimination zwischen beiden Erkrankungen, um damit ggf. zur Verbesserung der diagnostischen Wertigkeit von TU M2-PK und PSA im Vergleich zum alleinigen PSA beizutragen. Im Gegensatz zu Mazurek et al., die bei 17 Patienten mit einem Prostatakarzinom signifikante Erhöhungen im Vergleich zu 28 Kontrollpersonen feststellten, konnten wir in unserem Untersuchungsgut (57 Kontrollpersonen und 58 Patienten mit Prostatakarzinom) keine signifikanten Unterschiede nachweisen [112]. Aus der Studie von Mazurek liegen keine Angaben hinsichtlich des Stadiums der Erkrankung bei den PCA-Patienten vor. Unsere Ergebnisse belegen jedoch, dass auch bei den metastasierten Patienten keine signifikanten Enzymerhöhungen im Plasma zu verzeichnen waren.

Die Bestimmung der TU M2-PK ist nach unseren Erkenntnissen nicht geeignet zur Diagnose des Prostatakarzinoms oder Urothelkarzinoms und dient ebenfalls nicht zur Differenzierung zwischen Prostatakarzinom und BPH [159].

In der zweiten Untersuchungsreihe wurde die Bedeutung der TU M2-PK als biologischer Marker bei metastasierten Nierenzellkarzinom untersucht. Hier wurden bei 68 Patienten die Werte des Markers nach Tumornephrektomie und vor der Behandlung der Metastasen analysiert. Vom [Seite 101↓]onkologischen Standpunkt wäre in dieser Situation ein Tumormarker, der einerseits die aktuelle Präsenz der vorhandenen Metastasen, aber andererseits auch das Ansprechen auf eine Behandlung reflektieren würde, von hoher klinischer Bedeutung.

In der Literatur existieren derzeit keine Untersuchungen hinsichtlich des TU M2-PK-Verlaufes bei Patienten mit einem metastasierten NZK unter Therapie. In der Gruppe von 68 Patienten war die TU M2-PK nach Operation des Primärtumors in 48 Fällen oberhalb des Cut-offs von 15 kU/l erhöht (siehe Abb. 11, Seite 60). Gering differenzierte Karzinome wiesen signifikant höhere Werte auf als mäßig differenzierte NZK (Abb. 12, Seite 60). Hinsichtlich des histologischen Subtyps, der Tumormasse, der Anzahl der betroffenen Organsysteme, des Geschlechts und des Zeitpunktes des Auftretens der Metastasen bestanden keine signifikanten Unterschiede. Die genannten Ergebnisse hinsichtlich des Gradings und des histologischen Subtyps stehen in Übereinstimmung mit den Befunden von Wechsel et al. an 40 NZK-Patienten [207].

Es existieren nur wenige Berichte bezüglich der Bedeutung der TU M2-PK als Verlaufparameter bei Patienten mit metastasierten Krebserkrankungen unter Therapie. Eine positive Korrelation zwischen dem Tumormarkerverlauf und der klinischen Situation wurde in kasuistischer Form beim Bronchialkarzinom und bei 5 unbehandelten Patienten mit metastasierten Nierenkarzinomen beschrieben [109,207]. Lüftner et al. haben den TU M2-PK-Verlauf bei 34 Patienten mit fortgeschrittenen Mammakarzinomen unter Chemotherapie untersucht. Bei 12 der 14 Patienten mit einer Tumorprogression wurden ansteigende TU M2-PK-Werte ermittelt. Bei 20 weiteren Patienten mit einem stabilen Erkrankungsverlauf oder einer Remission waren die Werte entweder initial negativ oder fielen nach dem ersten Zyklus Chemotherapie auf Werte unterhalb des Cut-offs von 15 kU/l [109]. In einer Studie von Klapdor et al. wurde die TU M2-PK bei 22 Patienten mit Pankreaskarzinomen und 4 weiteren Patienten mit kolorektalen bzw. Magenkarzinomen untersucht und mit den CA19-9-Werten verglichen [97]. Nur 7 der 22 Patienten (32 %) wiesen initial erhöhte TU M2-PK-Werte (oberhalb 15 kU/l) auf. Bei 14 Patienten, darunter 3 Patienten mit einer CR und 6 Patienten mit einer Progression, waren die Werte normal. In Übereinstimmung mit diesen Befunden war bei 3 von 4 der eigenen Patienten (75 %) mit einer CR und gleichzeitiger geringer pulmonaler Tumorlast die TU M2-PK initial negativ. Dagegen hatten nur 25, 35 bzw. 45 % der Patienten mit einer Partiellen Remission, Stabilisierung oder Progression initial negative Werte. In unserer Untersuchung stimmte der Verlauf der TU M2-PK mit dem bildgebend ermittelten Ansprechen auf die Chemoimmuntherapie bei 34 von 50 Patienten überein (positiver prädiktiver Wert 0,68 %). Wenn jedoch die Verläufe für die gesamten Patienten pro Gruppe analysiert wurden, ergaben sich keine signifikanten Unterschiede (siehe Abb. 13, Seite 62). Es wird vermutet, dass dies [Seite 102↓]Ausdruck der individuellen Variabilität der TU M2-PK ist, die zu einem hohen Anteil durch den Differenzierungsgrad und die Tumormasse bestimmt wird. Die Sensitivität des Markers war bei unbehandelten Patienten oder bei Patienten mit einem erneute Progress nach Chemoimmuntherapie am höchsten (94 bzw. 100 %). Eine hohe Tumorlast assoziiert mit einem geringen Allgemeinzustand und einer schlechten Prognose war für diese Patienten charakteristisch. Dies lässt darauf schließen, dass die TU M2-PK erst in einem sehr späten Erkrankungsstadium eine ausreichend hohe Sensitivität erlangt, um sie als verlässlichen biologischen Marker klinisch einsetzen zu können. Daher kann derzeit die klinische Routineanwendung der TU M2-PK als Tumormarker beim metastasierten Nierenzellkarzinom nicht empfohlen werden.

5.2. Experimenteller Teil

HSP72-Expression auf der Oberfläche von Tumorzellen

In unseren Untersuchungen konnte die stressinduzierte Oberflächenexpression vom induzierbaren HSP72 an der Nierenkarzinomlinie ACHN, nicht jedoch an der Prostatakarzinomlinie PC-3 nachgewiesen werden. Die Expression von HSP72 war mit einer erhöhten Lyse durch IL-2 stimulierte NK-Zellen assoziiert. Der ungewöhnliche Nachweis des normalerweise im Zytosol lokalisiserten HSP72 auf der Oberfläche von Tumorzellen wurde von Ferrarini beobachtet [49]. Die Arbeitsgruppe um Multhoff und Issels hat dieses Phänomen eingehend untersucht und postuliert, dass die Expression von HSP72 auf der Zelloberfläche nach nicht-letaler Hyperthermieexposition nur für maligne Zellen zutraf [125].

Anhand von klonogenen Überlebensstudien an Ewing-Sarkomzellen konnte die Arbeitsgruppe zeigen, dass eine Hyperthermieexposition von 41,8 °C bis zu 450 Minuten Dauer keinen Einfluss auf das Überleben der Sarkomzellen hatte [125]. Unsere eigenen Untersuchungsbefunde zur LDH-Freisetzung aus ACHN-Zellen nach Hyperthermieexposition bestätigten diese Beobachtung (Daten nicht gezeigt). In weiteren Untersuchungen wurde die zeitliche Dynamik der HSP72-Expression nach Hyperthermieexposition untersucht. Es zeigte sich, ähnlich wie in den Untersuchungen von Multhoff et al., eine bis zu 48 Stunden anhaltende Expression mit einem Maximum zwischen 8 bis 24 Stunden (Abbildung 17, Seite 66) [125]. Dieselbe Arbeitsgruppe hat die stressinduzierte Expression von HSP72 an verschiedenen Tumorzellen untersucht. Danach wiesen verschiedene Sarkomzellen und eine Larynxkarzinomlinie eine deutliche HSP72-Membranexpression auf. Das Phänomen konnte an Lymphomzellen, einer [Seite 103↓]Mammakarzinomlinie und benignen Zellen (B-Zellen, peripheren Blutlymphozyten und Fibroblasten) nicht nachgewiesen werden [27,125].

Der Zusammenhang zwischen der stressinduzierten HSP72 Membranexpression maligner Zellen und ihrer erhöhten in vitro Lyse durch IL-2 stimulierte NK-Zellen war eine zentrale Erkenntnis der experimentellen Arbeiten von Multhoff et al. [27,126]. Diese erhöhte Lyse war nicht auf eine Verringerung der Expression von MHC-Molekülen zurückzuführen [126]. Auch mit unseren Daten konnte die Beobachtung einer erhöhten Lyse HSP72-positiver Zellen bestätigt werden. HSP72-positive, hyperthermierte ACHN-Zellen wiesen eine signifikant erhöhte Lyse auf im Vergleich zu HSP72-negativen, hyperthermierten PC-3-Zellen. Die erhöhte Lyse war durch anti-HSP72-Antikörper inhibierbar [156]. Die Literaturdaten bezüglich der Hyperthermie-induzierten Lyse durch NK-Zellen sind nicht einheitlich. Kubista et al. beobachteten eine erhöhte in vitro Lyse von Chondro- und Osteosarkomzellen nach Hyperthermieexposition von 42,5 °C für 90 Minuten [100]. In dieser Studie wurde jedoch nicht die Membranexpression von HSP72 untersucht, sondern die zytoplasmatische HSP72-Akkumulation nach Hyperthermie per Western-Immunoblotting analysiert. Die NK-Effektorzellen wurden in dieser Studie nicht mit IL-2 präinkubiert (im Sinne von lymphokinaktivierten Killerzellen), sondern nativ für die in vitro Lyseexperimente eingesetzt.

Im Gegensatz dazu stehen Untersuchungen von Vendetti et al. und Blom et al. [24,202]. An humanen Pankreaskarzinomzellen (HPC-4) führte eine Hyperthermieexposition zwar ebenfalls zu einer Membranexpression von HSP72. Die Zellen waren jedoch, unabhängig vom Hyperthermieeinfluss, resistent gegenüber der Lyse durch NK-Zellen. Die Lyse durch LAK-Zellen war nach Hyperthermieexposition in dieser Studie signifikant verringert [202]. Auch an uvealen Melanomzellen ließ sich nach Hyperthermieexposition keine erhöhte Sensibilität gegenüber einer NK-Lyse nachweisen [24].

Weitere Untersuchungen zeigten, dass auch die basale Expression von HSP72 auf Tumorzellen eine Bedeutung für die Lyse durch IL-2-stimulierte NK-Zellen haben kann. Botzler et al. verglichen humane Lungenkarzinomzellen (LX-1) und Mammakarzinomzellen (MX-1) bezüglich ihrer basalen HSP72-Expression. Obwohl sich die Präsentation von MHC-Molekülen beider Zelllinien nicht unterschied, wiesen LX-1 Zellen eine 90 %ige und MX-1-Zellen eine unter 5 %ige HSP72-Expression auf. Die Expression von HSP72 ließ sich mit der Lyse durch NK-Zellen korrelieren. Nach Blockierung von HSP72 mit Antikörpern ging die Lyse bei den HSP72-positiven LX-1-Zellen zurück, während sie bei den MX-1-Zellen unverändert blieb [27]. Der basale Nachweis von HSP72 auf der Zelloberfläche einer Vielzahl primärer Tumorbiopsien, [Seite 104↓]u.a. an Lungenkarzinomen, kolorektalen Karzinomen, Pankreaskarzinomen, Lebermetastasen und leukämischen Blasten von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, nicht jedoch an Mammakarzinomen und an benignen Zellen, weist auf den tumor-selektiven Charakter, aber auch die differenzierte Expression des Moleküls HSP72 innerhalb verschiedener Tumore hin [67]. In unseren Studien konnten wir HSP72 basal an 27 von 29 Tumorproben nachweisen, jedoch nur bei der hyperthermieinduzierten Expression bestand ein Zusammenhang mit anderen Parametern. Bei höheren T-Kategorien und bei Metastasen war die HSP72-Membranexpression signifikant verringert. Inwieweit die stressinduzierte Membranexpression eine prognostische Bedeutung hat, bleibt derzeit offen.

Aus der Beobachtung einer basalen HSP72-Membranexpression lässt sich formal ableiten, dass eine Induktion der HSP72-Membranexpression zu einer Erhöhung der klinischen Effektivität einer IL-2 basierten Zytokintherapie führen könnte. Die in vivo Expansion und Aktivierung von NK-Zellen unter subkutaner IL-2- und IFN-α-Therapie ist in einer Reihe von Studien als entscheidender Faktor der Immunaktivierung identifiziert worden [11,118,145]. Philipps und Lanier konnten schon sehr frühzeitig zeigen, dass die IL-2 vermittelte Generation zytotoxischer Zellen (LAK-Zellen) in vitro auf eine Aktivierung von NK-Zellen (CD3-, CD56+) zurückzuführen war, während CD3-positive T-Lymphozyten nur zu einem geringen Teil an der Herausbildung des LAK-Phänomens beteiligt waren [147]. Verschiedene Untersucher konnten neben der numerischen Expansion der NK-Zellpopulation auch eine Zunahme der Lyseaktivität und eine Korrelation mit der klinischen Response der Patienten beobachten [11,33,166]. Möglicherweise stellt auch in vivo die basale Expression von HSP72 auf Nierentumorzellen eine Zielstruktur für IL-2 stimulierte NK-Zellen dar. Daraus ergibt sich die Rationale, eine IL-2-basierte Immuntherapie mit einer anderen HSP72-induzierenden Therapieoption, z.B. einer regionalen Hyperthermie, zu kombinieren, um den Zusammenhang zwischen HSP72-Membranexpresison und NK-Lyse klinisch auszunutzen.

Der Nachweis von HSP72 auf malignen Zellen und die damit verbundene erhöhte NK-Lyse wird als tumorassoziiertes Phänomen diskutiert. Auf benignen, gesunden Zellen konnte HSP72 bisher nicht nachgewiesen werden. Dazu wurden PBL, Fibroblasten aber auch Normalgewebe verschiedener Organe (ZNS, Kolon, Lunge, Endothelzellen) untersucht [67]. An renalen Zellen konnten wir hingegen eine, wenn auch geringere, basale und hyperthermieinduzierbare Expression von HSP72 nachweisen. Eine starke zytoplasmatische HSP70-Expression in Tubulusepithelzellen ist beschrieben worden [20] und wurde auch in den eigenen [Seite 105↓]immunhistochemischen Untersuchungen beobachtet (siehe Abbildung 41a). Möglicherweise besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der zytoplasmatischen Expression von HSP72 und der Präsentation auf der Zelloberfläche von Tubuluszellen, die die Expression von HSP72 auf der Zelloberfläche renaler Zellen erklärt.

Abb. 41)Darstellung normaler, positiv anti-HSP72-gefärbter Tubulusepithelzellen (a, Vergrößerung 1:200), stark gefärbter Karzinomzellen (b, Intensitätsgrad 3, Vergrößerung 1:400) und Karzinomzellen, bei denen das Zytoplasma kaum angefärbt ist (c und d, Vergrößerung 1:400). In den benignen Tubulusepithelzellen und den Karzinomzellen von Präparat b ist das Zytoplasma positiv angefärbt. In den Karzinomzellen der Präparate c und d ist eine spezifische Anfärbung von Zellmembranen erkennbar (Pfeil).

Die Oberflächenexpression von HSP72 variiert innerhalb verschiedener Tumorentitäten, wie an Primärzellen aus Biopsiematerial gezeigt werden konnte [67]. Unsere Daten belegen, dass auch innerhalb einer Entität interindividuelle Unterschiede des Expressionsgrades nachweisbar sind.

Interessanterweise ließ sich eine unterschiedliche HSP72-Expression selbst innerhalb einer Tumorzelllinie am Beispiel der Kolonkarzinomlinie CX2 nachweisen [129]. Diese Zellen unterschieden sich lediglich hinsichtlich der HSP72-Expression, nicht jedoch in Bezug auf andere Oberflächenmarker, die zur phänotypischen Charakterisierung der Zellen (MHC-Moleküle, Adhäsionsmoleküle) herangezogen wurden [129]. Nach Separation der beiden unterschiedlichen Zelltypen und Zellzyklussynchronisation konnte demonstriert werden, dass [Seite 106↓]keine zusätzliche Abhängigkeit der HSP72-Membranexpression von bestimmten Phasen des Zellzyklus bestand [129].

Obwohl die Beteiligung der HSP am Membrantransport von Proteinen zu ihren wesentlichen Funktionen zählt, konnten die Mechanismen des Transports von HSP72 auf die Zelloberfläche bisher nicht geklärt werden. Da HSP72 im Gegensatz zu anderen HSP’s keine Signalsequenzen für einen transmembranen Einbau enthält, werden alternative zytosolische Transportmechanismen diskutiert [76,130,199]. Die Blockierung des Golgi-Apparates mit Brefeldin A oder Kolchizin führte nicht zu einer Hemmung der HSP72-Membranexpression, was für einen Golgi-unabhängigen Weg des Transports von HSP72 spricht [127]. HSP72 wurde bei Tumoren mit einer Oberflächenexpression des Proteins überwiegend in vesikelähnlichen Strukturen nachgewiesen. Multhoff et al. spekulierten auf der Basis dieser elektronenmikrokopischen Untersuchungen, dass HSP72 über lysosomale Strukturen auf die Zellmembran transportiert werden könnte [129].

Der in der vorliegenden Arbeit beobachtete Nachweis von HSP72 auf normalen renalen Epithelzellen ist mit der Beobachtung einer erhöhten Lyse HSP72-positiver Tumorzellen durch IL-2-stimulierte NK-Zellen in sich nicht widersprüchlich. Jüngste Beobachtungen haben gezeigt, dass die Interaktion von HSP72 oder einem HSP72-Peptidfragment zur proliferativen und zytolytischen Aktivierung von NK-Zellen führt [131,132]. Die Langzeitinkubation mit HSP72 oder dem c-terminalen HSP72-Peptidfragment (TKD) führte zu einer Hochregulation des Rezeptors CD94 auf der Zelloberfläche und zytolytischen Aktivierung von NK-Zellen. Es wurde vermutet, dass der CD94-Rezeptor der NK-Zellen mit HSP72 interagiert [133]. Dabei zeigte sich in vitro eine Abhängigkeit der NK-Zellaktivierung von der HSP72-Konzentration. Für eine optimale Stimulation der NK-Zellen war eine Konzentration von 10 bis 50 µg/ml von freiem HSP72 bzw. 2 bis 8 µg/ml des c-terminalen Peptids TDK notwendig [133,64]. Für die in vivo Situation ist derzeit unklar, welches Ausmaß der HSP72-Membranexpression für eine NK-Zellaktivierung über CD94-Rezeptoren notwendig ist. Inwieweit die Interaktion von CD94 und HSP72 noch von zusätzlichen Korezeptoren oder Molekülen abhängig ist, wird Ziel der weiteren experimentellen Forschung sein.

Zytoplasmatische HSP72-Expression in Tumorzellen

In den Studien zur zytoplasmatischen Expression an 53 Paraffinpräparaten konnten wir die HSP72-Expression als unabhängigen Prognoseparameter für Patienten mit Nierenzellkarzinomen identifizieren. Patienten mit Metastasen wiesen signifikant geringere zytoplasmatische HSP72-[Seite 107↓]Konzentrationen auf. Bei 18 von 24 Patienten im metastasierten Stadium, die mit einer Chemoimmuntherapie behandelt wurden und nicht mit einer Remission ansprachen, waren die Werte ebenfalls signifikant erniedrigt. In uni- und multivariaten Analyse war die zytoplasmatische HSP72-Expression, neben der T-Kategorie und dem Grading der unabhängige prognostische Faktor mit dem höchsten Signifikanzniveau. In der Kategorie Metastasierung trat bei der Gruppe nicht-metastasierter Patienten kein Todesfall (kein Ereignis) in der Nachbeobachtung bei einer insgesamt kleinen Stichprobe mit einer großen Anzahl zensierter Werte auf. Die multivariate Cox-Regression führt unter diesen Bedingungen bei dem zu prüfenden Faktor (Metastasierung) nicht zu plausiblen, interpretierbaren Ergebnissen. Auf dieses Problem wurde Ridout et al. 1999 und Heinze und Schemper 2001 hingewiesen [70,154]. Entsprechende Computerprogramme zur Berechnung dieser Konstellation stehen derzeit noch nicht zur Verfügung [212]. Im Mantel-Haenszel-Test konnte jedoch eine hochsignifikante Korrelation zwischen einer geringen HSP72-Expression und der Metastasierung gezeigt werden (p=0,001).

Eine Reihe von experimentellen Untersuchungen hat sich mit der prognostischen und immunologischen Bedeutung der Expression verschiedener HSP beim Nierenzellkarzinom befasst. Santarosa et al. konnten an Einzelzellsuspensionen zeigen, dass Nierenkarzinomzellen signifikant mehr HSP72 exprimierten als Zellen, die aus gesundem Nierengewebe gewonnen worden waren. Mehr noch, eine geringe Expression von HSP72 ließ sich positiv mit einem kürzeren progressionsfreien Überleben korrelieren. Patienten, die im Verlauf der Erkrankung erneut progredient wurden, wiesen signifikant geringere HSP72-Werte auf [165]. In weiteren Untersuchungen ließ sich zeigen, dass die Inkubation der Zellkulturen mit IFN-γ zu einer signifikanten HSP72-Akkumulation führte. HSP72 konnte in dieser Untersuchung als unabhängiger prognostischer Parameter auf der Basis einer multivariaten Analyse etabliert werden [165]. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit unseren Ergebnissen und weisen auf die immunologische Bedeutung von HSP72 beim NZK hin.

Auch Bex et al. berichteten an einer kleinen immunhistochemischen Serie von 12 Nierenzellkarzinomen und 2 Metastasen, dass 3 Patienten mit einer metastasierten Erkrankung nur eine geringe HSP72-Expression aufwiesen. Ein signifikanter Zusammenhang mit einer schlechteren Prognose konnte jedoch aufgrund der geringen Patientenanzahl nicht hergestellt werden. Des Weiteren bestand keine Korrelation zwischen dem Tumorstadium und dem Grading des Primärtumors [20]. Eine heterogene Expression verschiedener HSP an primären Nierenkarzinomen und normalen Nierenzellen wurde auch von Lichtenfels et al. unter Anwendung Proteomics-basierter Techniken (PROTEOMEX – PROTEOMe-based target [Seite 108↓]evaluation combined with immuno-reactive target structure identification explored by sera (serEX)) beobachtet [107]. Im Gegensatz zu den Resultaten von Santarosa et al. führte eine IFN-γ-Behandlung selbst kaum zu einer Induktion von HSP72. Hinweise auf die immunologische Bedeutung von HSP72 wurden jedoch durch den Nachweis einer spezifischen, anti-HSP-Reaktivität autologer und allogener Patientensera erbracht [107].

Der Zusammenhang zwischen Expression von HSP72 im Primärtumor bzw. in Metastasen und der Immunogenität von Tumoren ist in besonderem Maße für das NZK interessant. Unsere Untersuchungen zeigten, dass sich Primärtumoren und Metastasen nicht signifikant bezüglich der HSP72-Expression unterschieden. Die stärkere HSP72-Konzentration stellte ebenso bei immuntherapierten Patienten einen, wenn auch marginal signifikanten Überlebensvorteil dar (p=0,0454, Abbildung 35, Seite 80). Diese Beobachtung kann als ein indirekter Hinweis darauf gewertet werden, dass die intrazelluläre HSP72-Expression die Immunogenität von Nierenkarzinomen modulieren kann. Diese These wird durch Beobachtungen anderer Arbeitsgruppen unterstützt. Wells et al. konnten an malignen B16 Melanomzellen zeigen, dass die stabile Transfektion mit dem HSP72-Gen zu einer Erhöhung der Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Zelloberfläche und zu einer verstärkten Antigen(Peptid)-Präsentation und Erkennung durch MHC-Klasse-I restringierte CTL führte [211]. Im Gegensatz dazu beobachteten Dressel et al. in HSP70-transfektierten Melanomzellen zwar keine verstärkte MHC-Expression, jedoch war auch hier die Lyse durch allospezifische CTL erhöht, was mit einer verbesserten CTL-induzierten Apoptose begründet wurde [43]. Ähnlich demonstrierten Ito et al. an Gliomzellen, dass eine Hyperthermieexposition zu einer Verstärkung der MHC-Klasse-I-Präsentation führte, die ihr Maximum nach 24 bis 48 Stunden erreichte und mit einer erhöhten Expression von HSP70 assoziiert war. Eine erhöhte Immunogenität der hyperthermierten Gliomzellen wurde an in vivo immunisierten Milzlymphozyten im Vergleich zu nicht-hyperthermierten Gliomzellen nachgewiesen. Einen direkten Zusammenhang zwischen HSP70- und MHC-Klasse-I-Expression erbrachte diese Studie jedoch nicht [85].

Unsere Beobachtung könnte eine unmittelbare Bedeutung bei der immunhistochemischen Beurteilung von Nierenkarzinompräparaten haben. Da ein Cut-off von 1,7 im einzelnen Präparat nicht eingeschätzt werden kann, wurde die multivariate Analyse auch für einen Cut-off von 2,0 (mäßige HSP72-Expression) berechnet. Auch hier zeigte sich das höchste Signifikanzniveau für die HSP72-Expression, p=0,008; Exp(B)=5,754; 1,584 < 95% CI < 20,897). Damit wird deutlich, dass der Parameter potentiell zur prognostischen Beurteilung von Patienten mit Nierenkarzinomen herangezogen werden könnte. Durch weitere Studien müssen die bisherigen Ergebnisse jedoch an größeren Untersuchungszahlen verifiziert werden.


[Seite 109↓]

HSP70-Peptid-Komplexe

Unsere Arbeitsgruppe hat sich mit der Entwicklung einer Methode zur effizienten Aufreinigung von HSP70-Peptid-Komplexen befasst. Mit der Methode der ADP-Affinitätschromatographie können aus Tumormaterial HSP70-Peptid-Komplexe angereichert und für Vakzinationszwecke aufbereitet werden. Die Effizienz gp96- oder HSP70-basierter Vakzinen konnte in einer Vielzahl tierexperimenteller Studien sowohl für den prophylaktischen, als auch für den therapeutischen Einsatz belegt werden [175,176,186,188].

In einer präliminären tierexperimentellen Untersuchung am murinen B16-F1 Melanom konnten wir die Wirksamkeit von HSP70-Peptid-Komplexen, die mit der ADP-Affinitätschromatographie angereichert worden waren, in einem prophylaktischen Ansatz an syngenen C57BL/6 (-H2b) Mäusen prinzipiell bestätigen [158] und exemplarisch an der Nierenkarzinomlinie ACHN und einer primären NZK-Kultur demonstrieren, dass sich mit der Methode der ADP-Affinitätschromatographie HSP70-Peptid-Komplexe isolieren und nach Inkubation mit ATP Peptide abspalten und nachweisen lassen. Die genauere Charakterisierung spezifischer Eigenschaften der ADP-Agarosesäule wird Ziel weiterer Untersuchungen sein.

Auf der Basis der bisherigen experimentellen Daten ergibt sich für die klinische Anwendung von HSP-Peptid-Vakzinen sich eine Reihe potentieller Konzepte:

  1. HSP-Peptid-Vakzinen aus autologem Tumormaterial
  2. Kombination von HSP-Peptid-Vakzinen mit Zytokinen, wie z.B. IL-2
  3. in vitro Beladung von autologen oder allogenen DC mit HSP-assoziierten Peptiden als zelluläre Vakzine
  4. in vitro Rekonstitution von HSP mit bekannten immunogenen, synthetisierten, und gepoolten Peptiden als polyvalente HSP-Peptid-Vakzine

Die klinische Anwendung von HSP-Peptid-Vakzinen wird einerseits begründet durch die Bindung tumorspezifischer, biologisch aktiver, d.h. antigener Peptide. Diese Peptide, obwohl in ihrer Struktur nicht identifiziert, sind neben einer Vielzahl irrelevanter Peptide an HSP’s gekoppelt und nach Aufnahme und Repräsentation durch APC in der Lage, eine antigen-spezifische T-Zellantwort und damit potentiell eine Anti-Tumor-Reaktion auszulösen.

Obwohl HSP70-gekoppelte Peptide eine Immunantwort induzieren und als Vakzine genutzt werden können, ist die Rolle, die HSP70 bei der Prozessierung antigener Peptide im Zytosol spielt, noch nicht ausreichend aufgeklärt worden.

Neben gp96 ist auch für zytosolisches HSP70 am etablierten OVA-Antigensystem gezeigt worden, dass HSP70 der OVA-transfektierten Zellinie EG7.OVA eine Assoziation mit dem H-2Kb restringierten SIINFEKL-Epitop dieser Zellen aufwies. Nach Peptidstripping und HPLC [Seite 110↓]konnten die entsprechenden HPLC-Fraktionen an identischer Position und bei identischen Acetonitrilkonzentrationen wie synthetisches SIINFEKL eluiert und RMA-Targetzellen gegenüber dem H-2Kb/SIINFEKL-spezifischen T-Zellklon 4G3 sensibilisiert werden [30]. Dies bedeutet, dass neben ER-residentem gp96, auch zytosolisches HSP70 Komplexe mit antigenen, MHC-bindenden Epitopen bilden kann. Eine Beteiligung verschiedener HSP (HSP70, gp96) beim intrazellulären Peptidtransport und für die Präsentation auf MHC-Molekülen konnte auch dadurch belegt werden, dass die Applikation von HSP-Peptid-Komplexen in das Zytosol von Zellen zu einer effizienten Präsentation der antigenen Peptide auf MHC-Klasse-I-Molekülen führte. Die Präsentation war deutlich geringer, wenn freie Peptide appliziert bzw. wenn die HSP an unspezifische Substanzen gebunden wurden [22]. In diesem Modell war die Bindung antigener Peptide an HSP eine essentielle Voraussetzung für eine effiziente MHC-Präsentation.

Andererseits scheinen HSP selbst als immunlogisch aktive Moleküle zu agieren. Breloer et al. konnten zeigen, dass HSP70- und gp96-Moleküle, an die keine antigenen Peptide gebunden waren, an den Ovalbumin-(OVA)- und ß-Galaktosidase-Antigensystemen bei OVA- und ß-gal-spezifischen T-Zellklonen die Freisetzung von TNF-α und IFN-γ als Zeichen einer T-Zell-Aktivierung auslösen konnten. Antigen-negative HSP70- und gp96-Proteine, die aus normalem Lebergewebe von Mäusen isoliert wurden, waren in der Lage, antigen-spezifisch CD8-positive T-Zellen zu stimulieren. Die T-Zell-Stimulation war nicht MHC-restringiert jedoch abhängig vom Kontakt der T-Zellen zu frisch isolierten APC (Makrophagen) [29].

Weiterhin konnte an murinen B16-Melanomzellen gezeigt werden, dass in vivo die Induktion von HSP72 mit der Generation einer potenten Immunreaktion gekoppelt war. Die Induktion von HSP70 konnte mit einer intratumoralen Infiltration von T-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen (DC), einer Th1 charakteristischen Zytokinfreisetzung (IFN-γ, TNF-α und IL-12) und einer verstärkten Antigenaufnahme durch unreife antigenpräsentierende Zellen korreliert werden [191]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass über eine Expression von HSP70 dem Immunsystem relevante Situationen signalisiert werden, die die Auslösung einer potenten Immunantwort erforderlich machen und triggern. Diese Funktion der HSP hat auch dazu geführt, die Proteine als immunologische „Danger“-Signale zu bezeichnen und legt ihre zusätzliche Bedeutung als potentielles Adjuvanz für Vakzinationskonzepte nahe [111].

Für den potentiellen klinischen Einsatz von in vitro HSP-stimulierten DC als zelluläre Vakzine sprechen eine Reihe experimenteller Befunde. Die Herausbildung einer spezifischen T-Zell-Antwort ist strikt von der Existenz funktionsfähiger APC anhängig [199] und deutet damit auf [Seite 111↓]eine entsprechende Prozessierung von HSP-Peptid-Komplexen durch APC hin. Arnold-Schild et al. konnten an den murinen Zelllinien P388D1 (Monozyten) und D2SC/1 (dendritische Zellen) elektronenmikroskopisch nachweisen, dass die mit Goldpartikeln markierten HSP gp96 und HSP70 (konstitutive Form) spezifisch an der Oberfläche der APC gebunden und spontan über eine rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert wurden. In weiteren Experimenten konnte die Kolokalisation von internalisierten HSP und MHC Klasse I Molekülen in endosomalen Strukturen nachgewiesen werden [7]. Durch Binder et al. konnte die Prozessierung HSP-gebundener Peptide durch APC weiter charakterisiert werden. An peritonealen Makrophagen (RAW264.7) konnte gezeigt werden, dass gp96 an den Oberflächenrezeptor CD91 (α2-Makroglobulinrezeptor) bindet und durch α2-Makroglobulin inhibiert werden kann [21]. Diese Beobachtung konnte auch auf andere HSP, wie HSP90 und HSP70 verschiedener Tumorzellentitäten erweitert werden [18]. Versuche mit radioaktiv-markierten Peptiden haben demonstriert, dass an der für die Bindung von gp96 mit Peptiden im ER erforderlichen Überwindung der ER-Membran der TAP-(Transporter associated with antigen Processing)-Komplex beteiligt ist [103]. Die Aufnahme HSP-gebundener exogener Antigene durch APC und deren Präsentation über ihre MHC I Moleküle (endogener Präsentationsweg) ist von kritischer Bedeutung für die nachfolgende Stimulation antigen-spezifischer T-Zell-Klone und damit der Herausbildung einer potenten Anti-Tumor-Reaktion [186].

Die zahlreichen in vitro und tierexperimentellen Ergebnisse waren Voraussetzung für die ersten klinischen Anwendungen autologer Tumor-gp96-Peptid-Präparationen, die derzeit überwiegend im Rahmen von Phase-I/II-Studien geprüft werden. Dabei kamen prophylaktische und therapeutische Indikationen an verschiedenen Tumorentitäten zum Einsatz. Die Tabellen 21 und 22 stellen eine Übersicht über ausgewählte Studien dar.


[Seite 112↓]

Tab. 21)Klinische Studien mit therapeutischem Konzept zur Behandlung etablierter, messbarer Metastasen (* – keine Angabe, ob es sich um eine R0-Situation oder um etablierte Metastasen handelt; k.A. – keine Angabe).

Autor

Entität

HSP

Vakzinedesign

n

OR

SD

Janetzki et al. [87]

verschiedene

gp96

autologe gp96-Peptidvakz.

15

2 CR*

4 SD

Belli et al. [19]

Melanom

gp96

autologe gp96-Peptidvakz.

28

2 CR

3 SD

Amato et al. [4]

NZK

gp96

autologe gp96-Peptidvakz.

33

1 CR 3 PR

18 SD

Riccobon et al. [153]

Melanom

k.A.

HSP gepulste DC

7

k.A.

k.A.

Amato et al. [6]

NZK

gp96

autologe gp96-Peptidvakz. + IL-2

9

-

6 SD

Assikis et al. [8]

NZK

gp96

autologe gp96-Peptidvakz. + IL-2

61

1 CR 2 PR

18 SD

Younes et al. [216]

Non-Hod-kin-Lym.

gp96

autologe gp96-Peptidvakz.

10

1 PR

5 SD

Tab.22)Klinische Studien mit prophylaktischem Therapiekonzept nach chirurgischer Entfernung des Primärtumors oder von Metastasen (* Metastasen kolorektaler Karzinome).

Autor

Entität

HSP

Vakzinedesign

n

NED

med. f/u

Heike et al. [69]

Magen-Ca.

gp96

autologe gp96-Peptidvakz.

10

5

9 Mo.

Mazzaferro et al. [113]

M1 hep*

gp96

autologe gp96-Peptidvakz.

29

16

12 Mo.

Lewis [105]

Pankreas-Ca.

gp96

autologe gp96-Peptidvakz.

3

k.A.

k.A.

Entsprechend ihrer Zielstellungen (Durchführbarkeit/Toxizität) konnte in den Studien nachgewiesen werden, dass die Vakzination mit HSP-Peptid-Komplexen prinzipiell [Seite 113↓]durchführbar ist, von den Patienten gut toleriert wird, kaum Nebenwirkungen verursacht und auch autoimmunologische Phänomene nicht zu beobachten waren. Anhand der bisherigen präliminären Ergebnisse muss die therapeutische Effizienz der HSP-Peptid-Vakzinen derzeit noch mit Zurückhaltung interpretiert werden.

Die Arbeit von Lewis macht jedoch auf ein weiteres Problem bei der Anwendung von HSP-Vakzinen aufmerksam. Von insgesamt 15 Patienten konnten in dieser Studie nur 3 Patienten vakziniert werden und nur bei einem Patienten ließ sich mittels Elispot-Assay eine Zunahme der Frequenz CD8-positiver T-Zellen im peripheren Blut nachweisen [105]. Die sterile Gewinnung einer ausreichenden Menge von Tumorgewebe stellt insbesondere bei kolorektalen Karzinomen und beim Pankreaskarzinom eine zusätzliche Problematik dar.

Das Konzept der Vakzination mit HSP-basierten Vakzinen ließe sich wesentlich vereinfachen, wenn HSP und antigene Peptide in vitro rekonstituiert werden und damit auch bekannte, synthetisch hergestellte Peptide zum Einsatz kommen könnten. Erste Hinweise auf die immunologische Aktivität in vitro rekonstituierter HSP-Peptid-Komplexe gibt es bereits. Blachere et al. konnten am murinen Modell zeigen, dass gp96- oder HSP70-Peptid-Komplexe mit einer Reihe verschiedener synthetischer Peptide in vitro generiert werden können, die synthetischen Peptide durch Makrophagen aufgenommen, erneut repräsentiert werden und letztlich damit eine CD8-positive T-Zell-Antwort ausgelöst werden kann [23]. Klinisch interessant wäre die Generation von HSP-Peptid-Vakzinen, die auf einem allogenen Ansatz unter in vitro Rekonstituion von HSP’s mit gemeinsamen, bekannten, immunogenen Tumorantigenen beruhen. Dafür spricht ebenso die Tatsache, dass gemeinsame, immunogene und an HSP70-gekoppelte Peptide als exogene, zell-assoziierte Antigene (hier ein Tyrosinasepeptid aus Melanomzellen) durch DC’s internalisiert und auf MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden können und so eine spezifische T-Zell-Antwort induzieren. Dieses Phänomen wurde als „Cross“-Präsentation bezeichnet [139].

Auch für die Erweiterung des Konzeptes synthetischer Vakzinen und ein potentielles Immunmonitoring ist die Methode der Aufreinigung von HSP-Pepdid-Komplexen durch die Möglichkeit der Isolation und Identifizierung HSP70-gebundener Peptide von Bedeutung. Abbildung 42 demonstriert einen entsprechenden methodischen Algorithmus.


[Seite 114↓]

Abb. 42)Methodische Vorgehensweise zur Isolation, Identifizierung und Re-Synthese HSP70-gebundener Peptide.

Aus diesen Untersuchungen ließe sich ableiten, welches Spektrum an Peptiden durch Stressproteine überhaupt gebunden werden kann und ob die HSP-Bindung mit einer krankheitsbedingten Überrepräsentation bestimmter Peptide einhergeht. Für die klinische Situation würde dies die weitere Etablierung HSP-basierter Vakzinen rechtfertigen. Durch den interindividuellen Vergleich von HSP70-, gp96- und MHC-I-assoziierten Peptiden aus primären Tumoren könnten gemeinsame Peptide identifiziert werden. Nach deren Synthese ließe sich das immunogene Potential dieser Peptide durch Testung mit von Patienten gewonnenen T-Zellen prüfen. Damit könnte einerseits das Immunmonitoring von Patienten in klinischen Studie differenziert werden, andererseits ließen sich Rückschlüsse ableiten für die Etablierung komplexer synthetischer HSP-Peptid-Vakzinen zur Therapie des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms.


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10.06.2004