Chemoimmuntherapie und immunologische Bedeutung von 70 kiloDalton Hitzeschockproteinen beim metastasierten Nierenzellkarzinom

Habilitationsschrift

zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach

UROLOGIE

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von

Herrn Dr. med. Jan Roigas


geboren am 16. Februar 1965 in Potsdam

Dekane:
Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen
Prof. Dr. med. Martin Paul

eingereicht am:September 2003

Datum des öffentlich-wissenschaftlichen Vortrags: 18. März 2004

Gutachter:
1. Prof. Dr. A. Hofstetter
2. Prof. Dr. P. Fornara

Abstract

The cytokines interleukin-2 and interferon-a2a are of central importance in the treatment of patients with metastatic renal cell cancer. In the clinical part of the thesis the efficacy of chemoimmunotherapy was investigated monocentrically on 107 patients. It appeared a rate of objective remissions of 22% (95% CI 14.6 - 31.3%) and an additional rate of temporary disease stabilisations of 46%. The median survival was 19 months, with a calculated 5-year survival rate of 17%. Multivariate analysis revealed a highly significant dependence on the Karnofsky-Performance-Index of the patients. In 83 patients with Karnofsky-Performance-Index over 80% the median survival was 23 months, with a calculated 5-year survival of 21%. These results justify the further investigation of the combination of interleukin-2, interferon-a2a, and 5-fluorouracil in prospective clinical studies.

In the context of the clinical aspects of cytokine-based immunotherapy it was the task of the the experimental part of the study to investigate the importance of 70 kDa heat shock proteins (HSP70) in renal cell cancer. Besides their function in cellular stress processing, members of the HSP70 family (HSP72 and HSP73) are especially important for answering questions of tumor immunology resulting from their immunological signal function, the HSP72-mediated interaction of immunological effector cells with tumor cells, and from the involvement of HSP70 in peptide processing in malignant cells.

On the basis of a renal cancer cell line and of primary cells of renal carcinomas the HSP72 expression on the surface of tumor cells could be demonstrated by flow cytometry and correlated with an increased lysis of tumor cells on the cell line by interleukin-2 stimulated natural killer cells. In contrast to the findings so far reported in the literature, the present model revealed that the membrane expression of HSP72 was not limited to malignant cells but was detectable in renal cells of normal tissue too. In an immunohistochemical study on basal cytoplasmatical HSP72 expression, a univariate analysis showed a significant correlation of high HSP72 expression and patient survival. In a multivariate analysis the extent of the HSP72 expression could be identified as an independent prognostic parameter that was also correlated with the response of patients to chemoimmunotherapy.

The clinical establishment of specifically effective vaccines plays a central part in the development of new treatment strategies for metastatic renal cell cancer. In this context, vaccines on the basis of HSP-peptides are of special interest. Therefore, the experimental part of the work was also aimed at developing a method for enriching HSP70-peptide complexes. With ADP affinity chromatography a method for concentrating HSP70-peptide complexes from tumor cells was created, which proved to be usable and was patented. On the one hand, HSP70-peptide complexes can be used for HSP-based vaccine programmes, on the other hand, they can serve for identifying and characterizing HSP70-bound biologically active (immunogenic) peptides.

The present findings demonstrate that HSP72 per se has a prognostic value in renal cell cancer and point to the potential importance of HSP72 as an immunological target structure. The results represent new approaches to a deeper understanding of the immunological properties of renal cell carcinoma and give a basis from which to establish innovative vaccination programmes for the treatment of advanced renal cell carcinoma.

Keywords: metastatic renal cell cancer, immunotherapy, heat shock proteins, immunological function

Zusammenfassung

Die Zytokine Interleukin-2 und Interferon-a2a nehmen eine zentrale Stellung bei der Behandlung von Patienten mit metastasierten Nierenzellkarzinomen ein. Im klinischen Teil der Arbeit wurde die Effektivität der Chemoimmuntherapie monozentrisch an 107 Patienten untersucht. Es zeigte sich eine Rate objektiver Remissionen von 22 % (95 % CI 14,6 - 31,3 %) mit einer zusätzlichen Rate an vorübergehenden Stabilisierungen von 46 %. Das mediane Überleben lag bei 19 Monaten mit einer kalkulierten 5-Jahres-Überlebensrate von 17 %. In der multivariaten Analyse zeigte sich eine hochsignifikante Abhängigkeit vom Karnofsky-Performance-Index der Patienten. Bei den 83 Patienten mit einem Karnofsky-Performance-Index von über 80 % lag das mediane Überleben bei 23 Monaten mit einer kalkulierten 5-Jahres-Überlebensrate von 21 %. Diese Untersuchungsergebnisse rechtfertigen eine weitere Prüfung der Kombination von Interleukin-2, Interferon-a2a und 5-Fluorourazil im Rahmen prospektiver klinischer Studien.

In Weiterentwicklung der klinischen Aspekte zur Zytokin-basierten Immuntherapie war es die Aufgabenstellung des experimentellen Teils dieser Arbeit, die Bedeutung von 70 kDa Hitzeschockproteinen (HSP70) beim Nierenzellkarzinom zu untersuchen. Neben ihrer Funktion im Rahmen der zellulären Stressverarbeitung haben Mitglieder der HSP70-Familie (HSP72 und HSP73) eine außerordentliche Bedeutung für tumorimmunologische Fragestellungen erlangt, die sich aus der immunologischen Signalfunktion, der HSP72-vermittelten Interaktion von immunologischen Effektorzellen und Tumorzellen und der Beteiligung von HSP70 an der Peptidprozessierung in malignen Zellen ergeben.

An einer Nierenkarzinomzelllinie und an Primärzellen von Nierenkarzinomen konnte die HSP72-Oberfächenexpression durchflusszytometrisch auf der Tumorzelloberfläche nachgewiesen und an der Zelllinie mit einer erhöhten Lyse der Tumorzellen durch Interleukin-2 stimulierte NK-Zellen korreliert werden. Im Gegensatz zu bisherigen Literaturbefunden zeigte sich in diesem Modell jedoch, dass die Membranexpression von HSP72 nicht nur auf maligne Zellen beschränkt, sondern auch bei renalen Zellen aus Normalgewebe nachzuweisen war. In einer immunhistochemischen Studie zur basalen, zytoplasmatischen HSP72-Expression zeigte sich univariat eine signifikante Korrelation einer hohen HSP72-Expression und dem Überleben der Patienten. In einer multivariaten Analyse konnte das Ausmaß der HSP72-Expression als unabhängiger prognostischer Parameter identifiziert werden, der auch mit dem Ansprechen auf eine Chemoimmuntherapie korreliert.

Die klinische Etablierung spezifisch wirksamer Vakzinen nimmt eine zentrale Rolle bei der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden des metastasierten Nierenzellkarzinoms ein. Dabei spielen Vakzinen auf der Basis von HSP-Peptid-Vakzinen eine besondere Rolle. Ein weiterer Bestandteil der experimentellen Arbeiten war daher in der Entwicklung einer Methode zur Aufreinigung von HSP70-Peptid-Komplexen. Mit der ADP-Affinitätschromatographie konnte eine Methode zur Anwendung gebracht und patentiert werden, durch die sich HSP70-Peptid-Komplexe aus Tumorzellen anreichern lassen. Die HSP70-Peptid-Komplexe sind einerseits für HSP-basierte Vakzinekonzepte verfügbar oder können andererseits für die Identifikation und Charakterisierung HSP70-gebundenener biologisch-aktiver (immunogener) Peptide genutzt werden.

Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse demonstrieren, dass HSP72 per se eine prognostische Bedeutung beim Nierenzellkarzinom besitzt und weisen auf die potentielle Bedeutung von HSP72 als immunologische Zielstruktur hin. Die Resultate stellen neue Ansätze zum tieferen Verständnis der immunogenen Eigenschaften des Nierenzellkarzinoms dar und liefern Ausgangspunkte für die Etablierung innovativer Vakzinationskonzepte bei der Behandlung des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms.

Eigene Schlagworte: metastasiertes Nierenzellkarzinom, Immuntherapie, Hitzeschockproteine, immunologische Bedeutung

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Nierenzellkarzinom
  • 1.2. Stand der Forschung
    • 1.2.1. Therapie des metastasierten Nierenzellkarzinoms
    • 1.2.2. Hitzeschockproteine
• 2.  Aufgabenstellung
• 3.  Material und Methoden
  • 3.1. Chemoimmuntherapie
    • 3.1.1. Patientengut
    • 3.1.2. Therapieplan
    • 3.1.3. Statistische Auswertung
  • 3.2. Chemoimmuntherapie und synchrone Bestrahlung
    • 3.2.1. Patientengut
    • 3.2.2. Therapieplan
    • 3.2.3. Statistische Auswertung
  • 3.3.  venösen Tumorthromben der Stadien III und IV (nach Staehler)
    • 3.3.1. Patientengut
    • 3.3.2. Präoperative Vorbereitung
    • 3.3.3.  Intraoperative Technik – Vena-cava-Zapfen im Stadium III
    • 3.3.4. Intraoperative Technik – Vena-cava-Zapfen im Stadium IV
    • 3.3.5. Postoperatives Management
    • 3.3.6.  Chemoimmuntherapie
    • 3.3.7. Statistische Auswertung
  • 3.4. Tumor M2-Pyruvatkinase (TU M2-PK)
    • 3.4.1. Patientengut
    • 3.4.2. Messung der TU M2-PK
    • 3.4.3. Statistische Auswertung
  • 3.5. HSP72-Zellmembranexpression
    • 3.5.1. Zelllinien und Kulturbedingungen
    • 3.5.2. Isolation und Kultivierung von Primärkulturen
    • 3.5.3. Verifizierung der epithelialen Herkunft der Zellen
    • 3.5.4.  Hyperthermieexposition
    • 3.5.5. Durchflusszytometrische Untersuchungen
    • 3.5.6. Membranpräparation
    • 3.5.7.  Western Blot
    • 3.5.8. Isolation von NK-Zellen
    • 3.5.9. In vitro zellvermittelte Lyseexperimente
  • 3.6. zytoplasmatische HSP72-Expression
    • 3.6.1. Karzinom- und Normalgewebe
    • 3.6.2.  Patientengut
    • 3.6.3.  Immunhistochemische Untersuchungen
    • 3.6.4.  Semiquantitative Erfassung der HSP72-Expression
    • 3.6.5. Statistische Auswertung
  • 3.7.  HSP70-Peptid-Komplexe
    • 3.7.1. Zelllinien und Kulturbedingungen
    • 3.7.2. Anreicherung von HSP70-Peptid-Komplexen
    • 3.7.3. Western Blots
    • 3.7.4.  Tierexperimentelle Untersuchungen
• 4.  Ergebnisse
  • 4.1. Klinischer Teil
    • 4.1.1. Chemoimmuntherapie beim metastasierten Nierenzellkarzinom
    • 4.1.2. Chemoimmuntherapie und synchrone Bestrahlung
    • 4.1.3. Therapie von Patienten mit venösen Tumorthromben der Stadien III und IV (nach Staehler)
    • 4.1.4.  Tumor M2-Pyruvatkinase (TU M2-PK) beim Nierenzellkarzinom
  • 4.2.  Experimenteller Teil
    • 4.2.1. Zellmembranexpression des induzierbaren 72 kDa Hitzeschockproteins beim Nierenzellkarzinom
    • 4.2.2. Zytoplasmatische Expression des induzierbaren 72 kDa Hitzeschockproteins beim Nierenzellkarzinom
    • 4.2.3. Anreicherung von HSP70-Peptid-Komplexen
• 5.  Diskussion
  • 5.1. Klinischer Teil
  • 5.2. Experimenteller Teil
• 6.  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG

Tabellen

• Tab. 1) Stadieneinteilung nach UICC [173].
• Tab. 2) Robson-Klassifikation mit der jeweils entsprechenden TNM-Klassifikation [155].
• Tab. 3) Einteilung des Vena-cava-Zapfen nach Staehler [179].
• Tab. 4) verschiedene HSP-Klassen
• Tab. 5) Faktoren, die die Synthese von HSP induzieren (adaptiert von [119]).
• Tab. 6) Patientencharakteristika
• Tab. 7) Therapieplan ( 36 Mio IU IL-2 und 9 Mio IU IL-2, 18 Mio IU IFN-α2a und 9 Mio IU IFN-α2a, 750 mg/m² KÖF 5-FU)
• Tab. 8) Ansprechverhalten nach Chemoimmuntherapie
• Tab. 9) Patientencharakteristika beider Therapiegruppen
• Tab. 10) Ansprechverhalten nach Chemoimmuntherapie (Dreifachtherapie) und unter Zugabe von 13-CRA (Vierfachtherapie)
• Tab. 11) Ergebnisse der multivariaten Analyse (* = signifikant).
• Tab. 12)Komplikationen (n=24)
• Tab. 13)Peri- und postoperative Ergebnisse aller Patienten (n=24).
• Tab. 14)Multivariate Analyse zum Einfluss verschiedener Faktoren auf das Überleben der Patienten (* = signifikant).
• Tab. 15)Sensitivität der TU M2-PK bei den verschiedenen Subgruppen der Patienten.
• Tab. 16) Darstellung der HSP72-Expression von Metastasen und den korrespondierenden Primärtumoren.
• Tab. 17)Beziehung zwischen Sensitivität und Spezifität verschiedener HSP72-Cut-offs für das Gesamtüberleben.
• Tab. 18)Beziehung zwischen Sensitivität und Spezifität verschiedener HSP72-Cut-offs für das Ansprechen auf eine Chemoimmuntherapie (CR/PR vs. SD/PD).
• Tab. 19)Multivariate Analyse (* = signifikant).
• Tab. 20)Kreuztabelle (HSP72-Expression und Metastasierungsstatus, p=0,001, Mantel-Haenszel-Test).
• Tab. 21)Klinische Studien mit therapeutischem Konzept zur Behandlung etablierter, messbarer Metastasen (* – keine Angabe, ob es sich um eine R0-Situation oder um etablierte Metastasen handelt; k.A. – keine Angabe).
• Tab.22)Klinische Studien mit prophylaktischem Therapiekonzept nach chirurgischer Entfernung des Primärtumors oder von Metastasen (* Metastasen kolorektaler Karzinome).

Bilder

• Abb. 1)Überlebenswahrscheinlichkeit für 104 Patienten
• Abb. 2)Überlebensanalyse in Abhängigkeit vom Ansprechverhalten
• Abb. 3)Überlebenswahrscheinlichkeiten beider Therapiegruppen
• Abb. 4)Überlebenswahrscheinlichkeit bei Patienten mit einem KPI > bzw. < 80 %.
• Abb. 5)Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit vom Grading des Primärtumors
• Abb. 6)Überlebenswahrscheinlichkeit bei den „first-line“ Patienten.
• Abb. 7)Überlebenswahrscheinlichkeit bei den „second-line“ Patienten.
• Abb. 8)Überlebensanalyse der 24 Patienten mit venösen Tumorthromben im Vergleich zu den 75 Patienten der Kontrollgruppe. Das mediane Überleben unterschied sich nicht signifikant (50 Monate ohne Zapfen vs. 45 Monate mit Zapfen, p=0,3522, Log-Rank-Test).
• Abb. 9)Überlebenswahrscheinlichkeit bei 18 metastasierten Patienten. Das mediane Überleben betrug 37 Monate mit Chemoimmuntherapie (CIT) vs. 10 Monate ohne CIT. Die Unterschiede waren im Log-Rank-Test marginal signifikant (p=0,1270). Im Breslow-Test wurde das Signifikanzniveau erreicht (p=0,0500).
• Abb. 10)Übersicht der Konzentrationen der TU M2-PK im Plasma von Kontrollpersonen und Patienten mit BPH, Prostatakarzinom (PCA), Urothelkarzinom (UCA) und Nierenzellkarzinom (NZK), (m – metastasiert). Es sind Einzelwerte und Mediane dargestellt. Signifikante Unterschiede bestanden nur bei den Nierenzellkarzinomgruppen untereinander und zu den Kontrollpersonen.
• Abb. 11)Darstellung aller 68 TU M2-PK-Werte (Einzelwerte und Median). Bei 48 Patienten lag der Wert oberhalb des empfohlenen Cut-offs von 15 kU/l, was einer Sensitivität von 71 % entspricht.
• Abb. 12)Darstellung des signifikanten Unterschiedes zwischen G2 (n = 36) und G3 (n = 18) Nierenzellkarzinomen. Bei 2 Patienten lag ein G1-Karzinom vor und bei 12 Patienten war das primäre Grading nicht bekannt.
• Abb. 13)Verläufe der TU M2-PK Untersuchungen unter Chemoimmuntherapie, 13a – Patienten mit PR, 13b – Patienten mit SD, 13c – Patienten mit PD, in Klammern die jeweilige Probenanzahl zum Untersuchungszeitpunkt.
• Abb. 14)Logarithmische Darstellung der Fluoreszenzintensität bei ACHN und PC-3 Zellen nach nicht-letaler Hyperthermieexposition von 41,8 °C für 180 Minuten (___) im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle (·····). Während bei ACHN Zellen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität zu verzeichnen war, blieb das Signal bei PC-3 Zellen nahezu unverändert.
• Abb. 15)HSP72-Western-Immunoblots von einem Lysat hyperthermierter ACHN-Zellen als positive Kontrolle (nach Hyperthermie von 43,5 °C für 60 Minuten (A) und gepoolter Membranfraktionen von ACHN-Zellen nach nicht-letaler Hyperthermie von 41,8 °C für 180 Minuten (B). Die Erholungsphase betrug jeweils 16 Stunden. Säule S repräsentiert molekulare Markerproteine als Standard.
• Abb. 16)Darstellung der linearisierter Mittelwerte der Fluoreszenzintensitäten als Prozent bei Kontrollen und hyperthermierten ACHN-Zellen und jeweiliger passiver Inkubation mit HSP72. Die Fluoreszenzintensität der Kontrollen wurde 100 % gesetzt. Es konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden zwischen den hyperthermierten Zellen und den Zellen, die neben der Hyperthermie noch passiv mit HSP72 inkubiert worden waren.
• Abb. 17)Zeitliche Dynamik der HSP72-Membranexpression auf ACHN-Zellen gemessen zwischen 0 bis 48 Stunden nach Hyperthermiebehandlung. Es zeigte sich ein Maximum im Bereich von 8 bis 16 Stunden (K=nicht-hyperthermierte Kontrolle).
• Abb. 18)Zeitliche Dynamik der MHC-Expression auf ACHN-Zellen zwischen 0 bis 48 Stunden. Der Vergleich mit dem Ausgangswert nicht-hyperthermierter Zellen (K) zeigt, dass es insbesondere zum den Zeitpunkten 0 und 2 Stunden zu einem Abfall der MHC-Expression kommt. Aufgrund von nur 2 Einzelexperimenten pro Zeitpunkt lag statistische Signifikanz nicht vor.
• Abb. 19)Anreicherung von NK-Zellen aus peripherem Blut (PBL=periphere Blutlymphozyten) durch negative Selektion und Nachweis mit der Simultest-Lösung (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Bei Proband 1 gelang eine Anreicherung von 14,6 % auf 76,8 % (obere Bilder) und bei Proband 2 von 14,0 % auf 87,5 % (untere Bilder).
• Abb. 20)Lyseexperimente mit hyperthermierten und nicht-hyperthermierten ACHN- und PC-3-Zellen als Zielzellen und IL-2-stimulierten NK-Zellen von 2 Probanden ( Kontrolle, Hyperthermie, mAb-blockiert).
• Abb. 21)Darstellung der basalen und hyperthermieinduzierten HSP72-Expression auf Nierenkarzinomzellen. Bei Probe 1 lässt sich eine deutliche basale Expression mit einer nochmaligen Steigerung nach Hyperthermie im Vergleich zur Isotyp-Kontrolle nachweisen. Bei Probe 2 ist die basale Expression gering, nach Hyperthermie kommt es jedoch auch hier zu einem Anstieg der Fluoreszenzintensität.
• Abb. 22)Basal wiesen 27 Proben eine HSP72-Expression im Vergleich zu den Isotyp-Kontrollen auf. Die Hyperthermieexposition führte zu einer signifikanten Steigerung der HSP72-Expression (p<0,0001, Wilcoxon-matched-pairs-Test).
• Abb. 23)Aus den Daten der basalen und stressinduzierten HSP72-Expression wurde der jeweilige Faktor der Intensitätserhöhung ermittelt (0- bis 13,3fach).
• Abb. 24)HSP72-Membranexpression in Abhängigkeit von der T-Kategorie (Mann-Whitney-Test, p=0,0079).
• Abb. 25)HSP72-Membranexpression in Abhängigkeit von der Metastasierung (Mann-Whitney-Test, p=0,0313).
• Abb. 26)Überleben der Patienten in Abhängigkeit der hyperthermieinduzierten HSP72-Membranexpression. Das mediane Überleben betrug 66 Monate in der Gruppe HSP72 < 100 % und wurde in der anderen Gruppe in der Nachbeobachtungsphase nicht erreicht p=0,0369, Log-Rank-Test).
• Abb. 27)Darstellung der basalen und Hyperthermie-induzierten Expression (41,8 °C für 180min) von MHC-Molekülen an Nierenkarzinomzellen. Die Unterschiede sind nicht signifikant (p=0,4143, Wilcoxon-matched-pairs-test).
• Abb. 28)Basale und stressinduzierte HSP72-Expression an benignen epithelialen Nierenzellen (p=0,0302, Wilcoxon-matched-pairs-test).
• Abb. 29)Darstellung repräsentativer Färbungen in Nierengewebe je nach Ausprägungsgrad (200fache Vergrößerung): a – Normalgewebe mit HSP72-Expression in den Tubulusepithelzellen; b – Karzinomgewebe ohne HSP72-Expression (Intensitätsgrad 0); c – Karzinomgewebe mit schwacher Expression (Intensitätsgrad 1), d – Karzinomgewebe mit mäßiger Expression (Intensitätsgrad 2); e – Karzinomgewebe mit starker Expression (Intensitätsgrad 3); f – pulmonale Metastase mit starker Expression (Intensitätsgrad 3).
• Abb. 30)Darstellung der HSP72-Expression bei Patienten ohne (M0) und mit (M1) Fernmetastasen. Es wurden Einzelwerte und Mediane abgebildet.
• Abb. 31)Patienten mit objektiven Remissionen wiesen eine signifikant höhere HSP72-Expression auf, als Patienten die stabil blieben oder nicht auf die Therapie ansprachen. Es wurden Einzelwerte und Mediane abgebildet.
• Abb. 32)Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der T-Kategorie mit Angabe der Patienten „at risk“. Das mediane Überleben für die Gruppe T1/2 wurde nicht erreicht. Es lag in der Gruppe T3/4 bei 43 Monaten, (p=0,0216, Log-Rank-Test).
• Abb. 33)Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der Metastasierung mit Angabe der Patienten „at risk“. Das mediane Überleben für die Gruppe M0 wurde nicht erreicht. Es lag in der Gruppe M1 bei 43 Monaten, (p=0,0004, Log-Rank-Test).
• Abb. 34)Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit in Abhängigkeit der HSP72-Expression mit Angabe der Patienten „at risk“. Das mediane Überleben für die Gruppe HSP72 > 1,7 wurde nicht erreicht. Es lag in der Gruppe HSP72 < 1,7 bei 43 Monaten, (p=0,0040, Log-Rank-Test).
• Abb. 35)Darstellung der Überlebenswahrscheinlichkeit bei Patienten, die eine Chemoimmuntherapie erhalten hatten in Abhängigkeit der HSP72-Expression mit Angabe der Patienten „at risk“. Das mediane Überleben für die Gruppe HSP72 > 1,7 wurde nicht erreicht. Es lag in der Gruppe HSP72 < 1,7 bei 14 Monaten (p=0,0454, Log-Rank-Test). Das Ansprechverhalten wurde in dieser Darstellung nicht berücksichtigt. Bei 3 der 5 Patienten mit einem HSP-Wert > 1,7 traten jedoch objektive Remissionen unter Chemoimmuntherapie auf.
• Abb. 36)Grundprinzip der Anreicherung von HSP70-Peptid-Komplexen
• Abb. 37)Fraktionen (1 – 12, je 1 ml) der Affinitätschromatographie mit spezifischer Färbung gegen HSP70 (Antikörper N27F3-4, Stressgen Corp., Victoria, BC, Kanada, Probeneinsatz 50 µl).
• Abb. 38)Eluate der ADP-Affinitätschromatographie.
• Abb. 39)HPLC der an HSP70-gebundenen Peptide einer Nierenkarzinomprobe nach ADP-Affinitätschromatographie, ATP-Inkubation und < 3 kDa Ultrafiltration. Das breit verschmierte UV-Profil weist auf eine hohe Komplexität der HSP70 assoziierten Peptide hin. Die Bereitstellung der Abbildung erfolgte freundlicherweise durch Herrn R. Demine und Herrn Prof. Dr. P. Walden, Klinik und Poliklinik für Dermatologie, Universitätsklinikum Charité.
• Abb. 40)CT-Aufnahme einer 35jährigen Patientin mit einem metastasierten NZK, pT3a G3 pN2 M0, Zustand nach R2-Operation und nachfolgend progredienten retroperitonealen Lymphknotenmetastasen mit Schmerzen und drohendem Ileus. Die Patientin wurde mit 3 Zyklen Chemoimmuntherapie und synchroner perkutaner Bestrahlung im ersten Zyklus behandelt. Es wurde eine CR erzielt. Die CT-Aufnahmen zeigen den retroperitonealen Befund vor (linkes Bild) und nach (rechtes Bild) kombinierter Therapie. Die Patientin ist auch 47 Monate nach Therapiebeginn in der CR.
• Abb. 41)Darstellung normaler, positiv anti-HSP72-gefärbter Tubulusepithelzellen (a, Vergrößerung 1:200), stark gefärbter Karzinomzellen (b, Intensitätsgrad 3, Vergrößerung 1:400) und Karzinomzellen, bei denen das Zytoplasma kaum angefärbt ist (c und d, Vergrößerung 1:400). In den benignen Tubulusepithelzellen und den Karzinomzellen von Präparat b ist das Zytoplasma positiv angefärbt. In den Karzinomzellen der Präparate c und d ist eine spezifische Anfärbung von Zellmembranen erkennbar (Pfeil).
• Abb. 42)Methodische Vorgehensweise zur Isolation, Identifizierung und Re-Synthese HSP70-gebundener Peptide.