Sander, Thomas: Molekulargenetische Kartierung von genetischen Determinanten bei idiopathisch generalisierten Epilepsien

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Epidemiologische Genetik der Epilepsien

Das Krankheitsbild PrimeEpilepsiePrime ist klinisch durch das wiederholte Auftreten PrimeunprovozierterPrime epileptischer Anfälle gekennzeichnet, denen neurophysiologisch eine paroxysmal auftretende, synchronisierte zerebrale Erregungssteigerung zugrunde liegt. Epilepsie ist die häufigste chronische Erkrankung des zentralen Nervensystems. Ca. 3% der Bevölkerung erkranken im Laufe ihres Lebens an einer Epilepsie, meistens jedoch nur vorübergehend. Die Punktprävalenz aktiver Epilepsien liegt bei 0,7% in den europäischen Ländern. Inklusive der häufigen epileptischen Gelegenheitsanfälle (Fieberkrämpfe, Alkoholentzugsanfälle, etc.) erleiden ca. 6% der Allgemeinbevölkerung mindestens einmal einen epileptischen Anfall. Aus den oft lebenslangen Erkrankungsverläufen und einer Therapieresistenz bei ca. 20% aller Betroffenen resultiert der bedeutende Stellenwert der Epilepsien in der neurologischen Praxis. Ein Schwerpunkt der wissenschaftlichen Forschung ist es deshalb, die molekularen Mechanismen der Epileptogenese aufzuklären, um effiziente Therapieansätze zur Epilepsie-Behandlung zu entwickeln und diese differentiell bei Epilepsie-Patienten einzusetzen.

Bei ca. 50% aller Epilepsien lassen sich exogene Faktoren (Hirntrauma, perinatale Hirnschädigung, Encephalitis, Hirnmißbildung, Tumor, etc.) als auslösende Ursache der Epilepsie ermitteln. Genetische Einflüsse spielen bei diesen symptomatischen Epilepsien eine untergeordnete Rolle. Die Ätiologie der übrigen Epilepsien erscheint überwiegend genetisch determiniert. Dies gilt besonders für die idiopathischen Epilepsien, bei denen eine exogene Ursache nicht eruierbar ist und epileptische Anfälle das einzige Erkrankungssymptom darstellen. Allerdings sind nur ca. 2% aller Epilepsien auf das Vorliegen eines einzelnen Gendefekts zurückzuführen. Bei der Mehrzahl genetisch determinierter Epilepsien sind mehrere genetische Faktoren an der Epileptogenese beteiligt. Die raschen Fortschritte in der Molekulargenetik erlauben es, die Genstörungen von genetisch determinierten Epilepsien zu identifizieren und deren molekulare Pathogenese aufzuklären. Die idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE) bieten für molekulargenetische Forschungsansätze die besten Voraussetzungen.


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1.2 Idiopathisch generalisierte Epilepsien

Die idiopathisch generalisierten Epilepsien (IGE) repräsentieren ca. 40% aller Epilepsien. Klinisch weisen das Anfallsbild und das Elektroencephalogramm (EEG) auf einen bilateral synchronen Beginn der zerebralen Erregungssteigerung in beiden Hirnhemisphären hin. Elektroencephalographisch finden sich generalisierte spike-wave Komplexe während der Anfälle. Abgesehen von epileptischen Anfällen sind IGE-Patienten neurologisch unauffällig, und ihre psychomotorische Entwicklung verläuft normal. Neurophysiologisch liegt der generalisierten zerebralen Erregungssteigerung eine Aktivierung thalamo-cortico-thalamischer Erregungsbahnen zugrunde, die durch synchronisierte Entladungssalven von Neuronen im Nucleus reticularis thalami initiiert werden (Avanzini et al., 1999). Pharmakologische Studien deuten auf eine besondere Rolle von T-Typ Kalziumströmen bei der Generierung von exzitatorischen Erregungssalven in den Neuronen des Nucleus reticularis thalami (Tsakiridou et al., 1995).

1.2.1 Klassifikation

Die aktuelle Klassifikation der Internationalen Liga Gegen Epilepsie (ILAE) unterscheidet sieben IGE-Syndrome anhand des Anfallstyps, des Manifestationsalters und des Erkrankungsverlaufs (Commission on Terminology and Classification, 1989). Die vorliegenden molekulargenetischen Analysen befassen sich mit den drei häufigsten IGE-Syndromen (Abb. 1): der Absence-Epilepsie des Kindesalters (CAE), der juvenilen Absence-Epilepsie (JAE) und der juvenilen myoklonischen Epilepsie (JME) (Janz, 1997). Die typische Anfallsform der idiopathischen Absence-Epilepsien (CAE, JAE) ist eine kurze, scharf abgegrenzte Bewußtseinsunterbrechung während der der Patient in seiner Tätigkeit innehält. Der Erkrankungsbeginn der CAE liegt zwischen dem 2. und 12. Lebensjahr und ist durch häufige Absencen (> 10/Tag; pyknoleptische Absencen) gekennzeichnet. Bei der JAE treten Absence-Anfälle eher sporadisch auf. Der Erkrankungsbeginn liegt zwischen dem 8. und 20. Lebensjahr. Die JME ist durch bilaterale Myoklonien meist der Schultern und Arme charakterisiert, die das Bewußtsein nicht merklich beeinträchtigen. Der Erkrankungsbeginn liegt zwischen dem 8. und 26. Lebensjahr. Sowohl die Absence-Anfälle, aber besonders die myoklonischen Anfälle,


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treten tageszeitlich gehäuft nach dem Erwachen auf. Wegen des zeitlich aufeinander folgendenden Auftretens von Absencen und myoklonischen Anfällen bei ca. 20% der IGE-Patienten und dem gemeinsamen Vorkommen von CAE, JAE und JME in Familien werden diese IGE-Syndrome des Kindes- und Jugendalters auch als ein neurobiologisches Spektrum aufgefaßt (Berkovic et al., 1987; Janz et al., 1992).

Abb. 1: Klassifikation der IGE des Kindes- und Jugendalters.

CAE: Absence-Epilepsie des Kindesalters;

JAE: juvenile Absence-Epilepsie;

JME: juvenile myoklonische Epilepsie.


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1.2.2 Klinische Genetik

Zwillings- und Familienstudien belegen, daß die Ätiologie der IGE vorwiegend genetisch determiniert ist (Übersicht in: Sander, 1996). Konkordanzraten von 80% bei eineiigen Zwillingen und von 5-15% bei zweieiigen Zwillingen sind jedoch auch hinweisend für die Beteiligung mehrerer genetischer Faktoren (Berkovic et al., 1998). Da konkordante eineiige Zwillinge stets den gleichen IGE-Subtyp aufweisen, während die Subtypen bei konkordanten zweieiigen Zwillingen häufig variieren, ist ebenfalls von einer genetischen Determinierung der einzelnen IGE-Syndrome auszugehen (Berkovic et al., 1998). Das familiäre Wiederholungsrisiko beträgt bei erstgradigen Verwandten ca. 5-10% (Beck-Mannagetta und Janz, 1991; Schmitz et al., 2000). Bei mehr als 90% der erkrankten Familienangehörigen finden sich wieder IGE-Syndrome und ca. 20-50% der Erkrankten weisen den gleichen IGE-Subtyp wie der Index-Patient auf (Beck-Mannagetta und Janz, 1991; Schmitz et al., 2000). Generalisierte Primespike and wavePrime Entladungen sind regelmäßig im Elektroencephalogramm (GSW-EEG) von IGE-Patienten und bei ca. 10-30% ihrer klinisch gesunden Familienangehörigen ersten Grades nachweisbar (Pedley, 1991). Das GSW-EEG könnte demnach eine subklinische Manifestation der genetischen Störungen darstellen.

1.2.3 Vererbungsmodus

Der Vererbungsmodus der häufigen IGE entspricht keinem einfachen Mendelschen Erbgang. Mehrere genetische Faktoren scheinen bei der Epileptogenese der IGE beteiligt zu sein (Greenberg et al., 1992). Die Anzahl und Zusammensetzung der beteiligten genetischen Faktoren sowie die Einflußgröße der Einzelfaktoren variieren zwischen den IGE-Erkrankten beträchtlich. Nur bei wenigen IGE-Erkrankten deutet das familiäre Vererbungsmuster auf eine Disposition durch einen einzelnen genetischen Faktor. Bei Familien mit mehreren IGE-Erkrankten ist die Beteiligung einiger weniger Genstörungen anzunehmen (oligogene Vererbung). Bei Familien mit sporadischen IGE-Erkrankten ist das Vorliegen einer polygenen Disposition am wahrscheinlichsten. Dabei sind eine Vielzahl von Genvarianten mit geringem pathogenetischen Einfluß an der Epileptogenese beteiligt. Die genetische Disposition bei IGE-Erkrankten stellt demnach ein genetisches Spektrum in


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Bezug auf die Effektstärke des bedeutendsten genetischen Faktors dar. Für molekulargenetische Studien sind Familien mit mehreren IGE-Erkrankten besonders aussichtsreich, da hier das Vorliegen eines Hauptgeneffekts angenommen werden kann. Aufgrund der klaren Phänotyp-Genotyp Beziehung bei den IGE mit monogenem Erbgang konnten hier bereits Genmutationen identifiziert werden (Übersicht in: McNamara, 1999). Es besteht ebenfalls die Aussicht, daß sich durch das molekulargenetische Verfahren der positionellen Klonierung die bedeutendsten Genvarianten bei den IGE-Syndromen mit komplexer genetischer Disposition ermitteln lassen.

1.3 Positionelle Klonierung

Zur positionellen Klonierung von Erkrankungsgenen wird zuerst die chromosomale Region der verantwortlichen Genstörung bestimmt, darauffolgend werden potentielle Erkrankungsgene in der Kandidatengenregion kloniert und die verantwortliche Genmutation durch Sequenzierung ermittelt. Die chromosomale Kartierung von Erkrankungsgenen erfolgt durch Kopplungsanalysen in Familienstudien. Das Prinzip der Kopplungsanalyse basiert auf einem strukturellen Umbau der Chromosomen durch den Austausch homologer Chromosomenabschnitte während der Keimzellbildung. Aufgrund der linearen Anordnung der Gene auf der chromosomalen DNS werden nur dicht nebeneinander liegende Genorte eines Chromosoms gemeinsam (physikalisch gekoppelt) vererbt. Die Austauschhäufigkeit zwischen zwei Genorten eines Chromosoms stellt ein Maß für deren positionellen Entfernung dar. Bei der molekulargenetischen Kopplungsanalyse erfolgt die Lokalisation des Erkrankungsgens durch den statistischen Nachweis einer gemeinsamen familiären Vererbung mit einem genetischen Markerpolymorphismus, dessen chromosomale Position bekannt ist. Als Standardverfahren der statistischen Kopplungsanalyse gilt die Lod score Methode (Lathrop & Lalouel, 1984), die als parametrisches Verfahren die Festlegung eines Erbgangs voraussetzt und ideal bei den monogenen Erbkrankheiten eingesetzt werden kann. Die Kopplungsevidenz wird als dekadischer Logarithmus des Quotienten der Wahrscheinlichkeit für eine Kopplung zwischen dem genetischen Marker und dem Erkrankungsmerkmal im Verhältnis zu der Wahrscheinlichkeit gegen eine Kopplung angegeben. Ein Verhältnis von 1000 : 1 zugunsten einer Kopplung entspricht einem Lod score von Z = 3, welcher als signifikanter


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Kopplungshinweis bei monogenen Erkrankungen akzeptiert wird. Da bei Erkrankungen mit komplexer genetischer Disposition ein Erbgang nicht eindeutig festlegbar ist, werden hier parameter-freie Analyseverfahren bevorzugt. Angewandt werden Testmethoden, die auf einem Häufigkeitsvergleich von gemeinsamen elterlichen Chromosomenabschnitten bei erkrankten Geschwistern beruhen (Primeaffected sibpairPrime Analysen). Voraussetzung für die systematische Suche nach einem Erkrankungsgen ist die Kartierung der menschlichen Chromosomen mit genetischen Marker-Polymorphismen. Derzeit verfügen die Marker-Karten über ein Auflösungsvermögen von durchschnittlich einem centiMorgan (1 cM entspricht ungefähr einer Million Basenpaare) (Dib et al., 1996). Die positionelle Klonierung von Genstörungen bei Erkrankungen mit einfachem Mendelschen Erbgang ist heutzutage ein Routineverfahren. Eine Herausforderung stellt noch die Aufklärung von Erkrankungen mit genetisch komplexer Disposition dar. Hier ergeben sich zahlreiche analytische Probleme, die die statistische Erfassung einzelner genetischer Determinanten erschweren. Von besonderer Bedeutung sind die komplexe genetische Disposition und die genetische Heterogenität, da Kopplungsanalysen nur häufige Hauptgeneffekte erfassen können (Lander & Schork, 1994). Infolge der komplexen genetischen Disposition ist vor allem bei kleineren Familien nicht erkennbar, ob ein Hauptgeneffekt an der Erkrankungsentstehung beteiligt ist, oder ob eine polygene Dispostion vorliegt. Bei der genetischen Heterogenität wird eine Erkrankung durch verschiedene Gene mit unterschiedlicher chromosomaler Lokalisation bedingt, ohne daß dies à priori durch klinische Hinweise differenzierbar ist. Durch die raschen Fortschritte der Molekulargenetik und die Verbesserung analytischer Methoden werden die Voraussetzungen geschaffen, auch bei den genetisch komplexen Erkrankungen, die beteiligten genetischen Determinanten zu ermitteln.


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1.4 Genstörungen bei monogenen idiopathischen Epilepsien

Durch die positionelle Klonierung von Genstörungen bei einigen idiopathischen Epilepsien mit monogenem Erbgang fanden sich erste Anhaltspunkte, daß Mutationen in Genen von Ionenkanälen zur Epileptogenese beitragen (Tab. 1) (Cooper & Jan, 1999). Allerdings beschränken sich diese Befunde noch auf einige wenige Großfamilien mit autosomal dominant vererbten idiopathischen Epilepsien. Bei zwei Familien mit autosomal dominanter nächtlicher Frontallappen-Epilepsie fanden sich Mutationen im Gen der alpha4-Untereinheit des neuronalen Acetylcholin-Rezeptors (CHRNA4, 20q13), bei den benignen familiären Neugeborenenanfällen wurden Mutationen in den Genen von zwei spannungsabhängigen Kaliumkanälen (KCNQ2, 20q13; KCNQ3, 8q24) ermittelt, und bei einer Familie mit generalisierten und febrilen Anfällen wurde eine Genstörung eines Natriumkanals (SCN1B, Chromosom 19q13.1) identifiziert (Übersicht in: McNamara, 1999). Ebenfalls bei vier Mausmutanten mit autosomal-rezessiv vererbter Absence-Epilepsie (tottering, lethargic, stargazer und die slow wave Mutante) fanden sich Genmutationen bei drei Untereinheiten neuronaler Kalziumkanäle (Cch1a, Cchb4, Cacng2) sowie bei einem Natrium-Hydrogen Ionenaustauscher (Nhe1) (Übersicht in: Puranam & McNamara, 1999). Es ist davon auszugehen, daß die Mutationen von Ionenkanalgenen Sonderfälle repräsentieren, bei denen eine besonders schwerwiegende Störung an einer kritischen Stelle der Erregungsbildung oder -ausbreitung im Gehirn die Manifestation eines Einzelfaktors zuläßt. Diese wegweisenden Schlüsselbefunde erlauben erste konkrete Einblicke in die funktionellen Störungen bei der Epileptogenese (Steinlein, 1998; McNamara, 1999). Es bleibt vorerst jedoch unklar, inwieweit vergleichbare genetische Funktionsstörungen an der Pathogenese der genetisch komplexen IGE beteiligt sind.


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Tab. 1: Genmutationen bei monogenen idiopathischen Epilepsien

idiopathische Epilepsien

Erbgang

Locus

Genort

Gen

Benigne familiäre

Neugeborenenanfälle

AD

AD

EBN1

EBN2

20q13.3

8q24

KCNQ2

KCNQ3

Autosomal dominante nächtliche

Frontallappenepilepsie

AD

ADNFLE

20q13.3

CHRNA4

Generalisierte Epilepsien

mit Fieberkrämpfen

AD

GEFS+1

19q13.3

SCN1B

AD: autosomal dominant

CHRNA4: Gen der alpha4-Untereinheit des nikotinergen Acetylcholinrezeptors;

KCNQ2, KCNQ3: Gene spannungsabhängiger Kaliumkanäle;

SCN1B: Gen der beta1-Untereinheit von spannungsabhängigen Natriumkanälen.

1.5 Kopplungshinweise bei den genetisch komplexen IGE

Kopplungsstudien bei häufigen IGE-Syndromen haben zur Lokalisation einer Reihe von potentiellen Erkrankungsloci geführt (Tab. 2), die in der Mehrzahl als ungenügend bestätigt gelten und derzeit noch kontrovers diskutiert werden (Übersicht in: Gardiner, 1999). Erkrankungsloci wurden für die JME in den chromosomalen Regionen 6p21.3 (EJM1) (Greenberg et al., 1988, 1995, 2000; Durner et al., 1991; Sander et al., 1995, 1997), 6p11 (Serratosa et al., 1996; Liu et al., 1996) und 15q14 (Elmslie et al., 1997) kartiert. In einem Kollektiv von Familien mit CAE-Erkrankten und in Familien mit IGE-Erkrankten wurden Erkrankungsloci in der chromosomal Region 8q24 identifiziert (Zara et al., 1995; Fong et al., 1998). In Familien mit IGE-Erkrankten, aber ohne JME-Angehörige, fand sich ein signifikanter Kopplungsbefund mit dem chromosomalen Segment 8p11 (Durner et al., 1999). Bisher konnte bei keiner der aufgeführten Kandidatenregionen eine verantwortliche Genveränderung ermittelt werden. Die Hauptgründe für die noch ungeklärten und scheinbar widersprüchlichen Befunde sind die komplexe genetische Ätiologie der häufigen IGE und die genetische Heterogenität der beteiligten Hauptgeneffekte (Lander & Schork, 1994), deren Bedeutung und Ausmaß derzeit nicht sicher eingeschätzt werden können.


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Anhand klinischer Kriterien lassen sich keine eindeutigen Phänotyp-Genotyp Beziehungen ableiten, so daß die bisherigen Kopplungsstudien als explorative Analysen durchgeführt wurden. Simulationsstudien deuten darauf hin, daß wesentlich größere Familienkollektive, als bisher untersucht, nötig sein werden, um komplexe genetische Einflüsse und deren interaktives Zusammenspiel erfassen zu können (Goldin et al., 1991; Badner et al., 1998). Solche Projekte können nur im Rahmen multizentrischer und multidisziplinärer Kollaborationen realisiert werden. Eine Voraussetzung dafür ist die exakte Erfassung der Epilepsie-Phänotypen anhand definierter Forschungskriterien, die eine uniforme und differenzierte Klassifikation des Erkrankungsmodells gestatten. Diese Rahmenbedingungen wurden von unserer Forschergruppe durch die Konstitution des PrimeEuropean Consortiums on the Genetics of Idiopathic Generalised EpilepsyPrime geschaffen.

Tab. 2: Kopplungshinweise bei IGE mit komplexer genetischer Disposition

IGE-Syndrom

Erbgang

Erkrankungslocus

Kandidatengen

IGE und FC

AR

8q24 (EGI)

unbekannt

CAE

AR

8q24

unbekannt

IGE ohne JME

AR

8p11

CHRNB3 ?

JME

AD

AD

AR

6p21.3 (EJM1)

6p11 (EJM2)

15q14 (EJM3)

GABA-BR1 ?

unbekannt

CHRNA7 ?

AD: autosomal dominant; AR: autosomal rezessiv;

FC: Fieberkrämpfe

CHRNB3: Gen der ß3 Untereinheit des neuronalen, nikotinergen Acetylcholin Rezeptors;

CHRNA7: Gen der alpha7 Untereinheit des neuronalen, nikotinergen Acetylcholin Rezeptors;

GABA-BR1: Gen der R1-Untereinheit des GABAB Rezeptors


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1.6 Neurogenetische Hypothesen

Die häufigen IGE-Syndrome (CAE, JAE und JME) sind als Prototypen einer Erkrankung mit komplexer genetischer Disposition für molekulargenetische Studien besonders geeignet, aufgrund:

  1. ihrer klinisch eindeutigen Charakterisierung;
  2. ihrer nahezu ausschließlichen genetischen Ätiologie;
  3. dem fehlenden Anhalt für exogene Einflüsse;
  4. dem Vorkommen von charakteristischen EEG-Veränderungen
    als neurophysiologische Determinante.

Die genetische Disposition dieser IGE-Syndrome wird durch das interaktive Zusammenspiel mehrerer genetischer Faktoren bestimmt. Es ist anzunehmen, daß die Anzahl und Effektstärke von Einzelfaktoren interindividuell stark variieren. Familien mit mehreren erkrankten Angehörigen bieten die besten Chancen für die Erfassung von häufigen Hauptgeneffekten (Goldin et al., 1991; Badner et al., 1998). Das häufige, zeitlich aufeinanderfolgende Auftreten von Absence-Anfällen und bilateralen myoklonischen Anfällen bei ca. 20% der IGE-Patienten sowie das gemeinsame familiäre Vorkommen von CAE, JAE und JME deuten auf das Vorliegen einer gemeinsamen genetischen Disposition hin. Das Ziel der vorliegenden molekulargenetischen Studien ist es, genetische Faktoren der IGE chromosomal zu lokalisieren, um ihre positionelle Klonierung zu ermöglichen. Durch die Funktionsanalyse der ermittelten Genstörungen werden die Grundlagen geschaffen, die molekularen Mechanismen der Epileptogenese aufzuklären.


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Mon Sep 16 14:56:46 2002