Sander, Thomas: Molekulargenetische Kartierung von genetischen Determinanten bei idiopathisch generalisierten Epilepsien

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Kapitel 2. Ergebnisse der molekulargenetischen Studien

2.1 Molekulargenetische Analysen bei der juvenilen myoklonischen Epilepsie

Die juvenile myoklonische Epilepsie (JME) repräsentiert ca. 7% aller Epilepsien. Das Erkrankungsbild ist gekennzeichnet durch bilaterale Myoklonien in den Schultern und Armen ohne Einschränkung des Bewußtseins (Janz, 1997). Die myoklonischen Anfälle beginnen zwischen dem 8. und 26. Lebensjahr und ereignen sich tageszeitlich vorwiegend nach dem Aufwachen. Ca. 30% der Patienten haben zusätzlich Absencen und in 95% Aufwach-Grand mal. Das familiäre Wiederholungsrisiko für Epilepsien beträgt bei erstgradigen Verwandten ca. 5% (Beck-Mannagetta & Janz, 1991). Bei mehr als 90% der erkrankten Familienangehörigen finden sich erneut IGE-Syndrome. Davon erkranken ca. 30% wiederum an einer JME und weitere 30% an einer CAE oder JAE (Beck-Mannagetta & Janz, 1991; Schmitz et al., 2000). Die JME ist aufgrund ihrer eindeutigen klinischen Charakterisierung, der ausschließlich genetischen Ätiologie und der neurogenetischen Überschneidung mit anderen IGE-Syndromen für die molekulargenetische Identifizierung von häufigen IGE-Genen besonders geeignet.

Bereits 1988 publizierten Greenberg & Mitarb. eine signifikante Kopplung von JME sowie assoziierten IGE und generalisierten EEG-Paroxysmen mit Proteinmarkern in der chromosomalen Region des HLA-Komplexes (Chromosomenabschnitt 6p21.3). Unsere molekulargenetischen Kopplungsstudien konnten diesen Kopplungsbefund mit DNS-Markern im Bereich des HLA-DQ Locus bestätigen (Durner et al., 1991; Sander et al., 1995, 1997, 2000). In unserer ersten Studie waren 21 Familien von JME-Patienten mit 143 Familienangehörigen eingeschlossen worden (Durner et al., 1991). Bei 122 Familienmitgliedern wurden zwei Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLP) im Bereich des HLA-DQ Locus genotypisiert. Ein signifikanter Kopplungsbefund (Zmax = 3,9 am HLA-DQ Locus) fand sich unter der Annahme eines autosomal dominanten Erbgangs mit 70% Penetranz, wenn Familienangehörige mit unprovozierten generalisierten Anfällen als Merkmalsträger einer IGE klassifiziert wurden. Unter Einbeziehung des GSW-EEG als subklinisches Erkrankungsmerkmal lag die maximale Kopplungsevidenz geringfügig höher (Zmax = 4,1), jedoch zeigte der Anstieg der Rekombinationfraktion an, daß nicht alle GSW-EEG Träger einer engen Kopplung mit dem HLA-Locus folgten und


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wahrscheinlich eine genetische Heterogenität für dieses häufige EEG-Merkmal (Prävalenz: 2,7%) vorliegt (Pedley, 1991). In der jüngsten Studie von Greenberg & Mitarb. (2000) wurde der Kopplungsbefund zwischen JME-assoziierten IGE und dem HLA-Locus bestätigt, wenn eine vorwiegend maternale Vererbung des Erkrankungsgens angenommen wurde. Die signifikanten Kopplungsbefunde beider Arbeitsgruppen bestätigen übereinstimmend einen IGE-Locus in der chromosomalen Region 6p21.3, der zu einem breiten IGE-Spektrum in Familien von JME-Patienten disponiert. Aufgrund unserer unabhängigen Bestätigung wurde diesem IGE-Locus das Locus-Symbol PrimeEJM1Prime zuerkannt. Zusätzlich konnten Greenberg & Mitarb. (1995) zeigen, daß Familien von Angehörigen mit Aufwach-Grand mal eine Kopplung zur HLA-Region aufwiesen, während Familien von Angehörigen mit Grand mal ohne tageszeitliche Bindung keinen Anhalt für eine Kopplung zur HLA-Region zeigten. Diese Befunde implizieren, daß der EJM1-Locus an der Epileptogenese eines breiten IGE-Spektrums von JME, Absence-Epilepsien und Epilepsien mit Aufwach-Grand mal beteiligt ist. Weitere Bestätigung erhielt der EJM1-Locus durch den Nachweis einer allelischen Assoziation von JME mit HLA-DR13 bzw. HLA-DRw6 in drei unabhängigen Studienkollektiven (Durner et al., 1992; Obeid et al., 1994; Greenberg et al., 1996). Da bisher kein Anhalt für eine HLA-vermittelte Pathogenese bei den IGE vorliegt, sprechen die Assoziationsbefunde für ein Erkrankungsgen, das in unmittelbarer Nähe des HLA-DR Locus lokalisiert ist.

Zur Eingrenzung des phänotypischen Spektrums des EJM1-Locus führten wir Kopplungsanalysen mit zwei RFLPs am HLA-DQ Locus in 44 Familien von Probanden mit JAE oder CAE durch (Sander et al., 1995). Die parametrischen Kopplungsanalysen ergaben keinen Hinweis auf eine Kopplung (Z < -2) für eine Region von 10 cM beiderseits des HLA-DQ Locus beim gesamten Familienkollektiv. Ein Kopplungshinweis fand sich allein in einer Untergruppe von 14 Familien, in denen auch ein Familienangehöriger an einer JME erkrankt war. Unter der Annahme eines autosomal dominanten Erbgangs mit 70% Penetranz lag die maximale Kopplungsevidenz (Zmax = 1,91) ca. 5 cM vom HLA-DQ Locus entfernt, wenn unprovozierte generalisierte Anfälle als Erkrankungsmerkmal klassifiziert wurden. Der EJM1-Locus ist demnach an der Pathogenese eines breiten Spektrums von IGE-Syndromen beteiligt, jedoch ist dazu ein genetischer Hintergrund erforderlich, der an die Manifestation einer JME gebunden ist. Das EJM1-assoziierte phänotypische Spektrum umfaßt IGE-Syndrome mit adoleszenten Erkrankungsbeginn, bei


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denen eine tageszeitliche Bindung der Anfälle während der Aufwach-Phase vorliegt. Bei Absence-Epilepsie Familien ohne JME-Angehörige spielte in unserer Studie der EJM1-Locus keine bedeutsame Rolle. Diese Befunde belegen eine genetische Heterogenität bei den idiopathischen Absence-Epilepsien. Diese Annahme wird durch den Nachweis von zwei weiteren Erkrankungsloci auf dem Chromosom 8 erhärtet. Bei Familien mit adoleszenten IGE-Syndromen (JAE, Epilepsie mit Grand mal), aber ohne JME-Familienmitglieder, fand sich eine signifikante Kopplung mit der chromosomalen Region 8p11 (Durner et al., 1999). In Familien mit persistierender CAE wurde eine Kopplung mit dem chromosomalen Segment 8q24 nachgewiesen (Fong et al., 1998).

Bei der genetischen Disposition der JME ist ebenfalls von einer genetischen Heterogenität auszugehen. Weitere signifikante Kopplungshinweise für JME-assoziierte Epilepsien fanden sich in den chromosomalen Regionen 6p11 (EJM2) (Serratosa et al., 1996; Liu et al., 1996) und auf dem Chromosomenabschnitt 15q14 (EJM3) im Bereich des Gens der alpha7 Untereinheit des neuronalen, nikotinergen Acetylcholinrezeptors (CHRNA7) (Elmslie et al., 1997). In den untersuchten Familien waren zuvor keine Kopplungshinweise mit dem EJM1-Locus gefunden worden (Whitehouse et al., 1993; Liu et al., 1996; Elmslie et al., 1996). Die Phänotyp-Genotyp Beziehung beider Studien unterscheidet sich jedoch von den Studien, die zur Kartierung des EJM1-Locus führten. In der Studie von Liu & Mitarb. (1996) wurden mittelamerikanische Familien von JME-Probanden untersucht, in denen keine Epilepsien mit pyknoleptischen Absencen (CAE) auftraten oder keine für die CAE typischen 3 Hz spike-wave EEG-Erregungsmuster vorlagen. Dieser phänotypische Unterschied veranlaßte die Autoren, diese JME-Sonderform als Primeklassisches JMEPrime zu bezeichnen. In der Studie von Elmslie & Mitarb. (1997) war nur der JME-Phänotyp mit der chromosomalen Region 15q14 gekoppelt. Zwei Studien konnten den Kopplungshinweis in der Region 15q14 bei unabhängigen Familienkollektiven nicht bestätigen (Sander et al., 1999; Durner et al., 2000). Obwohl es nicht auszuschließen ist, daß einige der publizierten Kopplungsevidenzen bei JME-assoziierten Epilepsien falsch-positive Kopplungsbefunde darstellen, ist der Kopplungshinweis in der Region 6p21.3, aufgrund seiner Bestätigung in drei unabhängigen Familienkollektiven, als der IGE-Locus mit der fundiertesten Kopplungsevidenz anzusehen. Für die Auswahl von funktionell plausiblen Kandidatengenen für den EJM1-Locus ist dessen chromosomale Feinkartierung eine wichtige Voraussetzung.


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2.1.1 Feinkartierung des IGE-Locus PrimeEJM1Prime

Zur molekulargenetischen Feinkartierung des EJM1-Locus in der chromosomalen Region 6p21.3 führten wir eine Kopplungsanalyse in 29 deutschen Familien von JME-Patienten durch (Sander et al., 1997). Insgesamt wurden 277 Familienangehörige in die Untersuchung eingeschlossen, von denen 209 Personen für 16 DNS-Polymorphismen im chromosomalen Segment 6p25 bis 6q13 genotypisiert wurden. In den Zweipunkt-Analysen fand sich eine signifikante Kopplung (Zmax = 3,08) am HLA-DQ Locus unter der Annahme eines autosomal dominanten Erbgangs mit 70% Penetranz. In dem Erkrankungsmodell wurden alle Familienangehörigen mit unprovozierten generalisierten Anfällen als PrimebetroffenPrime klassifiziert. Die Mehrpunktanalyse im Bereich der HLA-Region ergab einen signifikanten Kopplungshinweis (Zmax = 3,27) etwa 3 cM centromer vom HLA-DQ Locus entfernt (Abb. 2).


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Abb. 2: Kopplungsevidenz des EJM1-Locus in der chromosomalen Region 6p21.3.

Der Homogenitätstest zeigte keinen statistischen Anhalt für das Vorliegen einer genetischen Heterogenität. Unter der Annahme von genetischer Homogenität erfolgte eine Haplotypanalyse bei Familien mit zwei oder mehr erkrankten Angehörigen. Eindeutige Rekombinationen zwischen erkrankten Familienangehörigen fanden sich in fünf Familien. Der Vergleich der mit der Erkrankung ko-segregierenden Chromosomensegmente wies auf ein gemeinsames Fragment von 10 cM Länge, das centromerwärts durch den Marker D6S1019 und telomerwärts durch den HLA-DQ Locus flankiert wird (Abb. 3). Dabei ist zu berücksichtigen, daß die Eingrenzung dieser Kandidatengenregion für den EJM1-Locus auf der spekulativen Annahme einer genetischen Homogenität dieser fünf Familien basiert. Wegen dieser unbelegten Vermutung sollten auch Gene im angrenzenden Bereich der Kandidatenregion bei der Auswahl von Kandidatengenen einbezogen werden. Da Mutationen in Genen, die neuronale Ionenströme regulieren, als Ursache monogener idiopathischer Epilepsien und anderer monogener paroxysmaler Störungen identifiziert wurden (Cooper & Jan, 1999; McNamara, 1999; Ryan, 1999), wurden diese Gene bei der Kandidatengenauswahl in der EJM1-Region besonders berücksichtigt. Das positionell und funktionell aussichtsreichste Kandidatengen ist das Gen der GABA-BR1 Untereinheit des


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GABAB Rezeptors. Dieses erst kurz zuvor klonierte Gen (Kaupmann et al., 1997) wurde von uns für eine systematische Mutationsanalyse ausgewählt.

Abb. 3: Feinkartierung des EJM1-Locus in der chromosomalen Region 6p21.3.

Genetische Karte von 16 Mikrosatelliten-Polymorphismen in der chromosomalen Region 6p25-6q13. Der schwarze Balken zeigt chromosomale Segmente an, die mit dem EJM1-Locus ko-segregieren. Der weiße Balken weist auf die Region, in der Rekombinationsereignisse stattgefunden haben.

2.1.2 Mutationsanalyse des GABA-BR1 Gens

Das Gen der GABA-BR1 Untereinheit des heterodimeren GABAB Rezeptors befindet sich am telomerwärtigen Ende des von uns eingegrenzten Kandidatengenbereichs für den EJM1-Locus (Peters et al., 1998). Pharmakologische und tierexperimentelle


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Untersuchungen weisen darauf hin, daß der GABAB Rezeptor an der neurophysiologischen Entstehung von GSW-Entladungen beteiligt ist (Hosford, 1995; Bowery et al., 1999; Charpier et al., 1999). Der GABAB Rezeptor generiert über eine G-Protein vermittelte Aktivierung von Kaliumkanälen inhibitorische, postsynaptische Potentiale. Präsynaptisch beeinflussen GABAB Rezeptoren die Neurotransmitterausschüttung. Während der Initiierung von Absence-Anfällen induzieren GABAB Rezeptoren eine Deaktivierung von T-Typ Kalziumkanälen, durch die synchronisierte Erregungssalven in thalamischen Neuronen angestoßen werden, die ihrerseits zu einer synchronisierten Aktivierung von thalamo-cortico-thalamischen Erregungsschleifen führen (Hosford, 1995; Tsakiridou et al., 1995). Das GABA-BR1 Gen ist somit ein positionell und funktionell plausibles Kandidatengen für den EJM1-Locus.

Nach Aufklärung der genomischen Organisation des GABA-BR1 Gens führten wir mittels der PrimeSingle Strand Confirmation AnalysisPrime (SSCA) eine systematische Mutationssuche der kodierenden Sequenzabschnitte und der Exon-Intron Übergänge des GABA-BR1 Gens durch. Untersucht wurden 18 JME-Patienten aus Familien mit positiver Kopplungsevidenz zum HLA-DQ Locus (kumulativer Lod score: Z = 3.17). Dabei wurden 3 häufige Sequenzpolymorphismen in den Exon 1a1, 7 und 11 identifiziert. Die Sequenzpolymorphismen in Exon 1a1 (Ala20Val) und Exon 7 (Gly489Ser) bedingen einen Aminosäurenaustausch und könnten funktionelle Bedeutung haben. Unsere Assoziationsstudie bei 118 IGE-Patienten (72 JME, 46 CAE oder JAE) und 130 gesunden Kontrollen ergab keinen Hinweis auf eine allelische Assoziation für diese drei exonischen Polymorphismen (P > 0,05), weder in der Gesamtgruppe der 118 IGE-Patienten, noch in den zwei Untergruppen von 72 JME-Patienten und 46 Patienten mit CAE oder JAE. Ein Anhalt für einen häufigen und bedeutsamen Effekt des GABA-BR1 Gens bei der Epileptogenese der IGE besteht deshalb nicht. Da bisher die regulatorischen Sequenzen in der 5'-untranslatierten Region nicht untersucht wurden, ist eine pathogenetische Beteiligung des GABA-BR1 Gens noch nicht ausgeschlossen. Da in der Zwischenzeit die genomische Sequenzierung des Chromosomenabschnittes 6p21 weit fortgeschritten ist, ist mit der Identifizierung weiterer interessanter Kandidatengene in der von uns eingegrenzten Kandidatengenregion zu rechnen. Erst der Nachweis einer IGE-bedingenden Genmutation wird den Kopplungsbefund in der chromosomalen Region 6p21.3 bestätigen können.


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2.1.3 Fazit

Zusammengefaßt entsprechen die vorliegenden Kopplungsbefunde der Erwartung, daß mehrere Hauptgeneffekte an der genetisch komplexen Disposition von JME-assoziierten IGE beteiligt sind. Weitere Studien sind erforderlich, um die Validität dieser IGE-Loci zu überprüfen. Angesichts der genetischen Heterogenität der IGE sind multizentrische Studien erforderlich, um die einzelnen Hauptgeneffekte mit ausreichender statistischer Evidenz zu identifizieren. Erst die Einbeziehung von interaktiven Effekten der beteiligten Hauptgene wird es erlauben, präzisere Genotyp-Phänotyp Beziehungen abzugrenzen. Diese Differenzierungen sind möglich, wenn eine systematische Genomanalyse die gleichzeitige Erfassung von interaktiven genetischen Faktoren erlaubt. Darüber hinaus spielen Kriterien der Familienauswahl und auch die ethnische Herkunft der Familien eine relevante Rolle, welche IGE-Loci in dem ausgewählten Familienkollektiv einen Hauptgeneffekt entfalten (Sander et al., 1997; Greenberg et al., 2000). Bei den IGE mit komplexer genetischer Disposition konnte bisher nur der EJM1-Locus in der chromosomalen Region 6p21.3 unabhängig bestätigt werden (Greenberg et al., 1988, 1995, 2000; Durner et al., 1991; Sander et al., 1995, 1997). Der EJM1-Locus ist deshalb besonders aussichtsreich für Kandidatengenanalysen. Die Feinkartierung des EJM1-Locus in zwei voneinander unabhängigen Studien weist darauf hin, daß die zugrunde liegende Genstörung auf einem ca. 10 cM großen chromosomalen Segment lokalisiert ist, das telomerwärts vom HLA-DQ Locus und centromer vom Marker D6S1019 flankiert wird (Sander et al., 1997; Greenberg et al., 2000). Da die genomische Sequenz der chromosomalen Region 6p21.3 bald öffentlich vorliegen wird, können positionell und funktionell plausible Kandidatengene aus der von uns eingegrenzten Kandidatengenregion gezielt für Mutationsanalysen ausgewählt werden. Erst durch die Ermittlung von IGE-bedingenden Genmutationen läßt sich die Validität des EJM1-Locus eindeutig klären.

2.2 Molekulargenetische Analysen von Kandidatengenregionen

Bei der Überprüfung von Kopplungshinweisen werden drei Ziele verfolgt:

(1) den Kopplungsbefund unabhängig zu überprüfen;

(2) die Position des vermuteten Erkrankungsgens einzuengen;

(3) eine Phänotyp-Genotyp Beziehung abzuleiten.


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Im Falle der Bestätigung eines Kopplungshinweises dienen die Typisierungsdaten zusätzlich zur Auswahl von Familien mit positiver Kopplungsevidenz, bei denen Mutationsanalysen von Kandidatengenen die besten Erfolgsaussichten aufweisen. Bei der Auswahl von Kandidatengenen werden funktionelle und/oder positionelle Hinweise für eine pathogenetische Bedeutung eines Gens herangezogen. Da Mutationen in Genen, die neuronale Ionenströme regulieren, als Erkrankungsursache von monogen vererbten idiopathischen Epilepsien identifiziert wurden (Übersicht in: McNamara, 1999), bieten sich Gene dieses Funktionsspektrums für direkte Kandidatengenanalysen an. Die rasch voranschreitende Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen des PrimeHuman Genome ProjectPrime unterstützt diesen molekulargenetischen Forschungsansatz. Noch in diesem Jahr wird die nahezu vollständige Sequenz des menschlichen Genoms bekannt sein. Über die Suche nach Sequenzhomologien zu bereits identifizierten Epilepsie-Genen lassen sich weitere aussichtsreiche Kandidatengene ermitteln. Die Kenntnis der genomischen Genorganisation erleichtert die Mutationsanalyse von Kandidatengenen. Besonders bei der molekulargenetischen Analyse von Erkrankungen mit genetisch komplexer Disposition wird die Mutationsanalyse bei positionell und funktionell begründeten Kandidatengenen die aussichtsreichste Strategie darstellen, da die positionelle Eingrenzung der verantwortlichen Genveränderungen durch die beträchtliche phänotypische und genetische Varianz nur unpräzise gelingt (Roberts et al., 1999). Durch die systematische Suche nach Sequenzvariationen bei einer Vielzahl von Genen stehen bereits zahlreiche intragene Sequenzpolymorphismen für Assoziationsstudien zur Verfügung (Nöthen et al., 1993; Propping & Nöthen, 1995). Besonders geeignet sind Sequenzvarianten von Genen, die zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz an einer funktionell wichtigen Position eines Proteins führen oder durch die Variation von regulatorischen Sequenzabschnitten eine veränderte Genexpression bedingen. Im Falle einer Assoziation mit dem funktionellen Sequenzpolymorphismus ist ein direkter pathogenetischer Einfluß anzunehmen.

2.2.1 Kandidatengenregion 20q13

In der chromosomalen Region 20q13 wurden Genorte von zwei dominant vererbten idiopathischen Epilepsie-Syndromen lokalisiert. Bei zwei Familien mit autosomal dominanter nächtlicher Frontallappen-Epilepsie (ADNFLE) fanden sich Mutationen im


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Gen der alpha4-Untereinheit des neuronalen Acetylcholin-Rezeptors (CHRNA4, 20q13) (Steinlein et al., 1995a; Steinlein et al., 1997a). Bei ca. 80% der Familien mit familiären Neugeborenenkrämpfen liegt der Erkrankungslocus in der Region 20q13 (Leppert et al., 1989; Ryan et al., 1991; Ronen et al., 1993; Berkovic et al., 1994). Bisher konnten Mutationen im Gen eines spannungsabhängigen Kaliumkanals (KCNQ2) als Erkrankungsursache identifiziert werden (Biervert et al., 1998; Charlier et al., 1998). Darüber hinaus wurde für das humane Niederspannungs-EEG eine Kopplung zu der Region 20q13 publiziert (Steinlein et al., 1991), ohne daß eine zugrunde liegende Genstörung bisher identifiziert werden konnte. Zusammengenommen zeigen diese Befunde, daß Gene in der chromosomalen Region 20q13 an der Regulation der zerebralen Erregbarkeit beteiligt sind.

Unsere Kopplungsstudie bei 60 Familien von CAE-, JAE- und JME-Patienten testete die Hypothese, ob ein IGE-Locus in der Kandidatengenregion 20q13 zur genetischen Disposition der häufigen IGE-Syndrome beiträgt (Sander et al., 1996). Die Kopplungsanalyse mit den RFLP-Markern D20S19 und D20S20 ergab keinen Kopplungshinweis der IGE-Erkrankung mit der Kandidatengenregion 20q13. Evidenz gegen eine Kopplung (Z < -2) fand sich beim gesamten Kollektiv von 60 Familien wie auch bei drei Untergruppen von Familien, die durch ein Familienmitglied mit entweder CAE, JAE oder JME ausgewählt wurden. Die Kopplungsergebnisse widersprechen der Annahme, daß ein Hauptgen in der Region 20q13 auch an der Epileptogenese der häufigen IGE-Syndrome beteiligt ist.

Um eine pathogenetische Beteiligung der beiden Kandidatengene CHRNA4 und KCNQ2 abzuklären, wurde bei beiden Genen eine systematische Mutationsanalyse der kodierenden Sequenzabschnitte und der Intron-Exon Übergänge bei IGE-Patienten durchgeführt (Steinlein et al., 1997b, 1999). Die molekulargenetischen Mutationsanalysen des CHRNA4 und KCNQ2 Gens erfolgten durch die Arbeitsgruppe von Frau PD Dr. O. Steinlein am Institut für Humangenetik der Universität Bonn. Beim CHRNA4 Gen identifizierten wir bei 103 IGE-Patienten insgesamt 10 Sequenzvarianten, von denen keine zu einem Aminosäureaustausch oder zu einer offensichtlichen Alteration beim RNS-Spleißen führte (Steinlein et al., 1997b). Für den Nachweis von vier häufigen Varianten und für die Ser248Phe Mutation der australischen ADNFLE-Familie wurde eine Testmethode etabliert,


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die die Sequenzvariation durch ein verändertes Schnittmuster eines sequenzspezifischen Restriktionsenzyms identifiziert. Die in der australischen Großfamilie mit autosomal dominanter nächtlicher Frontallappen-Epilepsie nachgewiesene Ser248Phe Mutation konnte in unserer Studie weder bei den IGE-Patienten noch bei den Kontrollpersonen nachgewiesen werden. Bei drei der vier überprüften Sequenzpolymorphismen (bp1545/CfoI, bp145-55/HaeIII, bp1674 + 14/StyI) fanden sich keine signifikanten Unterschiede in den Allelfrequenzen zwischen 103 deutschen IGE-Patienten und 92 deutschen Kontrollpersonen (P > 0.05). Allein für den in Exon 5 gelegenen bp594/CfoI Polymorphismus lag eine signifikant erhöhte Frequenz des T-Allels bei den IGE-Patienten (8,5%) vor im Vergleich zu den Kontrollen (2,7%; chi2 = 5.28, df = 1, P = 0.0216; OR = 3.57, 95%-CI: 1.31 - 9.72). Da keine Korrektur für multiple Testungen durchgeführt wurde, betrachten wir diesen Hinweis auf eine allelische Assoziation als Hypothesen-generierenden Befund, den es in weiteren Studien zu überprüfen gilt.

Bei der systematischen Mutationsanalyse des KCNQ2 Gens bei 115 deutschen IGE-Patienten (71 JME, 44 JAE oder CAE) fanden sich mehrere bereits bekannte Sequenzpolymorphismen (C912T, C1419G, C1635T, T2154A), die zu keiner Änderung der Aminosäuresequenz führen sowie der bekannte Aminosäure-Substitutionspolymorphismus Thr752Asn. Zusätzlich wurde bei einem Patienten eine seltene PrimestummePrime Sequenzvariante (G1947) in Exon 16 detektiert sowie bei jeweils einem IGE-Patienten eine bisher unbekannte Sequenzvariante in Exon 13, die zu dem Austausch der Aminosäuren Glutamin gegen Lysin an Position 502 der Aminosäurenkette (Glu502Lys) führt, und eine Sequenzvariante in Exon 16, die den Aminosäureaustausch Ala733Ser bedingt. Beide Aminosäure-Substitutionen sind in der großen intrazellulären C-terminalen Domäne des Kaliumkanals lokalisiert. Beide Aminosäuresubstitutionen fanden sich bei einigen klinisch unbetroffenen Familienangehörigen, aber nicht bei weiteren Familienmitgliedern mit epileptischen Anfällen. Diese Konstellation spricht gegen eine pathogenetische Bedeutung beider Aminosäuresubstitutionen. Unsere Assoziationsanalyse mit dem häufigen Thr752Asn Polymorphismus ergab keinen Hinweis auf eine allelische Assoziation bei den IGE-Patienten, sowie zwei Untergruppen von 71 JME-Patienten und von 44 Patienten mit idiopathischen Absence-Epilepsien (P > 0,05). KCNQ2 Genvarianten scheinen demnach keine relevante pathogenetische Rolle bei der Epileptogenese der häufigen IGE-Syndrome zu spielen. Zusammengefaßt fanden wir keine statistisch


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hinreichenden Anhaltspunkte dafür, daß ein Hauptgeneffekt in der chromosomalen Region 20q13 zur genetischen Disposition der häufigen IGE-Syndrome beiträgt.

2.2.2 Kandidatengenregion 8q24

In der Kandidatengenregion 8q24 akkumulieren Kopplungshinweise für drei IGE-Subtypen. Bei ca. 20% der Familien mit autosomal-dominant vererbten, benignen familiären Neugeborenenkrämpfen findet sich eine Kopplung in dieser Region (Ryan et al., 1991; Lewis et al., 1993; Steinlein et al., 1995b). In der Zwischenzeit konnten Mutationen im Gen eines spannungsabhängigen Kaliumkanals (KCNQ3) als Erkrankungsursache identifiziert werden (Singh et al., 1998). Zara & Mitarb. (1995) berichteten über eine signifikante Kopplung von häufigen IGE-Syndromen und Fieberkrämpfen mit der Region 8q24 bei 10 italienischen Familien. Fong & Mitarb. (1998) publizierten eine Kopplung zwischen der persistierenden CAE und Markern der Region 8q24 in 10 mittelamerikanischen Familien. Zusammengenommen stützen diese Befunde die Annahme, daß ein Epilepsie-Gen in der chromosomalen Region 8q24 zu der genetischen Disposition eines breiten IGE-Spektrums beiträgt. Unsere Kopplungsstudie bei 38 Familien mit mehreren IGE-Erkrankten überprüfte den von Zara & Mitarb. (1995) publizierten Kopplungshinweis (Sander et al., 1998a). Kritisch ist anzumerken, daß das von Zara & Mitarb. (1995) angewandte statistische Verfahren für die Kopplungsanalyse eine relativ hohe Typ-I Fehlerrate aufweist (Davis & Weeks, 1997). Unsere parametrischen Mehrpunktanalysen mit dem Programm GENEHUNTER ergaben durchgehend signifikant negative Kopplungsevidenzen (Z < -2) im chromosomalen Bereich 8q24. Ebenfalls negative Kopplungsevidenzen fanden sich in zwei klinisch homogeneren Teilgruppen der Familien, die in 18 Familien mit JME-Angehörigen und 20 Familien ohne JME-Mitglied aufgeteilt wurden. Wir konnten somit einen Kopplungshinweis für die häufigen IGE-Syndrome in der Kandidatenregion 8q24 nicht bestätigen.


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2.2.3 Kandidatengenregion 15q14

Der Nachweis von Mutationen im CHRNA4 Gen als Erkrankungsursache für autosomal-dominant vererbte Frontallappen-Anfälle (Steinlein et al., 1995a, 1997a) begründete die Kandidatengenhypothese, daß Gene von Untereinheiten des neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors an der Epileptogenese beteilgt sind. Die Kandidatengenregion 15q14 fand besondere Beachtung, da hier das Gen der alpha7-Untereinheit des neuronalen nikotinergen Acetylcholin-Rezeptors (CHRNA7) lokalisiert ist. Die alpha7-Untereinheit des neuronalen nikotinergen Acetycholin-Rezeptors ist durch eine hohe Kalzium-Permeabilität gekennzeichnet, über die zahlreiche Mechanismen der neuronalen Plastizität reguliert werden (Broide & Leslie, 1999). Zwei Studien bei häufigen idiopathischen Epilepsien fanden Kopplungshinweise im chromosomalen Bereich des CHRNA7 Gens. Elmslie & Mitarb. (1997) lokalisierten einen Hauptgeneffekt für die JME in der CHRNA7 Region bei 34 Familien mit mehreren JME-Erkrankten. Neubauer & Mitarb. (1998) berichteten ebenfalls über einen signifikanten Kopplungshinweis mit dieser Region bei Familien mit Rolando-Epilepsie. In dieser Studie war das typische EEG-Merkmal der Rolando-Epilepsie, die centrotemporalen Spitzen, mit der CHRNA7 Region gekoppelt. Beide Kopplungsbefunde erhärten die Hypothese, daß Genstörungen in der chromosomalen Region 15q14 an der genetischen Disposition von idiopathischen Epilepsien beteiligt sind.

Unsere Kopplungsstudie bei 27 Familien von JME-Patienten konnte den Kopplungsbefund von Elmslie & Mitarb. (1997) nicht bestätigen (Sander et al., 1999). In 11 Familien mit mehreren JME-Erkrankten fanden wir weder in der parametrischen, noch in der parameter-freien Analyse positive Kopplungshinweise. Unter Verwendung der gleichen Vererbungsparameter war die parametrische Kopplungsevidenz im Bereich des CHRNA7 Gens eindeutig negativ, ohne jedoch das Niveau für einen statistischen Kopplungsausschluß (Z < -2) zu erreichen. Eine Evidenz gegen eine Kopplung fand sich bei einem erweiterten Kollektiv von 27 JME-Familien und 30 Familien von Patienten mit idiopathischen Absence-Epilepsien, wenn Familienangehörige mit unprovozierten generalisierten Anfällen oder dem subklinischen GSW-EEG als Merkmalsträger klassifiziert wurden. Eine Assoziationsanalyse mit einem Mikrosatelliten-Polymorphismus in unmittelbarer Nähe des CHRNA7 Gens ergab ebenfalls keinen Anhalt für eine allelische Assoziation mit der JME oder den idiopathischen Absence-Epilepsien. Eine zweite davon


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unabhängige Kopplungsstudie von Durner & Mitarb. (2000) fand ebenfalls keinen Kopplungshinweis in der chromosomal Region 15q24 in Familien von JME-Patienten. Die direkte Mutationsanalyse des CHRNA7 Gens ist bisher nicht gelungen, da ein unmittelbar danebenliegendes, nahezu sequenzidentisches, Pseudogen die selektive Sequenzanalyse erschwert (Bate et al., 2000).

2.2.4 Kandidatengene CACNA1A und CACNB4

Tiermodelle mit genetisch determinierten Epilepsien bieten ideale Voraussetzungen für die positionelle Klonierung von Epilepsie-Genen und für die anschließende Aufklärung der pathogenetischen Mechanismen (Puranam & McNamara, 1999). Durch den kurzen Generationszyklus und gezielte Kreuzungen können die zugrunde liegenden Gendefekte bei Mausmodellen mit Absence-Epilepsien rasch und präzise lokalisiert werden. Bei drei Mausmutanten mit autosomal-rezessiv vererbten Absence-Epilepsien wurden Gendefekte in drei Untereinheiten neuronaler Kalziumkanäle (tottering Mutante: Cch1a, lethargic Mutante: Cchb4 und stargazer Mutante: Cacng2) als Erkrankungsursache identifiziert (Übersicht in: Burgess & Noebels, 1999). Diese Befunde und die Rolle von T-Typ Kalziumströmen bei der Generierung von elektrophysiologischen GSW-Entladungen (Tsakiridou et al., 1995) begründen die besondere Bedeutung von Kalziumkanal-Genen als Kandidatengene der IGE beim Menschen. In zwei molekulargenetischen Kandidatengenstudien überprüften wir eine ätiologische Beteiligung der humanen Gene der alpha1A- (CACNA1A) und beta4-Kalziumkanal-Untereinheit (CACNB4) an der Pathogenese der häufigen IGE-Syndrome (Sander et al., 1998b; Escayg et al., 2000).

Das menschliche Kalziumkanal-Gen CACNA1A (Chromosom 19p13) ist homolog mit dem Cch1a Gen der Maus, welches bei der autosomal-rezessiv vererbten Absence-Epilepsie der tottering Mausmutante defekt ist (Fletcher et al., 1996). Mutationen in unterschiedlichen Lokalisationen des humanen CACNA1A Gens fanden sich bei Familien mit familiärer hemiplegischer Migräne, mit episodischer Ataxie (Typ 2) und mit chronischer spinocerebellärer Ataxie (Typ 6) (Übersicht in: Terwindt et al., 1998). Mutationen des humanen CACNA1A Gens sind demnach an der Pathogenese von paroxysmalen Störungen beteiligt. Diese Befunde stützen unsere Kandidatengen-Hypothese, daß das CACNA1A Gen


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zur Disposition von IGE-Syndromen beiträgt. Diese Hypothese überprüften wir durch Kopplungs- und Assoziationsanalysen mit einem exonischen Trinukleotid-Polymorphismus des CACNA1A Gens bei insgesamt 70 Familien von CAE-, JAE- und JME-Patienten. Moderate Expansionen (> 20 CAG-Wiederholungen) dieses exprimierten Trinukleotid-Polymorphismus in der 3'-Region des CACNA1A Gens wurden als Erkrankungsursache der chronischen spinocerebellären Ataxie vom Typ-6 identifiziert (Zhuchenko et al., 1997). Unsere Assoziationsanalyse in Familien-Trios ergab keinen Hinweis auf eine allelische Assoziation des Trinukleotid-Polymorphismus mit der CAE, JAE oder JME. Wir fanden ebenfalls keinen Zusammenhang zwischen der Anzahl von CAG-Wiederholungen und der Disposition zu IGE-Subtypen. Im Besonderen lag bei keinem der genotypisierten IGE-Patienten eine Expansion des CAG-Polymorphismus vor. Als höchste Anzahl von CAG-Wiederholungen fanden wir bei zwei IGE-Patienten ein Allel mit 14 CAG-Einheiten. Diese lagen somit deutlich unter der kritischen Schwelle (< 20 CAG-Wiederholungen). Unsere parameter-freie Kopplungsanalyse mit dem GENEHUNTER Programm ergab keinen signifikanten Kopplungshinweis bei 55 IGE-Familien sowie bei zwei klinisch homogeneren Teilkollektiven von 26 JME-Familien und 42 Absence-Epilepsie Familien. Zusammengefaßt fanden wir keinen Hinweis für einen bedeutsamen Hauptgeneffekt des CACNA1A Gens bei der Pathogenese der häufigen IGE-Syndrome.

In Zusammenarbeit mit der molekulargenetischen Arbeitsgruppe von Frau Prof. Dr. M. Meisler an der Universität von Michigan und dem Neurophysiologen, Dr. M. Waard, an der Universität von Marseille beteiligten wir uns an einer Mutationsanalyse des CACNB4 Gens bei Patienten mit IGE und episodischen Ataxien (Escayg et al., 2000). Ein Gendefekt im homologen Cchb4 Gen bei der Mausmutante PrimelethargicPrime führt zu einem Erkrankungsbild, das durch eine Absence-Epilepsie und eine chronisch progrediente Ataxie charakterisiert ist (Burgess et al., 1997). Unsere Kandidatengenanalyse überprüfte, ob Varianten des CACNB4 Gens durch eine Störung der Kanalfunktion zur Pathogenese von IGE beitragen. Die Mutationsstudie des CACNB4 Gens analysierte die kodierenden Sequenzabschnitte und die Intron-Exon Übergänge. Insgesamt wurden 10 Sequenzvarianten identifiziert. Acht davon führten nicht zu einem Aminosäureaustausch oder einer offensichtlichen Alteration des RNS-Spleißens. Bei zwei IGE-Patienten fanden sich Sequenzvarianten, aus denen eine Veränderung des CACNB4 Proteins resultierte. Bei


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einer JME-Patientin lag in Exon 13 ein Nukleotidaustausch (CrarrT) vor, der zu einem vorzeitigen Stopcodon (R482X) führte. Dadurch wird die Aminosäurekette um 38 Aminosäuren in der C-terminalen Region verkürzt. Zur neurophysiologischen Funktionsprüfung wurde die cDNA der R482X-Mutation zusammen mit der cDNA der alpha1A-Untereinheit in Xenopus laevis Eizellen exprimiert. Im Vergleich zu dem CACNB4 Wildtyp zeigte die elektrophysiologische Ableitung eine veränderte Inaktivierung der co-transfizierten cDNA der alpha1A-Untereinheit. Die R482X Variante könnte somit eine funktionelle Bedeutung haben und zur Epileptogenese beitragen. Bei 255 Kontrollpersonen fand sich die R482X Variante nicht. Interessanterweise ist die Tochter der JME-Patientin ebenfalls an einer Epilepsie erkrankt. Da die Mutter einer molekulargenetischen Untersuchung der Tochter nicht zustimmte, waren wir nicht in der Lage, die pathogenetische Relevanz dieser Sequenzvariante genauer abzuklären.

Eine weitere GrarrT Nukleotidsubstitution wurde in Exon 3 bei jeweils einem Patienten mit Absence-Epilepsie und einem Patienten mit episodischer Ataxie detektiert. Diese Sequenzvariante führt zu einem Aminosäureaustausch (C104F). Die elektrophysiologische Überprüfung der C104F Variante ergab keinen Hinweis für eine funktionelle Alteration des varianten Kalziumkanals. Der Epilepsie-Proband mit der C104F Variante ist Vater von zwei Kindern, von denen ein Kind ebenfalls eine Epilepsie mit generalisiert tonisch-klonischen Anfällen aufweist. Bei diesem Kind fand sich ebenfalls die C104F Variante, während die klinisch unauffällige Mutter und das nicht erkrankte Kind die C104F Variante nicht aufwiesen. Gleichfalls war die C104F Variante bei allen fünf erkrankten Familienangehörigen sowie zwei nicht erkrankten Familienmitgliedern einer unverwandten Familie mit episodischen Ataxie nachweisbar. Die C104F Variante fand sich nicht bei den 255 Kontrollpersonen. Die Segregation der C104F Variante in beiden Familien spricht für einen Hauptgeneffekt dieser Variante, obwohl sich ein Zufallsbefund aufgrund der nur geringen Familiengröße nicht ausschließen läßt. Zusammengefaßt ergeben sich Anhaltspunkte, daß Varianten des CACNB4 Gens bei der Pathogenese von paroxysmalen Störungen beteiligt sind. Diese Annahme bedarf jedoch weiterer Bestätigung. Dazu ist vorgesehen, beide identifizierte Varianten des CACNB4 Gens in transgenen Tieren auf funktionelle Störungen zu überprüfen.


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2.2.5 Fazit

Die Vielzahl unbestätigter Kopplungshinweise bei den genetisch komplexen Erkrankungen hat dazu beigetragen, daß die zum Teil widersprüchlichen Kopplungsbefunde mit sehr viel Skepsis betrachtet werden. Diese Einstellung ist nur zum Teil berechtigt. Einerseits verleitet die phänotypische und genetische Varianz der genetisch komplexen Erkrankungen zu einer Maximierung von positiven Kopplungsevidenzen durch eine post-hoc Anpassung der Vererbungsparameter und der Erkrankungsmodelle. Darüber hinaus werden explorativ multiple Testungen vorgenommen, ohne daß eine adäquate Anpassung des Signifikanzniveaus vorgenommen wird. Dieses Vorgehen erhöht die Rate von falsch-positiven Kopplungsberichten. Andererseits entspricht es der Erwartung, daß in unabhängigen Studien, infolge der heterogenen und komplexen genetischen Disposition, nicht stets derselbe genetische Faktor herausgefiltert wird. Dies ist im Besonderen der Fall, wenn die Familienkollektive klein sind und sich das Studiendesign bei der Familienauswahl und dem Erkrankungsmodell unterscheidet. Simulationsstudien, die die Komplexität der beteiligten genetischen Faktoren berücksichtigen, belegen, daß wesentlich größere Familienkollektive, als bisher untersucht, für eine statistisch hinreichende Erfassung von heterogenen Hauptgeneffekten bei genetisch komplexen Erkrankungen erforderlich sind (Goldin et al., 1991; Badner et al., 1998). Solche Forschungsprojekte sind nur im Rahmen multizentrischer Kollaborationen realisierbar. Darüber hinaus ermöglicht erst eine systematische Genomanalyse, heterogene Hauptgene zu differenzieren und interaktive Geneffekte zu erfassen.


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2.3 Systematische Genomanalyse bei idiopathisch generalisierten Epilepsien

2.3.1 Studiendesign

Ziel unserer systematischen Genomanalyse bei Familien mit mehreren IGE-Erkrankten ist die positionelle Klonierung von Genstörungen, die an der Disposition eines breiten IGE-Spektrums beteiligt sind. Dabei gehen wir von den Hypothesen aus, daß dem neurogenetischen Spektrum von CAE, JAE und JME eine gemeinsame genetische Disposition zugrunde liegt und daß Hauptgeneffekte bei Familien mit erkrankten Geschwistern zur komplexen genetischen Ätiologie beitragen. Aufgrund der komplexen und heterogenen genetischen Disposition der häufigen IGE sind große Familienkollektive für die Kopplungsstudien erforderlich. Durch die Gründung des PrimeEuropean Consortium on the Genetics of Idiopathic Generalised EpilepsyPrime ist es uns gelungen, eine Zusammenarbeit der fünf bedeutendsten europäischen Arbeitsgruppen zu realisieren. In einer konzertierten Aktion konnten 130 Familien von Probanden mit CAE, JAE oder JME in die Kopplungsstudien eingeschlossen werden. Um die Wahrscheinlichkeit für die Beteiligung eines Hauptgeneffekts zu erhöhen, mußten zwei oder mehr Geschwister entweder unprovozierte generalisierte Anfälle oder generalisierte spike-wave Entladungen im EEG aufweisen. Die Rekrutierung von Kernfamilien mit erkrankten Geschwisterpaaren bietet die effizientesten Voraussetzungen für die Kartierung häufiger Hauptgene bei genetisch komplexen Erkrankungen (Goldin et al., 1991; Badner et al., 1998). Die klinischen Daten wurden anhand standardisierter Dokumentationsbögen systematisch erfaßt und erlauben eine detaillierte Differenzierung von IGE-Merkmalen. Die Klassifikation von epileptischen Anfällen und Epilepsie-Syndromen erfolgte gemäß den Richtlinien der Internationalen Liga gegen Epilepsie (1989). Die Stammbäume mit detaillierten klinischen Daten sind im Internet abrufbar (http://www.charite.de/epileptologie/Forschungsgruppen/genetik/ downlinks.html). Von 694 Familienangehörigen wiesen 360 einen IGE-Phänotyp auf. Bei 617 Familienangehörigen wurden für die systematische Genomanalyse insgesamt 383 Mikrosatelliten-Polymorphismen mit einem durchschnittlichen Abstand von 10 cM genotypisiert. Die Zusammenstellung der Mikrosatelliten-Polymorphismen findet sich unter: http://www.msz.mdc-berlin.de/marker.html (Dib et al., 1996). Weitere 33 Mikrosatelliten wurden in Chromosomenabschnitten mit Kopplungshinweis zur Feinkartierung und Informativitätssteigerung ergänzt. Insgesamt wurden 250.000


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Genotypisierungen am Mikrosatelliten Zentrum des Max-Delbrück-Centrums in Berlin durchgeführt und nach sorgfältiger Qualitäts- und Plausibilitätsprüfung für die statistischen Analysen bereitgestellt. Die Kopplungsanalysen erfolgten unter zwei Erkrankungsmodellen. Unter dem Primeengen ErkrankungsmodellPrime wurden 276 Familienangehörigen mit CAE, JAE oder JME als IGE-Merkmalsträger klassifiziert. Unter dem Primeweiten ErkrankungsmodellPrime wurden 360 Familienangehörige als IGE-Merkmalsträger gekennzeichnet, wenn sie entweder mindestens einen unprovozierten generalisierten Anfall erlitten hatten, oder subklinisch ein GSW-EEG aufwiesen. Da infolge der komplexen genetischen Disposition von einer interfamiliären Varianz der Vererbungsparameter auszugehen ist, wurden für die statistischen Kopplungsstudien das parameter-freie Analyseverfahren GENEHUNTER angewandt (Kruglyak et al., 1996). Dieses parameter-freie Analyseverfahren ermittelt die Übereinstimmung von elterlichen Chromosomenabschnitten bei den erkrankten Angehörigen einer Familie und vergleicht diese mit den Erwartungswerten bei einer erkrankungsunabhängigen Mendelschen Verteilung. Die spekulative Festlegung eines Erbgangs ist dazu nicht erforderlich und die Analyse berücksichtigt nur die genetische Information von erkrankten Familienangehörigen (Primeaffecteds-onlyPrime Analyse). Ein Schwellenwert für die Typ-I Fehlerrate von P < 2.2 x 10-5 wird entsprechend anerkannter Richtwerte als signifikante Kopplungsevidenz akzeptiert, und eine Typ-I Fehlerrate von P < 7.4 x 10-4 als Kopplungshinweis betrachtet (Lander & Kruglyak, 1995).

2.3.2 Ergebnisse und Schlußfolgerungen

Die genomweiten Kopplungsevidenzen der parameter-freien Mehrpunktanalysen sind für beide Erkrankungsmodelle in Abbildung 4 dargestellt. Zur explorativen Analyse wurden zusätzlich parametrische Mehrpunktberechnungen durchgeführt, um den Vererbungsmodus der ermittelten IGE-Loci und den Grad der genetischen Heterogenität zu charakterisieren. Unsere genomweiten parameter-freien Kopplungsanalysen ergaben einen signifikanten Kopplungsbefund in der chromosomalen Region 3q26 (P = 1,7 x 10-5 bei D3S3725; Primeweites ErkrankungsmodellPrime), sowie zwei Kopplungshinweise in den chromosomalen Regionen 2q36.1 (P = 5,4 x 10-4 bei D2S1371; Primeenges ErkrankungsmodellPrime) und 14q23 (P = 5,6 x 10-4 bei D14S63; Primeweites ErkrankungsmodellPrime) (Abb. 5). Die explorativen


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parametrischen Mehrpunktanalysen bestätigten die parameter-freien Kopplungsbefunde und weisen auf das Vorliegen von autosomal dominanten Hauptgeneffekten bei jeweils einem Drittel der untersuchten Familien hin. Die parameter-freien Kopplungsanalysen in zwei klinisch homogeneren Untergruppen der Familien (54 Familien mit und 76 Familien ohne JME-Angehörige) ergaben bei beiden Teilkollektiven positive Kopplungsevidenzen in den chromosomalen Regionen 3q26, 2q36.1 und 14q23 (Abb. 5). Dieser Befund belegt, daß die drei identifizierten IGE-Loci zur genetischen Disposition eines breiten IGE-Spektrums beitragen.

Da Mutationen in Genen von Ionenkanälen zur Pathogenese von monogenen, idiopathischen Epilepsien und anderen monogenen Erkrankungen mit paroxysmalen Symptomen beitragen, überprüften wir die ermittelten Chromosomenabschnitte auf Gene, die an der Regulation von neuronalen Ionenströmen beteiligt sind. Folgende Kandidatengene halten wir für aussichtsreich:

1) Region 3q26:

Gen der beta-Untereinheit des Kalium-Kanals PrimeKCNA1BPrime,

 

Gen des Chlorid-Kanals PrimeCLCN2Prime;

2) Region 2q36:

Gen des Chlorid-Bikarbonat Ionenaustauschers PrimeSLC4A3Prime;

3) Region 14q23:

Gen des Natrium-Kalzium Ionenaustauschers PrimeSLC8A3Prime.

Derzeit führen wir Mutationsanalysen bei den genannten Kandidatengenen durch, um disponierende Genmutationen bei IGE-Patienten aus Familien mit positivem Kopplungshinweis zu identifizieren.


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Abb. 4: Genomweite Typ-I Fehlerraten (P-Werte) der parameter-freien GENEHUNTER Berechnungen.

A: Primeenges ErkrankungsmodellPrime: CAE, JAE, JME;

B: Primeweites ErkrankungsmodellPrime: unprovozierte generalisierte Anfälle oder GSW-EEG.


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Abb. 5: Typ-I Fehlerraten (P) in den chromosomalen Regionen 3q26,
14q23 und 2q26.1 bei IGE-, IAE-, und JME-Familien.

Abb. 5a: Typ-I Fehlerraten (P) für das Primeweite ErkrankungsmodellPrime in der Region 3q26.

Abb. 5b: Typ-I Fehlerraten (P) für das Primeweite ErkrankungsmodellPrime in der Region 14q23.

Abb. 5c: Typ-I Fehlerraten (P) für das Primeenge ErkrankungsmodellPrime in der Region 2q36.

Primeenges ErkrankungsmodellPrime: CAE, JAE oder JME;

Primeweites ErkrankungsmodellPrime: unprovozierte generalisierte Anfälle oder GSW-EEG.


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2.3.3 Fazit

Bei der vorliegenden Kopplungsstudie handelt es sich um die erste systematische Genomanalyse zur Aufklärung der komplexen genetischen Disposition der häufigen IGE-Syndrome. Für die Kopplungsanalysen stand das bisher umfangreichste Kollektiv von IGE-Multiplex Familien zur Verfügung. Die komplexe genetische Disposition und die genetische Heterogenität der häufigen IGE-Syndrome stellen die größten analytischen Probleme für die Kopplungsstudien dar. Aufgrund der kleinen Familiengröße ist es vorab nicht erkennbar, ob ein Hauptgeneffekt an der Erkrankungsentstehung beteiligt ist oder ob eine polygene Disposition vorliegt. Durch die systematische Genomanalyse mit Mikrosatelliten-Markern in einem durchschnittlichen Abstand von ca. 10 cM besteht das Potential dieser genomweiten Kopplungsanalyse darin, daß wir definierte Phänotyp-Genotyp Hypothesen an jedem beliebigen Ort des menschlichen Genoms mit hinreichender Informativität überprüfen können. In der vorliegenden Studie konnten wir drei chromosomale Regionen (3q26, 2q36.1, 14q23) ermitteln, in denen mit hinreichender statistischer Wahrscheinlichkeit IGE-Gene mit einem breiten Dispositionsspektrum lokalisiert sind. Kandidatengene aus diesen chromosomalen Regionen werden derzeit Mutationsanalysen unterzogen. Durch die sukzessive Erweiterung des Familienkollektivs und durch die kombinierte Analyse mit Daten von anderen Forschergruppen verfolgen wir das Ziel, eine für alle Forschergruppen zugängliche Datenbank aufzubauen, die das Potential besitzt, die häufigen Hauptgeneffekte der IGE-Syndrome zu ermitteln und ihr komplexes und heterogenes Zusammenspiel zu erfassen. Rasche Fortschritte bei der Aufklärung von genetisch komplexen Erkrankungen sind von der bald abgeschlossenen Sequenzierung des menschlichen Genoms zu erwarten. Noch in diesem Jahr soll ein erster Entwurf der nahezu kompletten Sequenz des menschlichen Genoms vorgelegt werden. Die umfassende Kenntnis der menschlichen Gene, ihrer Lokalisation und genomischen Organisation wird es ermöglichen, Gene in der von uns ermittelten Kandidatengenregionen auszuwählen und direkt in Mutationsanalysen zu überprüfen. Bis zu diesem Zeitpunkt werden wir die wichtigsten Kandidatengenregionen für IGE-Gene ermittelt haben.


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2.3.4 Ausblick

Aktuell stehen wir am Anfang des Vorhabens, die molekularen Mechanismen der Epileptogenese durch die molekulargenetische Identifizierung von IGE-Genen aufzuklären. Der Nachweis von Mutationen in Genen von Ionenkanälen bei einigen monogenen idiopathischen Epilepsien und einigen monogenen paroxysmalen Störungen eröffnet erste konkrete Einblicke in die molekulare Pathogenese von paroxysmalen Störungen (Übersicht in: Cooper & Jan, 1999). Diese wegweisenden Schlüsselbefunde erlauben es, kritische Störungen der Erregungsbildung oder -ausbreitung im Gehirn zu erforschen und rational begründete Therapieansätze gezielt zu entwickeln (Cooper & Jan, 1999; Davies & Hanna, 1999). Vorerst bleibt unklar, inwieweit die Erkenntnisse bei diesen seltenen monogenen Funktionsstörungen auch Rückschlüsse auf die pathogenetischen Mechanismen bei den weit häufigeren genetisch komplexen IGE zulassen. Obwohl voraussichtlich einzelne Hauptgeneffekte nur bei einem geringen Anteil von IGE-Patienten (spekulativ < 5%) eine relevante Rolle spielen, ist es wahrscheinlich, daß komplexe Störungen in den gleichen Funktionssystemen auch bei der Epileptogenese von IGE-Patienten mit polygener Disposition vorliegen. Es besteht damit die Aussicht, daß die aus molekulargenetischen Erkenntnissen resultierenden Therapieansätze vielen Epilepsie-Patienten zu Gute kommen werden.

Nach dem Abschluß des PrimeHuman Genome ProjectPrime ist mit einem raschen Fortschritt bei der Aufklärung von Erkrankungen mit genetisch komplexer Disposition zu rechnen. In den Kandidatengenregionen können dann positionell und funktionell plausible Gene systematisch in Mutationsanalysen überprüft werden. Sobald IGE-Gene ermittelt werden, lassen sich weitere Gene dieses Funktionsspektrums gezielt testen. Aktuell zeichnen sich bereits erste Erfolge dieser Strategie ab. So konnten Genmutationen in anderen Untereinheiten der bisher identifizierten Ionenkanäle als heterogene Erkrankungsursache bei weiteren monogenen IGE-Syndromen ermittelt werden (Charlier et al., 1998; Biervert et al., 1998; Singh et al., 1998; Wallace et al., 1998; Escayg et al., 2000a). Darüber hinaus bestehen Hinweise dafür, daß verschiedene Mutationen eines Gens zu phänotypisch sehr unterschiedlichen paroxysmalen Störungen führen können. Dominante Mutationen in dem Kalziumkanalgen CACNA1A sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Lokalisation und der dadurch variierenden Funktionsstörung an der Pathogenese der familiären hemiplegischen


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Migräne, der episodischen Ataxie (Typ 2) und der chronischen spinocerebellären Ataxie (Typ 6) beim Menschen verantwortlich (Übersicht in: Terwindt et al., 1998). Eine autosomal-rezessiv vererbte Mutation im homologen Cch1a Gen bei der PrimetotteringPrime Mausmutante führt zu einem Erkrankungsbild mit Absence-Anfällen und einer chronisch progredienten Ataxie (Fletcher et al., 1996). Die Identifizierung von IGE-Genen könnte demnach zur Aufklärung eines weiten Spektrums von genetisch determinierten paroxysmalen Störungen einen Beitrag leisten.

Molekulargenetische Kenntnisse werden dazu beitragen, die molekularen Mechanismen der Epileptogenese aufzuklären und rational begründete Therapieansätze zu entwickeln. Auch wenn die Ermittlung eines Gendefekts nicht ausreichend ist, die Erregungsregulation in komplexen neuronalen Netzwerken zu erfassen, so können die epileptogenen Auswirkungen dieser Einzelfaktoren im interaktiven Zusammenhang mit komplexen Regulationssystemem in tierexperimentellen Forschungsansätzen untersucht werden (Puranam & McNamara, 1999). Die Klonierung von zahlreichen neuronalen Ionenkanälen und Rezeptorgenen schafft die Voraussetzungen, Antiepileptika mit spezifischen Wirkungsmechanismen zu entwickeln (Propping & Nöthen, 1995). Zusätzlich lassen sich durch molekulargenetische Testsysteme die funktionellen Genvarianten von zahlreichen Stoffwechselenzymen (z.B. Cytochrome P450) bestimmen, wodurch sich individuell pharmakogenetische Besonderheiten bei der Antiepileptika-Therapie voraussagen lassen (Mamiya et al., 1998; Coutts & Urichuk, 1999). Dadurch kann die Pharmakotherapie bei einem Epilepsie-Patienten gezielter geplant und nebenwirkungsärmer durchgeführt werden. Sobald einzelne Hauptgene für die häufigen IGE identifiziert sind, können diagnostische Tests ein genetisches Risikoprofil bei jedem Patienten ermitteln (Propping & Nöthen, 1995; Davies & Hanna, 1999). Bei Vorliegen von spezifischen Hauptgeneffekten können diese Patienten dann mit individuell differenzierten Therapieansätzen behandelt werden. Es ist voraussehbar, daß die molekulargenetische Forschung in den nächsten zehn Jahren einen bedeutenden Beitrag zum Verständnis der Epileptogenese und der epileptologischen Therapie leisten wird.


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