Schmidt-Westhausen, Andrea Maria: Experimentelle Untersuchungen zur Pathogenese und Therapie der oralen Candidiasis bei Immundefizienz

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Kapitel 1. Einleitung und Literaturübersicht

1.1 Kolonisation und Infektion der Mundhöhle mit Candida Spezies

In der Mundhöhle können eine Reihe von Hefen isoliert werden, wobei es sich in der Mehrzahl um Candida spp. (Familie: Cryptococcaceae; Klasse: Blastomycetes; Unterabteilung: Fungi imperfecti) handelt (Tab. 1). Die häufigste Spezies hierbei ist C. albicans. Hefen wie Rhodotorula glutinis und Saccharomyces cerevisiae werden nur selten in der Mundhöhle nachgewiesen, hierdurch hervorgerufene Infektionen und Erkrankungen sind nicht bekannt. Sproßpilze im allgemeinen und C. albicans im Besonderen werden als Kommensalen des Verdauungstrakts von gesunden Individuen gefunden . Sie sind Teil der normalen mikrobiellen Flora des Menschen und können als klinisch symptomloses Reservoir für spätere Infektionen dienen . Bei Störung des Gleichgewichts zwischen Wirtsabwehr und Virulenzfaktoren des Keims kann es zum Übergang von Kommensalismus zur Infektion kommen.

Tab. 1: Übersicht über Candida spp. und weitere Hefen, die in der Mundhöhle nachgewiesen werden und deren Häufigkeit (nach Odds 1988 )

Hefen

Isolate in %

Candida albicans

47-75 %

Candida tropicalis

7

Candida glabrata

7

Candida krusei

< 5

Candida parapsilosis

< 5

Candida guilliermondii

< 5

Rhodotorula spp.

< 4

Saccharomyces cerevisiae

< 2

Die Angaben über die Häufigkeit des Auftretens von Candida spp. ohne klinische Zeichen oder Symptome von Schleimhauterkrankungen (Kolonisation) sind unterschiedlich und liegen zwischen 32 % und 60 % bzw. 20 % - 50 % .

Die Übersicht spiegelt die Summe von 17 Studien, in die verschiedene Personengruppen (u.a. auch gesunde Probanden) einbezogen wurden, wider. Daten über eine reine Besiedlung der Mundhöhle mit Candida spp. bei Gesunden können erst dann als gesichert gelten, wenn mikrobiologische Befunde mit klinischen Angaben korre


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liert werden. Die Mehrzahl vorliegender Studien jedoch stützt sich auf unvollständige Angaben über Allgemeinzustand, mögliche Grunderkrankungen und intraoralen Befund. Die große Variationsbreite der der Literatur entnommenen Daten ist bedingt durch fehlende Informationen über den Gesundheitszustand der Probanden/Patienten , so daß allein aufgrund deren Rekrutierung aus Kliniken und Krankenhäusern prädisponierende Erkrankungen vorliegen konnten.

Epidemiologischen Studien zufolge liegt die Prävalenzrate für das Auftreten mehrerer Candida spp. gleichzeitig bei ca. 10 % . Es ist anzunehmen, daß die tatsächliche Zahl größer ist, da Differenzierungsmöglichkeiten von dem verwendeten Medium und der bei der mikrobiologischen Aufbereitung verwendeten Sorgfalt abhängen. Mit Hilfe der Mundspülmethode können Kombinationen von C. albicans mit einer oder mehrerer der folgenden Spezies nachgewiesen werden: C. glabrata, C. tropicalis und C. krusei .

Die Anzahl von Candida-Zellen pro Milliliter Speichel liegt bei klinisch unauffälligen Personen bei 200 - 500 CFU (colony forming units = koloniebildende Einheiten)/ml . Wird die Mundspültechnik verwendet, können ca. 600 CFU/ml nachgewiesen werden .

1.2 Begriffsbestimmung Candidiasis (Candidose)

Candidiasis und Candidosis sind beides Begriffe, die für die Beschreibung von Infektionen mit Hefen der Gattung Candida verwendet werden. Während der Rat der Internationalen Organisationen der Medizinischen Wissenschaften 1982 die Bezeichnung (orale) Candidiasis vorschlug , wird in Europa überwiegend der Begriff „Candidose“ verwendet. Gemäß der „International Society for Human and Animal Mycology (ISHAM) werden die Begriffe „Candidose“ oder „Candidosis“ sowie „Candidiasis“ als gleichwertig angesehen . In vorliegender Arbeit wird die Bezeichnung (orale) Candidiasis verwendet.

Die mit den englischen Begriffen „yeast“ und „yeast-like fungi“ bezeichneten Pilze werden im deutschen Sprachgebrauch als Hefen, echte Hefen, hefeähnliche und hefeartige Pilze, Hefe- und Sproßpilze benannt.

Der Begriff Candidiasis steht für eine Erkrankung mit klinischen Zeichen und Symptomen, die vorwiegend durch C. albicans, jedoch auch C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata u.a. hervorgerufen wird. Kennzeichnend sind makroskopisch sichtbare Veränderungen der Mukosa (erythematöse oder pseudomembranöse Areale), der histologische Nachweis PAS-positiver Strukturen (Pseudohyphen und/oder Hyphen) sowie histopathologische Veränderungen der infizierten Mukosa, die je nach Er


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scheinungsform entweder eine Atrophie bzw. Hyperparakeratose, Akanthose und Entzündungsreaktion mit Mikroabszessen in der oberen Anteilen der Stachelzellschicht sowie ein mononukleäres Band im darunterliegenden Bindegewebe aufweisen.

Davon abgegrenzt werden muß der Begriff (Candida- ) Infektion, der per se bedeutet, daß der Mikroorganismus sich im Körper festgesetzt hat. Hierbei kommt es zu keiner makroskopisch sichtbaren Veränderung der Mukosa (subklinische Infektion), histopathologisch jedoch finden sich PAS-positive Strukturen in den oberen Anteilen des Epithels sowie mäßige entzündliche Reaktionen. Der Wirt ist somit Keimträger.

Die Anwesenheit bzw. der Nachweis von Sproßpilzen allein bedeutet weder, daß eine (klinisch apparente) Candidiasis noch eine (subklinisch verlaufende) Infektion mit Candida spp. vorliegt, sondern ist Zeichen einer Kolonisation .

In diesem Zusammenhang ist von Bedeutung, daß sich aus der Keimmenge (gewonnen mittels Abstrich- oder Mundspülmethode) nicht das Vorhandensein einer mukosalen Infektion mit Candida spp. ableiten läßt. Es besteht keine unmittelbare Assoziation zwischen dem mikrobiologischen Nachweis hoher Keimzahlen und dem Auftreten einer Schleimhautveränderung . Bei immungesunden Personen ohne klinische Manifestationen können mittels Abstrichtechnik gewonnene Proben 103 CFU/ml aufweisen , während bei Patienten mit HIV-Infektion in einigen Fällen nur 50 CFU/ml nachweisbar waren und dennoch klinische Veränderungen beobachtet wurden .

1.3 Die orale Mukosa und Immunabwehr von Infektionen mit C. albicans

Im oralen Epithel findet sich eine konstante Population nicht-epithelialer immunkompetenter Zellen, die Lymphozyten und Langerhans-Zellen (LHZ). Letztere sind spezialisierte Zellen mit dendritischer Oberfläche, die von Knochenmarksvorläufern abstammen und zytoplasmatische Organellen (Birbeck-Granula) enthalten. LHZ sind mit den dendritischen Zellen der Milz und der Lymphknoten verwandt und gehören zu der Gruppe der antigenpräsentierenden Zellen (APZ). LHZ binden zunächst ein Antigen an ihre Oberfläche, verarbeiten es und wandern, das Antigen tragend, von der Mukosa durch die Lymphe in die regionalen Lymphknoten, wo sie sich zu dendritischen Zellen differenzieren, die eine starke kostimulierende Aktivität besitzen. Im Lymphknoten wird das Antigen von interdigitierenden dendritischen Zellen naiven CD4+-T-Zellen präsentiert. Während der Erkennungsphase der primären Immunantwort gegen Proteinantigen sind dendritische Zellen der wichtigste Zelltyp, um naive T-Zellen zu stimulieren.


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Das orale Epithel der Maus beherbergt 8-11 nicht-epitheliale Zellen pro 1000 Basalzellen, das humane Epithel ca. 100 pro 1000 Basalzellen. 41 % dieser Zellen beim Menschen sind LHZ, bei der Maus 57 % . LHZ finden sich in der humanen oralen Mukosa mehrheitlich im Stratum spinosum (61 %), während bei der Maus eine nahezu gleiche Verteilung im Stratum basale, suprabasal und im Stratum spinosum vorliegt. Die kleinen Populationen von intraepithelialen Lymphozyten beim Menschen sind mehrheitlich CD8+-T-Zellen. Bei Mäusen exprimieren dagegen 50 % der intraepithelialen Lymphozyten die gammadelta-Form des T-Zell-Rezeptors. Bei den meisten anderen Tierarten einschließlich des Menschen, sind nur ca. 10 % der intraepithelialen Lymphozyten gammadelta-Zellen .

Zu einer Infektion mit C. albicans kommt es, wenn der Mikroorganismus in die Oberfläche der Epithelien eindringen kann, wie z.B. bei gestörter Schleimsekretion. Die Infektion mit C. albicans ist gekennzeichnet durch eine Vermehrung des Mikroorganismus im Extrazellulärraum auf Epitheloberflächen. Um den Wirt zu schützen sind bei einer Candida-Infektion zwei verschiedene Arten der Immunantwort, d.h. die unspezifische zelluläre sowie eine erworbene zellvermittelte Immunität notwendig. Dies geschieht in erster Linie durch Phagozytose, Zytokinsekretion der Phagozyten (TNF-alpha, IL 1, IL6, IL 8, IL12) und die hierdurch ausgelöste Aktivierung von Lymphozyten. Bei einer Candida-Infektion sind maßgeblich CD4+-T-Zellen involviert, denen Antigenpeptide durch antigenpräsentierende Zellen (APZ) auf MHC-Klasse II Molekülen angeboten werden.

Verglichen mit der Häufigkeit und Intensität der Mundschleimhaut-Infektion ist die systemische Komplikation einer invasiven, disseminierten Candida-Infektion bei Patienten mit HIV-Infektion selten. Das Ausmaß der mukokutanen Läsion ist in den meisten Fällen limitiert, die Infektion erreicht nicht das subepitheliale Bindegewebe. Dieser Verlauf wird dadurch bedingt, daß HIV-seropositiven Patienten zwar eine Verminderung der Anzahl der CD4+-Lymphozyten und damit der T-Zell-Hilfe eintritt, die nichtadaptive angeborene unspezifische Immunität jedoch primär keine Defekte aufweist. Letztere, basierend auf neutrophilen Granulozyten, Monozyten, Makrophagen sowie Langerhans-Zellen (LHZ) ist für die Abwehr von Pilzen entscheidend.

Die Interaktion zwischen Candida spp. und polymorphkernigen neutrophilen Leukozyten und Makrophagen bezüglich ihrer Abwehrfunktion wurde in einer Reihe von Studien untersucht (Review bei Fromtling et al. 1986 , Greenfield 1992 , Challacombe 1994 ). Analysen zu immunkompetenten Zellen in der Mukosa HIV-seropositiver und -negativer Patienten mit oraler Candidiasis wurden besonders in


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den letzten Jahren veröffentlicht . In vitro Untersuchungen wiesen auf die wichtige Rolle humaner LHZ für die antigenspezifische T-Zellantwort bei Kontakt mit C. albicans hin .

1.4 Klassifikation der oralen Candidiasis

Die Infektion mit C. albicans hat vielfältigste Erscheinungsformen. Das klinische Spektrum umfaßt oberflächliche, relativ lokalisierte Erkrankungen der Haut und des Epithels des Orogastrointestinaltrakts und schwere, lebensbedrohliche Infektionen der inneren Organe. Dazwischen existieren vielfältige Mischformen, die durch unterschiedliche Einflüsse moduliert werden .

Verschiedene Klassifikationen der oralen Candidiasis sind bekannt, wobei die von Lehner am häufigsten verwendet wurde . Als Nachteil dieser Klassifikation erwies sich, daß diese nicht differenziert zwischen ausschließlich intraoral lokalisierten Formen und oralen Manifestationen in Zusammenhang mit der mukokutanen Candidiasis. Daher wurde vorgeschlagen die orale Candidiasis in eine primäre und eine sekundäre Form zu unterteilten. Die primäre Form ist demnach auf orale und periorale Bereiche begrenzt, während die sekundäre Form eine orale Candidiasis als Folge einer systemischen mukokutanen Erkrankung, die auf Haut und Schleimhaut ausgedehnt ist, kennzeichnet .

Weiterhin wurde in der Klassifikation von Lehner nicht zwischen morphologischen und klinischen Kriterien unterschieden, was Mißverständnissen bei der Einteilung der Manifestationen zur Folge hatte. Daher wurde der Begriff „atrophische Candidiasis“ durch den rein deskriptiven Terminus „erythematöse Candidiasis“ ersetzt.

1997 erschien eine Reklassifikation der oralen Candidiasis , die die Nachteile der vorherigen Klassifikationen aufhob und neue klinische Varianten, die zusammen mit der HIV-Infektion auftreten, integrierte (Tab. 2).

Ein weiterer Vorteil dieser Klassifikation ist die Berücksichtigung von Candida-Superinfektionen keratinisierter primärer Veränderungen der oralen Mukosa. So ist die Leukoplakie in 10 % der Fälle superinfiziert, Lichen planus in 40 % und Lupus erythematodes in 50 % .


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Tab. 2: Reklassifikation der oralen Candidiasis (nach Axéll et al. 1997 )

primäre orale Candidiasis

Sekundäre orale Candidiasis

akute Formen

Orale Manifestationen systemischer

mukokutaner Candidiasis

pseudomembranös, erythematös

- als Folge von Erkrankungen wie der

chron. Formen

- Thymus-Aplasie und dem

- hyperplastisch

- Candida-Endokrinopathie-Syndrom

 

nodulär

 

 

plaqueförmig

- erythematös

 

- pseudomembranös

Candida-assoziierte Veränderungen

- Prothesenstomatitis

- Cheilitis angularis

- Glossitis rhombica mediana

Candida Superinfektion von keratinisierten Läsionen

- Leukoplakie

- Lichen planus

- Lupus erythematodes

1.5 Prädisponierende Faktoren

1.5.1 Lokale Faktoren

Verschiedene Faktoren begünstigen die Entstehung einer oralen Candidiasis.

Lokale Ursachen hierfür können Xerostomie, erhöhter Glukosegehalt des Speichels, Tragen von Prothesen (Review bei Budtz-Jörgensen 1990 ) sowie Faktoren sein, die direkt oder indirekt die protektive Wirkung der epithelialen Barriere schwächen. In zytologischen Ausstrichen bei Rauchern wurde eine signifikant höhere Anzahl von Hyphen- oder Pseudohyphen als bei Nichtrauchern nachgewiesen , bei der quantitativen Auswertung von Candida spp. im Speichel wurde dagegen kein Unterschied zwischen Rauchern und Nichtrauchern gefunden . Untersuchungen konnten weiterhin nachweisen, daß eine orale Candidiasis bei Rauchern häufiger als bei Nichtrauchern auftritt , wobei sich bei Rauchern mit erythe


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matöser Candidiasis erheblich höhere Keimzahlen nachweisen ließen als bei Patienten mit erythematöser Candidiasis, die nicht rauchten (88 % versus 66 %) .

Der Zusammenhang zwischen Prothesenstomatitis und Lebensgewohnheiten wurde von einer finnischen Arbeitsgruppe untersucht . Die Ergebnisse zeigten, daß Alkoholkonsum, Zigarettenrauchen und wenig sportliche Aktivität signifikant häufiger mit der Entstehung einer Prothesenstomatitis verbunden ist. Zwar beeinflußten biologische Faktoren wie Speichelflußrate, Mundhygiene und Geschlecht den quantitativen Nachweis von Candida spp., doch bei der Entstehung einer oralen Candidiasis im Sinne einer Prothesenstomatitis war die Lebensführung ausschlaggebend.

In einer Untersuchung homosexueller Männer konnte nachgewiesen werden, daß eine Korrelation zwischen Rauchen und dem Auftreten einer oralen Candidiasis unabhängig von der HIV-Serologie besteht . Lokale Faktoren scheinen bei der Pathogenese einer oralen Candidiasis eine größere Rolle zu spielen als die zugrundeliegende Immunsuppression.

Bei HIV-positiven Rauchern treten neben der oropharyngealen Candidiasis auch weitere HIV-spezifische Veränderungen wie orale/genitale Condylomata acuminata und die Haarleukoplakie signifikant häufiger auf , die Rauchgewohnheiten haben jedoch keinen Einfluß auf die Progression der HIV-Infektion .

1.5.2 Systemische Faktoren

Neben lokalen Kofaktoren liegt der Infektion in den meisten Fällen ein zusätzlicher systemischer Immundefekt des Wirts zugrunde, was eine opportunistische Infektion kennzeichnet .

Zu den allgemein prädisponierenden Faktoren zählen endokrine Störungen, Malabsorption, Kachexie, Hämoblastosen, schwere Allgemeinerkrankungen, Radiatio . Patienten mit Diabetes mellitus oder einer konsumierenden schweren Systemerkrankung entwickeln häufig eine Candidiasis. Bei Neugeborenen ist vermutlich die Unreife des Immunsystems und der Mangel an ausgebildeter Standortflora die Ursache für das Entstehen einer oralen Candidiasis.

Mit der Zunahme vor allem der erworbenen Immundefekte aufgrund von Langzeitintensivmedizin , Therapien mit Immunsuppressiva und Zytostatika , Einnahme von Kortikosteroiden und Antibiotika sowie der Erhöhung des durchschnittlichen Lebensalters stieg in den letzten Jahren die Zahl immunkompromittierter Patienten und damit die Inzidenz einer oropharyngealen Candidiasis.

Nach Organtransplantation immunsupprimierte Patienten sind empfänglicher für Pilzinfektionen, die Candidiasis ist bei diesen Individuen die häufigste Pilzerkrankung,


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wobei als Erreger meistens C. albicans nachgewiesen wird. Bei Herztransplantierten kommt es unmittelbar postoperativ zum Auftreten von klinischen Veränderungen im Rachenraum und Ösophagus. Im Gegensatz zur Aspergillose ist der Erkrankungsverlauf jedoch selten tödlich . Eine Studie zeigte, daß 10 % der Nierentransplantierten eine Form der oralen Candidiasis aufwies , das Auftreten scheint abhängig von der verabreichten Medikation zu sein . Patienten mit einer Kombinationstherapie bestehend aus Cyclosporin, Azathioprin und Prednisolon weisen eine signifikant höhere Inzidenz auf als Patienten mit der Zweierkombination bestehend aus Azathioprin und Prednisolon bzw. Cyclosporin und Prednisolon. Patienten nach Knochenmarktransplantation (KMT) mit Neutropenie erkranken häufiger an einer oralen Candidiasis als Patienten nach Organtransplantation .

1.5.3 Die orale Candidiasis bei HIV-Infektion

Abgesehen von den o.g. erworbenen Immundefekten hat die oropharyngeale Candidiasis besonders durch die HIV-Infektion neue Bedeutung erlangt. In den ersten Beschreibungen von AIDS-Erkrankten wurde 1981 auf einen Zusammenhang zwischen dem gleichzeitigen Auftreten einer Pneumocystis carinii Pneumonie (PCP) und einer oralen Candidiasis hingewiesen .

Die orale Candidiasis ist bei HIV/AIDS-Patienten weit verbreitet. Es zeigte sich, daß eine Candidiasis unklarer Genese eines der ersten Zeichen einer HIV-Infektion oder AIDS sein kann. Sie gilt als die häufigste mukosale Manifestation der HIV-Infektion und Zeichen einer symptomatischen HIV-Infektion (Stadium B nach CDC-Klassifikation 1993 ). Schon seit den ersten Meldungen über HIV/AIDS wurden zahlreiche Berichte publiziert, die einen engen Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer oropharyngealen Candidiasis und der Progression zur Krankheit AIDS beschrieben . Die orale Candidiasis (und die Haarleukoplakie) stellen einen prognostischen Marker der Erkrankung AIDS dar . Gemäß der EC-Klassifikation von 1993 zählt sie zu den oralen Läsionen, die eng mit der HIV-Infektion assoziiert sind

Es ist davon auszugehen, daß jeder HIV-Patient im Verlauf seiner Erkrankung mindestens eine Episode einer Form der oralen Candidiasis aufweist, wobei das Auftreten mit der CD4+-Lymphozytenzahl assoziiert ist. So ist die Wahrscheinlichkeit an einer oralen Candidiasis zu erkranken für solche, deren CD4+ -Zell-Zahl > 200/ml beträgt, geringer als für Patienten, deren CD4+-Zell Werte < 200/ml liegen . Bei gleicher CD4+-Zell-Zahl ist das Risiko eine orale Candidiasis


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zu entwickeln bei Personen, die durch i.v. Drogengebrauch infiziert wurden, höher als bei homosexuellen Patienten .

Bei HIV-Infektion wird unterschieden zwischen der pseudomembranösen und der erythematösen Form. Gleichzeitiges Auftreten verschiedener Typen der Candidiasis ist möglich. In zwei Longitudinalstudien wurde anhand statistischer Analysen gezeigt, daß die erythematöse sowie pseudomembranöse Candidiasis die selbe Bedeutung als Vorzeichen in Hinblick auf eine Progression der Erkrankung haben . Dagegen wurde in einer Querschnittsuntersuchung neueren Datums nachgewiesen, daß die pseudomembranöse eher mit dem Fortschreiten der Erkrankung korreliert zu sein scheint als die erythematöse Form .

Assoziiert mit der oralen Candidiasis HIV-infizierter Personen ist die Cheilitis exfoliativa. Es handelt sich hierbei um eine chronisch oberflächliche Entzündung des Lippenrots mit anhaltender Schuppung . Obwohl sie nicht Bestandteil der EC-Klassifikation der HIV-assoziierten oralen Läsionen von 1993 ist, konnte in einer prospektiven Studie gezeigt werden, daß bei 24/47 (57,4 %) HIV-Patienten mit Cheilitis exfoliativa C. albicans allein und in Kombination mit C. tropicalis, C. glabrata und C. krusei aus Lippenabstrichen isoliert werden konnte. 27/47 Patienten wiesen gleichzeitig eine Form der oralen Candidiasis auf .

1.6 Therapie

Die Behandlung der mukosalen Candidiasis kann zunächst mit topisch anwendbaren Präparationen erfolgen. Zur lokalen medikamentösen Therapie werden neben der als wirksam belegten Chlorhexidin-Lösung und Polyvidonjod-Lösung die nicht resorbierbaren Antimykotika-Suspensionen vom Polyen-Typ (Amphotericin B und Nystatin) oder die lokal applizierbaren Azol-Derivate wie Clotrimazol-Lutschtabletten und Miconazol-Gel empfohlen. Die Lokalbehandlung, die sich über mehrere Wochen erstrecken muß, erfordert eine gute Compliance, teilweise treten Geschmacksbeeinträchtigungen und gastrointestinalen Beschwerden auf.

Durch die Zunahme von Pilzinfektionen bei HIV-Infizierten wurde in den letzten Jahren verstärkt nach neuen Therapiemöglichkeiten zur systemischen Behandlung gesucht. Dabei zeigte Amphotericin B als Standardmedikament in der Langzeitanwendung schwere Nebenwirkungen wie Nierenschädigung und Blutbildveränderungen. Mit Ketoconazol, einem Antimykotikum der Azolreihe, war ein oral verfügbares und systemisch wirksames Breitspektrumantimykotikum im Handel, das weitaus weniger Nebenwirkungen aufwies als die Polyene. Ketoconazol wurde bei Patienten mit HIV-


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Infektion als intermittierende Therapie bei Bedarf eingesetzt. Doch die breite Anwendung von Ketoconazol, die wachsende Zahl systemischer Mykosen und Resistenzbildung machte weitere therapeutische Alternativen notwendig. Vor knapp zehn Jahren wurde eine neue Generation der Azole, die Triazole, entwickelt. Besonders Fluconazol wurde zur Behandlung der oralen und oropharyngealen Candidiasis bei diesem Patientenklientel und bei Patienten mit Leukämie und Karzinomen für die Therapie und Prophylaxe eingesetzt und intensiv untersucht . Die Wirksamkeit von Fluconazol bei einmaliger Gabe, die gute orale Bioverfügbarkeit sowie die geringe Toxizität haben zu einem weit verbreiteten Einsatz für die Behandlung der mukosalen Candidiasis geführt. Im Vergleich zu Ketoconazol ist Fluconazol wirksamer sowohl bei der Behandlung einer oropharyngealen und ösophagealen als auch einer dissemierten Candidiasis . Die Vorteile von Fluconazol sind geringe unerwünschte Wirkungen im Vergleich zu anderen Triazolen, die gute Resorption bei besserer Stabilität im sauren Milieu des Magens sowie die Verfügbarkeit von oraler (Kapseln/Suspension) und intravenös zu applizierenden Formulierung . Darüber hinaus führt Fluconazol nicht zu einer Veränderung der oralen bakteriellen Standortflora . Fluconazol wurde anfänglich als Primärprophylaxe bei HIV-seropositiven Patienten mit einer CD4+-Zell-Zahl unter 200/µl und bei rezidivierender oropharyngealer Candidiasis eingesetzt . Folge davon war eine Resistenzentwicklung von Candida spp. wie C. glabrata und C. krusei . In einer eigenen Untersuchung wurden bei 57 HIV-infizierten Patienten unter Sekundärprophylaxe (2 x 100 mg/w Fluconazol) Abstriche der oralen Mukosa genommen und mikrobiologisch quantifiziert und subkultiviert. In 34/57 (59,6 %) wurden Candida spp. isoliert. Im Gegensatz zu früheren Untersuchungen waren C. glabrata und C. krusei häufiger nachzuweisen . Diese Ergebnisse können Hinweis auf einen therapiebedingten Spezies-Shift geben.

Neben der Resistenzentwicklung gegenüber C. glabrata und C. krusei wurde über das Auftreten Fluconazol-resistenter C. albicans Stämme berichtet, der Nachweis einer Änderung im Biotyp oder Serotyp war jedoch nicht ursächlich für die Resistenzentwicklung . Resistenzen gegenüber Fluconazol sind im allgemeinen assoziiert mit einer vorausgegangenen Anwendung in Form einer intermittierenden Therapie oder kontinuierlicher prophylaktischer Medikation bei rezidivierender Candidiasis (Review bei Vanden Bosche et al. 1998 ), so daß eine Prophylaxe und Therapie mit Fluconazol bei klinisch wenig ausgeprägter Candidiasis nicht empfohlen wird . Die Gefahr einer Resistenzbildung ist größer bei Anwendung von Fluconazol als bei Ketoconazol-Gabe, Ketoconazol-Resistenzen sind wie


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derum häufiger als Resistenzen gegen Itraconazol (Review bei Odds 1993 ). Die Therapie einer rezidivierenden Candidiasis bei immunkompromittierten Patienten wird durch Resistenzbildungen gegenüber weiteren Azol-Derivaten sowie Kreuzresistenzen innerhalb der Azolgruppen erschwert . Selbst Resistenzen gegenüber Polyenen wurden beschrieben .

1.7 Tierexperimentelle Untersuchungen zur oropharyngealen Candidiasis

Die orale Candidiasis wurde experimentell anhand verschiedener Tiermodelle untersucht, da sich auf diese Weise die Erkrankung beeinflussende Parameter wie Ernährung, Speichelfluß, Einnahme von Antibiotika, orale Flora, immunologischer Status und Vorhandensein von Stoffwechselstörungen individuell und systematisch evaluieren lassen.

Verschiedene Ansätze wurden gewählt, um die orale Candidiasis am Tiermodell zu untersuchen. Diese lassen sich grob in fünf Bereiche unterteilen:

  1. Untersuchungen zu Schleimhautveränderungen hervorgerufen durch den Mikroorganismus C. albicans
  2. Untersuchungen der oralen Candidiasis bei Immunsuppression oder Veränderungen des Immunsystems
  3. Untersuchungen bei systemischen Veränderungen
  4. Untersuchungen der oralen Mukosa bei Veränderungen des Mundhöhlenmilieus
  5. Studien zur antimykotischen Therapie

1.7.1 Untersuchungen zu Schleimhautveränderungen hervorgerufen durch C. albicans

Die Pathogenese der oralen Candidiasis wurde anhand von Tiermodellen, hauptsächlich Wistar und Sprague-Dawley Ratten und Mäusen untersucht . Es zeigte sich, daß C. albicans schon im frühen Infektionsstadium zu klinisch sichtbaren Veränderungen der Gingiva, des Planum buccale und der Zunge im dorsalen Anteil führt; letztere scheint eine Prädilektionsstelle der persistierenden oralen Candidiasis zu sein.

Um die Ursachen für epitheliale Veränderungen bei einer Candidiasis zu eruieren, wurde C. albicans in die linke bukkale Schleimhaut von Ratten injiziert . Es zeigte sich, daß durch diesen Eingriff eine erhöhte Mitoserate im Epithel oberhalb der Injektionsstelle im Vergleich zur Gegenseite induziert wurde. Diese Ergebnisse deu


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ten darauf hin, daß C. albicans Substanzen produziert, die epitheliale Veränderungen hervorrufen. Durch diesen Versuch wurde eine frühere Untersuchung bestätigt, die nachweisen konnte, daß Tiere, denen eine palatinale Kunststoffplatte eingesetzt wurde, eine oberflächliche Infektion mit erhöhter Mitoseaktivität aufwiesen . Ob gleichzeitig klinische Veränderungen der Rattenmukosa vorhanden waren, wurde in diesen Arbeiten nicht angegeben.

Auch anhand eines Hamstermodells wurden Reaktionen der Mukosa auf C. albicans untersucht, wobei eine Suspension des Mikroorganismus in die Wangentasche der Tiere injiziert wurde , in Folge entstanden Mikroabszesse und eine Infiltration von neutrophilen Granulozyten. Diese Methode scheint ebenfalls für Untersuchungen zur experimentellen Candidiasis geeignet zu sein. Anhand dieses Modells wurden in einer Langzeitstudie Auswirkungen einer chronischen Inokulation mit C. albicans in Hinblick auf die Entstehung von Dysplasien, Neoplasien und Candida-Leukoplakien untersucht . Nach zwei bis neun Monaten konnten nur bei einigen Tieren makroskopische Veränderungen, bei allen jedoch Mikroabszesse und Hyperparakeratose sowie eine deutliche Verbreiterung des Stratum corneum beobachtet werden. Der Untersuchungszeitraum schien jedoch nicht ausreichend, um eine Progression der Epithelveränderungen dokumentieren zu können. Wurde die Wangenmukosa der Tiere mit Terpentin zur Induktion einer Epithelhyperplasie vorbehandelt, führte diese Maßnahme nach vier Wochen zu einer klinisch und histologisch diagnostizierbaren Candida-Leukoplakie .

Um festzustellen, in welchem Maße Mikroorganismus-abhängige Faktoren die Entstehung einer Candidiasis beeinflussen, wurden C. albicans-Zellen einer Reihe von verschiedenen Verfahren unterzogen. In einer Studie sollte die Frage untersucht werden, welche morphologische Struktur von C. albicans (Hyphen- oder Hefeform) eher in der Lage ist eine orale Candidiasis zu induzieren . Hierzu wurden aus 2135 Hefestämmen zwei C. albicans Varianten identifiziert, wobei die eine ausschließlich Blastosporen und die andere nur Pseudohyphen, jedoch keine echten Hyphen oder Keimschläuche bildet. Diese Isolate und eine Keimschlauch-bildende Spezies wurden Ratten, denen zuvor eine palatinale Kunststoffplatte eingesetzt wurde, inokuliert. Beide Varianten waren nicht in der Lage eine Infektion oder klinische Veränderungen am Gaumen hervorzurufen. Anhand dieses Versuchs sollte gezeigt werden, daß eine orale Candidiasis nur von keimschlauchbildenden Stämmen induziert werden kann. Die kleine Zahl untersuchter Varianten läßt jedoch keine definitiven Aussagen zu.


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Anhand von Rattenmodellen wurde veranschaulicht, daß stammbezogene Unterschiede in Hinblick auf die Pathogenität von C. albicans auf die orale Mukosa existieren. C. albicans Stämme aus vier verschiedenen Haut- und Schleimhautregionen wurden über einen Zeitraum von 25 Wochen einmal wöchentlich in die Mundhöhle der Tiere eingebracht. Zwei der inokulierten Stämme riefen keine klinischen und/oder histologischen Veränderungen der Zunge im Sinne einer Glossitis rhombica mediana hervor, die beiden weiteren jedoch waren dazu in der Lage . Ein Versuch mit 16 C. albicans Isolaten von Patienten, die vier klinische Formen einer oralen Candidiasis aufwiesen, zeigte, daß nur sechs dieser Stämme charakteristische Läsionen am Zungenrücken hervorriefen . Bei weiteren zehn Isolaten wurde lediglich eine Hyphenpenetration in die obersten Keratinschichten ohne klinische Veränderungen beobachtet. Anhand dieser Untersuchung wird deutlich, daß je nach verwendetem C. albicans Stamm ein unterschiedliches Spektrum an klinischen und histologischen Reaktionen am Zungenrücken der Ratte hervorgerufen werden kann. Tiere, die zusätzlich mit Cyclosporin A vorbehandelt wurden, erkrankten häufiger an einer Candidiasis als unbehandelte .

Spezies-abhängige Unterschiede wurden anhand eines Mausmodells (DBA/2J-Inzuchtmaus) nur an gastrointestinaler Schleimhaut untersucht. In keinem Falle wurde eine Organbeteiligung festgestellt. Wurden die Mäuse mit Zytostatika und Antibiotika vorbehandelt, so war C. tropicalis eher als C. albicans in der Lage, in die geschädigte Magenschleimhaut einzudringen. Diese Ergebnisse entsprechen klinischen Beobachtungen von Patienten nach Cytarabin-Therapie, die häufiger an einer disseminierten C. tropicalis Infektion als an C. albicans Infektionen erkranken .

1.7.2 Untersuchungen der oralen Candidiasis bei Beeinträchtigung des Immunsystems

Bekannt ist, daß die Kortikosteroid-Medikation eine orale Candidiasis induzieren kann. Dieses Phänomen wurde vor ca. 30 Jahren an Makakken untersucht, denen eine Akrylat-Vorrichtung zur Simulation einer Oberkiefer-Prothese eingegliedert wurde . Nach Vorbehandlung dieser Tierspezies mit Kortikosteroiden aber auch bei längerer Beobachtungsdauer trat eine pseudomembranöse Candidiasis auf, pathohistologisch war eine Hyphen-Invasion in die Mukosa nachweisbar. Bei unbehandelten Tieren resultierte ein diffuses Erythem ohne Hyphen-Invasion, das sich innerhalb von drei Wochen zurückbildete. Wurden Ratten mit Kortikosteroiden und Antibiotika vorbehandelt, so entwickelten sie eine superfizielle Candida-Ösophagitis, bei Zugabe von Azathioprin zeigten sich größere und ausgedehntere Läsionen . In


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einem Versuch wurde Mäusen C. albicans inokuliert und eine tägliche Keimzahlbestimmung vorgenommen. Zusätzlich erfolgte die Applikation eines Kortikosteroidgels (Fluocinonid, Topsyn® Gel) auf die orale Mukosa der Maus. Nach 21 Tagen topischer Applikation resultierte ein durch Abstrichmethode ermittelter 400facher Anstieg der Keimzahl. Während der Dauer der Behandlung reduzierte sich die ortständige Population intraepithelialer CD4+-Zellen der oralen Mukosa und es kam zu einer Reduktion der T-Zellen im Lymphknoten . Ob der Anstieg der Keimmenge mit klinischen Veränderungen der Mukosa verbunden war, wurde in diesem Experiment nicht evaluiert.

Weitere pharmakologische Eingriffe in das Immunsystem wurden mit immunmodulierenden Präparaten, wie z.B. Cyclosporin A durchgeführt . Für dieses Modell erfolgte zunächst eine subkutane Luftinjektion in den Rücken von Mäusen. In diese künstlich pneumatisierten „Zysten“ wurde C. albicans injiziert, woraufhin sich bei den Tieren, die mit Cyclosporin A oder Kortison vorbehandelt wurden, auf der Zystenoberfläche Veränderungen ähnlich denen der pseudomembranösen Candidiasis entwickelten. Bei unbehandelten Mäusen fanden sich keine klinischen Veränderungen. Unter der Behandlung mit Cyclosporin A trat keine systemische Dissemination des Mikroorganismus auf. Anhand dieser Untersuchungen sollte gezeigt werden, daß durch eine Immunsuppression mit Cyclosporin A Abwehrmechanismen gegenüber der superfiziellen Form der Candidiasis beeinträchtigt werden, nicht jedoch die gegen die invasive Form, daher kann von zwei verschiedenen Abwehrmechanismen ausgegangen werden.

Untersuchungen an Mäusestämmen, die durch einen definierten angeborenen genetischen Defekt des Immunsystems charakterisiert waren, zeigten, daß der Verlust einer einzigen immunologischen Komponente (Neutrophilenfunktionsdefekt bei bg/bg Mäusen oder T-Lymphozytendefekt bei nu/nu Mäusen) lediglich eine schwache Empfänglichkeit gegenüber C. albicans zur Folge hatte. Die Kombination eines Defekts der zellvermittelten Immunität mit einem Phagozytendefekt (z. B. Neutrozytopenie) wie bei der bg/bg nu/nu Maus, führte zu plaqueähnlichen Läsionen sowohl an der Zunge als auch am harten Gaumen. Histopathologisch war eine deutliche Hyphen-Invasion in die Epithelschichten zu erkennen. Eine CD4+-Lymphozyten-Depletion bei Mäusen führte bei permanenter Inokulation von C. albicans durch das Trinkwasser zu einer intraoralen, nach zwei Wochen zusätzlich zu einer schweren ösophagealen Candidiasis, die auch noch vier Wochen nach Beendigung der Inokulation persistierte . In weiteren Versuchen wurden keimfreie J(H)D Mäusen (B-Zell Knockout Mäuse) mit einer Reinkultur von C. albicans oral inokuliert. Es


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zeigte sich, daß diese gegenüber einer oralen und disseminierten Candidiasis ebenso resistent sind wie immunkompetente Mäuse. Daraus kann geschlossen werden, daß die angeborene und erworbene T-Zell vermittelte Immunantwort ausreicht, um B-Zell Knockout Mäuse gegen mukosale und systemische Candidiasis zu schützen. Möglicherweise werden B-Zellen jedoch benötigt, um Mäuse vor einem primär intravenösen Eindringen von C. albicans zu schützen . Die zellvermittelte Immunität bei gnotobiotischen, mit C. albicans oral inokulierten Mäusen, wurde anhand von Korrelaten (Lymphozytenproliferation) untersucht . Keimfreie Mäuse ohne (nu/nu) und mit Thymus (nu/+) wiesen an der Cardia sowie an der dorsalen Zunge eine histologisch nachgewiesene Hyphen-Invasion auf. Die nu/+ Mäusen reagierten auf Kolonisation und Infektion mit einer positiven Lymphozytenproliferation, die mit der Fähigkeit zu korrelieren schien, die Hyphen von Zunge und Magen zu entfernen. Bei den nu/nu Mäuse dagegen persistierte eine mukosale Candidiasis (Zunge/Magen) und eine Lymphozytenproliferation war nicht zu beobachten. Diese Studie zeigte, daß die T-Zell-vermittelte Immunität eine Rolle innerhalb der angeborenen Resistenz gegen eine mukosale Candidiasis spielen kann. Da jedoch weder nu/nu noch nu/+ Mäuse eine progressive systemische Candidiasis entwickelten, scheinen T-Zellen keine maßgebliche Rolle bei der Resistenz der Mäuse gegenüber einer systemischen Candidiasis endogenen Ursprungs zu spielen .

1.7.3 Untersuchungen bei systemischen Erkrankungen

Die orale Candidiasis ist charakteristischerweise assoziiert mit bestimmten systemischen Erkrankungen wie Diabetes mellitus und Anämie. Um den Einfluß der endokrinen Störung auf die Entstehung einer Candidiasis zu evaluieren, wurden Wistar-Ratten mit dem diabetogenen Medikament Streptozotozin behandelt . Die Zunge wurde mit einer Einmaldosis von C. albicans inokuliert, als Folge trat eine chronische Mykose der Zungenschleimhaut mit klinischen Veränderungen der Zunge in Form des Verlustes der filiformen Papillen auf. Bei der Hälfte der untersuchten Tiere konnten noch bis zu 10 Monaten nach Inokulation Hyphen, jedoch keine klinischen Veränderungen, in den superfiziellen parakeratotischen Schichten beobachtet werden. Die Kontrollgruppe zeigte nach einmaliger Inokulation dagegen klinisch keine Zungenveränderungen.

Um den Einfluß der Eisenmangelanämie auf die Ausbildung der oralen Candidiasis zu beurteilen, wurden genetisch prädisponierte Mäuse (sex-linked anaemia Maus-Mutante) verwendet, die eine hypochrome, mikrozytäre Form der Anämie aufweisen . Dieser Status in Kombination mit einer Hydrokortison- und Tetracyclin-


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Anreicherung des Trinkwassers der Tiere führte zur Etablierung einer oralen Candidiasis. Die Eisenmangelanämie an sich hatte hingegen keinen Einfluß auf die Empfänglichkeit der oralen Mukosa gegenüber C. albicans.

1.7.4 Untersuchungen der oralen Mukosa bei Veränderungen des Mundhöhlenmilieus

In einer Reihe von experimentellen Untersuchungen wurden Tieren im Oberkiefer Kunststoffplatten aus Acryl eingegliedert, um die Entstehung einer Candidiasis zu begünstigen. Diese Vorrichtung diente als Modell für den Einfluß einer Oberkieferprothese auf das Mundhöhlenmilieu des Menschen. In den ersten Studien, die sich mit dieser Fragestellung beschäftigten, dienten zunächst Affen als Versuchstiere , aus tierschutzrechtlichen Gründen wurden in den folgenden Experimenten Ratten bevorzugt . Wurde zusätzlich eine Xerostomie induziert, z.B. mit dem Anticholinergikum Oxyphenzyklimin, erhöhte sich der klinische Ausprägungsgrad der Candidiasis . Bei Wistar-Ratten war die palatinale Candidiasis mit dem Vorhandensein einer Acrylvorrichtung assoziiert, ohne Platte entwickelte sich dagegen keine Candidiasis bzw. bildete sich diese nach Entfernung der Vorrichtung zurück . Anhand des selben Modells wurde die Wirkung verschiedener Hefen auf eine palatinale Infektion untersucht . Ebenfalls unter Verwendung dieses Ansatzes wurden mögliche Therapien der Prothesenstomatitis getestet .

Mit der Pathogenese der oralen Candidiasis wurde die Gabe von Antibiotika in Verbindung gebracht, da konkurrierende Bakterien vernichtet werden und das Hefenwachstum begünstigt wird. Im Tiermodell wurde hauptsächlich der Einfluß von Tetrazyklin untersucht, möglicherweise wegen seiner Breitspektrumaktivität und dem Zusammenhang mit der Entstehung einer Candidiasis beim Menschen. In einer Vielzahl von Protokollen wurden verschiedene Parameter, die mit einer Candidiasis unter Tetrazyklingabe verbunden sind, untersucht, einschließlich Dosis und Anwendungsschema . Auf der Rattenzunge zeigte die kontinuierliche Behandlung mit Tetrazyklin bei gleichzeitiger Inokulation von C. albicans eine klinische Veränderung im Sinne einer sog. Glossitis rhombica mediana, was die Rolle von C. albicans bei der Entstehung dieser Läsion bestätigte . Dieses Rattenmodell zur Glossitis rhombica mediana wurde ebenso zur Untersuchung der Effektivität von Tetrazyklin bei der Etablierung einer Candidiasis bei keimfreien im Vergleich zu konventionellen Tieren eingesetzt sowie bei Untersuchungen zum Einfluß einer kohlenhydratreichen Diät . Obwohl in vielen Studien gezeigt werden konnte,


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daß Tetrazyklin die Entstehung einer oralen Candidiasis erleichtert, konnte zumindest eine Untersuchung nachweisen, daß auf eine Tetrazyklingabe verzichtet werden kann, wenn bei den Versuchen ein hochvirulenter Stamm von C. albicans eingesetzt wird .

Gnotobiotische Tiere wurden zur Untersuchung verschiedener infektiöser Mikroorganismen verwendet, da definierte Monoinfektionen ohne den Einfluß weiterer Bakterien oder Hefen möglich sind. So bietet diese Methode Vorteile, obwohl sie teuer und in der Durchführung problematisch sein kann. Frühere Studien zeigten, daß bei Verwendung keimfreier Liverpool Hooded Ratten die Etablierung einer oralen Candidiasis so effizient gelingt wie nach Tetrazyklingabe . Spätere Untersuchungen mit Sprague Dawley und Inzucht-Ratten (Fischer 344 Albino) zeigten, daß dieses Modell für Untersuchungen der oralen Candidiasis geeignet ist, obwohl bei beiden Tierspezies die Monoinfektion mit C. albicans innerhalb einiger Wochen abklang.

Da die Hyposalivation beim Menschen zu einer höheren Prävalenz einer oralen Candidiasis führt, wurden Tiermodelle zur Simulation einer humanen Xerostomie eingesetzt. Hierzu dienten Pharmaka bzw. die chirurgische Entfernung der Speicheldrüsen. In einer der ersten Studien zur Pathogenese der oralen Candidiasis im Tiermodell wurde Butylscopolaminiumbromid zur Induktion einer Xerostomie verabreicht. Man vermutete, auf diese Weise die Entstehung einer oralen Candidiasis bei Wistar Ratten unterstützen zu können . Es zeigte sich jedoch, daß Butylscopolaminiumbromid keinen entscheidenden Einfluß auf die Inzidenz einer Candidiasis im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen hatte. Neuere Studien, in denen die großen Speicheldrüsen der Ratten entfernt oder Ligaturen angelegt wurden, zeigten dagegen ein gehäuftes Auftreten von klinischen Veränderungen (Verlust der lingualen Papillen) bei Tieren mit Xerostomie im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen . Nach Inokulation mit C. albicans konnte der Keim bei Tieren nach Sialadenektomie im Vergleich zu normalen Kontrollen über einen signifikant längeren Zeitraum in der Mundhöhle nachgewiesen werden . Nach Inokulation verschiedener Candida spp. bei sialadenektomierten Ratten wurde eine Kolonisation von C. albicans über einen Zeitraum von bis zu 30 Tagen nachgewiesen. C. guilliermondii und C. krusei hingegen konnten nach dem fünften Tag nicht mehr isoliert werden . In diesen Untersuchungen wurde nicht erfaßt, ob es neben einer Kolonisation auch zu klinischen Veränderungen der Mukosa kam.

Unter der Annahme, daß eine traumatisch geschädigte orale Mukosa empfänglicher für eine Infektion mit Candida spp. ist, wurde diese Hypothese am Rattenmodell untersucht . Histologisch konnte nachgewiesen werden, daß es im Bereich der


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Zunge, die vor Inokulation einem Hitzetrauma ausgesetzt war, im Vergleich zu normalen Kontrollen sowohl zu einer schnelleren Hypheninvasion als auch zu einer größeren Anzahl von invadierenden Hyphen kam.

1.7.5 Studien zur antimykotischen Chemotherapie

Tierexperimentelle Untersuchungen der oralen Candidiasis sind für die Evaluation der Wirksamkeit von Antimykotika unabdingbar. Diese Studien wurden mit Hilfe des Kunststoffplatten-Tiermodells und des Glossitis-rhombica-mediana-Modells durchgeführt . Bei letzterer Untersuchung wurden die durch C. albicans induzierten chronischen Zungenläsionen mit einer systemischen Gabe von Ketoconazol behandelt. Innerhalb weniger Tage verschwanden die Läsionen, wobei das atrophierte Zungenepithel regenerierte und sich normale Zungenpapillen ausbildeten. Für weitere Untersuchungen wurde das Zystenmodell herangezogen . Es zeigte sich, daß Amphotericin B in hoher Dosierung, Fluconazol in geringerer Dosierung und Flucytosin mit einer geringeren Halbwertzeit effektiv gegen diese artifizielle Form einer pseudomembranösen Candidiasis ist . Anhand des Zystenmodells konnte ebenfalls gezeigt werden, daß eine Kombination von Flucytosin und Amphotericin B wirksam ist gegen Flucytosin-resistente C. albicans Stämme, ebenso wurde eine signifikante Reduktion Flucytosin-resistenter Candida-Mutanten nach Behandlung mit dieser Kombination beobachtet . In weiteren Untersuchungen an immunsupprimierten Mäusen mit systemischer und lokalisierter oraler Candidiasis wurde gezeigt, daß liposomal verkapseltes Amphotericin B eine weitaus geringere antimykotische Aktivität aufweist als konventionelles Amphotericin B . Die Wirksamkeit von ER-30346, einem oralen Triazol, wurde am Rattenmodell untersucht. Es zeigte sich anhand der Abstrichmethode, daß ER 30346 die Zahl der mikrobiologisch nachweisbaren CFU/ml in der Mundhöhle reduzierte. Itraconazol war bei diesem Versuch weniger wirksam, Fluconazol ebenso wirksam wie ER-30346 .

Durch den vermehrten Einsatz von Azolen stellt die Resistenzbildung ein zunehmendes Problem dar. Es zeigte sich, daß verschiedene C. albicans Stämme, die aus dem Oropharynx isoliert wurden, nicht mehr auf Azole ansprachen . Dieser Effekt machte in den letzten Jahren die Entwicklung neuer Antimykotika notwendig, deren Effizienz am Maus-, Ratten- oder Kaninchenmodell untersucht wird .

1.8 Die Rolle der Adhärenz im Pathogenitätsprozeß

Voraussetzung für eine Infektion ist die Adhärenz des Mikroorganismus an Gewebe oder einzelne Zellen , sie gilt als initialer Abschnitt auf dem Weg zur Infektion . Eine Vielzahl von Untersuchungen zeigt, daß


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die Adhärenzfähigkeit eines Keims zu dessen Virulenzfaktoren zählt. Zusammenfassend ergeben sich hieraus nachstehende Schlußfolgerungen

  1. Die Pathogenität/Infektiosität verschiedener Candida spp. ist assoziiert mit deren Adhärenzfähigkeit. So adhärieren C. albicans und C. tropicalis stärker als die sog. apathogenen Spezies C. krusei, C. kefyr und C. guillermondi . Entscheidend bei der Adhärenz dieser Keime ist weiterhin deren Lokalisation im Gewebe . C. tropicalis z. B. persistiert selten, ist jedoch nach Invasion ebenso pathogen wie C. albicans.
  2. Spezies und Stämme mit geringer Adhärenzfähigkeit sind sowohl im Tiermodell als auch in vitro weniger virulent .
  3. Diese Beobachtungen konnten anhand von Spontanmutationen bzw. durch selektives Herauszüchten wenig adhärenter Stämmen bestätigt werden .
  4. Stämme, die aus klinisch manifesten Infektionen isoliert werden, adhärieren besser als Stämme, die als Kommensalen vorliegen .
  5. Ist man bei Studien zur C. albicans-Adhärenz zunächst von einem ubiquitären Adhäsin ausgegangen, das sich mit einem spezifischen Rezeptor verbindet , lassen aktuellere Untersuchungen darauf schließen, daß es sich sowohl bei dem Adhäsin um verschiedene Strukturen auf der Zellmembran des Mikroorganismus als auch um verschiedene humane Rezeptoren handelt . Ein wichtiger Mechanismus einer Adhäsion ist die Oligosaccharid-Lektin-Interaktion. Dabei binden Lektine der Pathogenoberfläche spezifisch an den Oligosaccharidanteil von Glykokonjugaten der Epithelzellen. Unter dem Begriff Lektin werden Oligosaccharid-bindende Proteine nicht-immunologischer Herkunft zusammengefaßt, die spezifische Bindungseigenschaften für Kohlenhydrate aufweisen und nach erfolgter Bindung keine enzymatische Aktivität entwickeln . Diese Bindung findet nur dann statt, wenn geeignete Oligosaccharide auf der Oberfläche der Mukosazellen exprimiert werden.

Die molekularen Mechanismen der Adhärenz lassen sich als sequentielle Verbindung mehrerer Faktoren auffassen, die in zwei Phasen abläuft :

Zunächst erfolgt eine erste schwache und potentiell reversible Phase, bei der hauptsächlich hydrophobe Wechselwirkungen („fibrillar layer“) und monovalente und daher niedrig-affine Lektin-Interaktionen eine Rolle spielen. Der Wechsel der Oberflächenladung von hydrophil nach hydrophob vollzieht sich, ausgelöst durch multiple externe


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Stimuli unter anderem während der Ausbildung der Keimschläuche, d.h. der Initiation des pseudomyzelären Wachstums des Erregers . In der Folge findet eine dynamische Umstrukturierung der Candida-Oberfläche statt, wobei hier die sekretorische Protease beteiligt ist. Diese Umstrukturierung führt zur Demaskierung zusätzlicher adhäsiver Moleküle, die eine hohe Spezifität zur Zielzelle besitzen, wodurch letztlich der hochaffine Kontakt zwischen C. albicans und der Wirtszelle ermöglicht wird. Bei diesem zweiten Schritt spielen neben mutivalenten Lektininteraktionen auch Peptid-Peptid-Interaktionen eine wesentliche Rolle . Hieraus wird ersichtlich, daß Vorgänge, die das Gleichgewicht zwischen Kommensalismus und Infektion beeinflussen, erst nach Adhäsion erfolgen.

Als zusätzliche Adhäsine wirken Faktoren wie die kontaktinduzierte Expression von Antigenen nach oder während der Adhärenz, welche einen Thigmotropismuseffekt vermitteln oder Signalkaskaden initiieren ; weiterhin ein durch Kontakt gesetzter Stimulus zur Ausbildung von Keimschläuchen und die Sekretion zytolytischer Stoffwechselprodukte . Gleichzeitig kann es sich bei den Oberflächenmolekülen des Keims, die der Adhärenz an den Wirt dienen, um Rezeptoren der zellulären Immunabwehr handeln. Besonders die Mannoproteine der Candidaoberfläche sind Zielproteine der zellvermittelten Immunabwehr .

1.8.1 Die Adhärenz beeinflussende Faktoren

Die Variabilität von C. albicans führte zu der Annahme, daß verschiedenen morphologischen Formen unterschiedliche pathogene Relevanz zukommt. So wurde z.B. der Nachweis der Hyphenform in klinischen Isolaten als Indikator für eine Infektion gedeutet und die Hefeform als die typische Struktur des Kommensalismus angesehen .

Die Untersuchungsergebnisse von Studien zum Einfluß verschiedener morphologischer Formen von C. albicans auf die Adhärenz sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Aus diesen Studien geht hervor, daß die Fähigkeit zur Ausbildung von Keimschläuchen die Adhärenz erhöht. Durch kompetitive Versuche an Zellen mit und ohne Keimschlauchbildung konnte ein selektives Attachment der gekeimten Formen nachgewiesen werden. Mit einer partiellen Inhibition der Keimung wurde dementsprechend eine geringere Adhärenz erreicht . Diese Korrelation scheint jedoch nur bei niedrigen Zellzahlen pro Milliliter eine Rolle zu spielen, bei höheren Zellzahlen (ab ca. 108) ist die Adhärenz von Zellen mit und ohne Keimschlauchbildung vergleichbar. Ursache hierfür scheint die gesteigerte Koadhäsion der Zellen zu sein .


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Tab. 3: Untersuchungen zum Einfluß morphologischer Varianten von C. albicans auf die Adhärenz

Untersuchungsergebnisse

Referenz

Candida adhäriert eher an humane Epithelzellen unter Bedingungen, die eine Keimschlauchbildung ermöglichen.

Kimura et al. 1978

Der Prozentsatz der adhärierten Keime liegt bei gekeimten Zellen höher als bei ungekeimten Formen.

Sandin et al. 1982

Candida-Zellen, die Keimschläuche entwickeln, adhärieren besser.

Antley et al. 1988

Bei Raumtemperatur inkubierte Candida-Zellen bilden eher Keimschläuche aus und adhärieren besser.

Antley et al. 1988

Nur 40 % der Blastosporen adhärieren an speichelüberzogenen Flächen, Keimschläuche adhärieren vollständig.

Vasilas et al. 1992

Die Adhärenz ist schwächer bei Blastosporen, die keine Keimschläuche ausbilden.

Casanova et al. 1989

Keimung der Candida-Zellen steigerte die Adhärenz um 34 % gegenüber Zellen ohne Keimschlauchbildung.

Rotrosen et al. 1985

Keimschlauch-bildende Zellen adhärieren besser als Hefezellen.

Kimura et al. 1980

Die Hyphenform adhäriert am stärksten, gefolgt von Keimschläuchen und Hefeformen.

Anderson et al. 1985

Die Candida Variante, die in der Lage war Hyphen auszubilden, adhäriert besser an vaginale Epithelzellen.

Sobel et al. 1981

Die Myzelform vermittelt verstärkte Adhäsion.

De Bernardis et al. 1994

Untersuchungen von Kimura et al. konnten zeigen, daß die Anzahl adhäsionsfähiger Zellen mit der Anzahl gekeimter Zellen ansteigt , doch scheint darüber hinaus auch die Temperatur von Bedeutung. Keime, die bei 25°C inkubiert wurden, zeigten durch Zugabe von Cystein, welches die Keimschlauchbildung verhindert, einen höheren Adhärenzverlust als Keime, die bei 37°C gezüchtet wurden.

Trotz der Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen Morphologie und Adhärenzverhalten fehlen bislang eindeutige Untersuchungsergebnisse. So könnten auch verschiedene Adhäsine, d.h. rezeptorähnliche Strukturen auf der Keimoberfläche mit denen das Pathogen spezifisch an den Wirt bindet, das Adhärenzverhalten beeinflussen . Für die unterschiedliche Adhärenzfähigkeit der jeweiligen morphologischen Form könnten auch qualitative Unterschiede im Adhäsinaufbau sowie die Expression keimschlauchspezifischer Adhäsine infrage kommen .


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1.8.2 Die Hemmung der Adhärenz durch Muzin

Wie oben erwähnt, basiert ein molekularer Mechanismus der Adhärenz von C. albicans auf einer Oligosaccharid-Lektin-Interaktion , deren Spezifität als Lactosylceramid (Gal ß1-4Glc ß 1-1Cer) oder terminale Fucalpha1-2Gal ß-Reste beschrieben wurde. Diese Bindung findet jedoch nur dann statt, wenn geeignete Oligosaccharide auf der Oberfläche der Mukosazellen exprimiert werden.

Schon vor 20 Jahren konnte am Beispiel einer durch E. coli induzierten Cystitis der Maus gezeigt werden, daß lösliche Lektin-Rezeptoren (Glykokonjugate) spezifisch die Adhäsion und damit die Infektion inhibieren konnten . Bekannt ist weiterhin, daß der Speichel eine inhibitorische Aktivität auf die Adhäsion von C. albicans aufweist . Obwohl die spezifischen Komponenten des Speichels, welche die Adhäsion von C. albicans vermitteln, noch nicht bekannt sind , wurde nachgewiesen, daß hoch- und niedrigmolekulare Muzine als Rezeptoren am Adhärenzprozeß beteiligt sind . Muzine sind Glykoproteine, die im Speichel in flüssiger Phase vorliegen, aber auch als feste Phase die Oberflächen benetzen können und nach Anlagerung weiterer Speichelbestandteile das sogenannte Pellicle bilden.

Die Muzine unterscheiden sich in ihrer adhäsionsvermittelnden Struktur. Das hochmolekulare (über 103 kD) enthält höhere Anteile an O-glykosidisch gebundenen Oligosacchariden als das niedrigmolekulare (200-250 kD). Das niedrigmolekulare Muzin enthält zusätzlich einige N-glykosidisch verknüpfte Glykoproteine . Beide Muzine sind an der Interaktion mit Keimen beteiligt. Diese Reaktionen können an festen Oberflächen oder in der Flüssigphase des Speichels stattfinden. Die Anhaftung der Keime an muzinbenetzte Oberflächen führt meist zur Kolonisation der Oberflächen, die Adhäsion an die Flüssigphase zur Desorption aus dem Organismus. Zusammenfassend können Muzine also als ein Regulativ der Adhärenz angesehen werden, welches von der immunvermittelten Abwehr unabhängig ist.

1.9 Fragestellung und Zielsetzung

Aus der Literaturübersicht wird deutlich, daß

1. in Tiermodellen zur oralen Candidiasis verwendete C. albicans Stämme überwiegend nicht frei verfügbar, die Aufbereitungsmethoden der Mikroorganismen heterogen und somit die Ergebnisse nicht eindeutig reproduzierbar waren. Zur Gewährleistung der Reliabilität der Versuche ist daher für ein weiteres Candidiasismodell die Verwendung eines international verfügbaren Stammes sowie die Standardisierung der Keimaufbereitung im Labor erforderlich. Eine Empfehlung der Festlegung von


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Parametern wie Inkubationstemperatur und -dauer wäre Grundlage für die Vergleichbarkeit von Forschungsergebnisse mit C. albicans.

2. die Bedeutung der Keimmenge für die Wahrscheinlichkeit einer oralen Candidiasis in Abhängigkeit vom Immunstatus nach wie vor nicht geklärt ist. Keine Form der Candidiasis ist mit Keimzahlen in Rachenspülungen bzw. Abstrichen korreliert. Lediglich die Besiedlung der Mundhöhle und der Wirt als Keimträger kann hierdurch nachgewiesen werden. Bei einem fakultativ pathogenen Erreger wie C. albicans ist es - trotz spezifischer phänotypischer Charakteristika des Keims - schließlich abhängig von der Suszeptibilität des Wirtes, ob eine Kolonisation, Infektion oder Infektionserkrankung mit klinischer Symptomatik entsteht.

3. die derzeitige antimikrobielle Therapie einer oropharyngealen Candidiasis primär auf einer fungiziden oder fungistatischen Wirkung der verwendeten Substanzen beruht, wobei die Behandlung vorrangig mit der systemischen Gabe des Azolderivates Fluconazol erfolgt. Ein alternativer Therapieansatz wäre, die der Infektion vorangehende Adhäsion der Erreger zu blockieren. In Analogie zu den Ergebnissen bei E. coli Infektionen des Urogenitaltrakts könnte die Applikation von Muzin (oder dessen Spaltprodukten) bei oraler Candidiasis einen protektiven bzw. therapeutischen Effekt haben.

4. eine Adhäsion von Mikroorganismen an lösliches Muzin zu einer Desorption aus dem Organismus führt. Eine spezifische Bindung von C. albicans an Muzin und mögliche Unterschiede in der Bindungskapazität verschiedener Stämme wurde bisher nicht untersucht.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es anhand eines Candidiasismodells bei immundefizienten und immunkompetenten Mäusen folgende Fragen zu klären:

1. Gibt es eine Abhängigkeit zwischen inokulierter Keimmenge und der Entstehung einer C. albicans -Infektion (Dosis-Wirkungsbeziehung). Läßt sich ein Unterschied bezüglich der für eine Infektion notwendigen minimalen Infektionsdosis zwischen immundefizienten und immunkompetenten Tieren zeigen.

2. Welche zelluläre Immunantwort findet in der oralen Mukosa als Reaktion auf eine Inokulation mit definierten Keimmengen statt.


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Hierzu sollen insbesondere die bei einer Candida-Infektion relevanten Funktionen immunkompetenter Zellen charakterisiert sowie deren Anzahl bei immunkompetenten und immundefizienten Mäusen untersucht werden. Weiterhin soll die Reaktion des subepithelialen Endothels auf die Adhärenz von C. albicans dargestellt werden.

3. Ist durch Inhibition der Adhärenz von C. albicans an murine Epithelzellen mittels gleichzeitiger lokaler Applikation von Muzinen bzw. dessen Spaltprodukten auf die intakte orale Wirtsschleimhaut eine protektive Wirkung auf die Ausprägung der Infektion möglich. In vitro Untersuchungen sollten vorab zeigen, ob eine Standardisierung temperaturabhängiger Prozesse im Labor notwendig ist, um eine bessere Reproduzierbarkeit von Studien mit C. albicans zu gewährleisten. Weiterhin sollte gezeigt werden, ob unter standardisierten Bedingungen verschiedene C. albicans Stämme unterschiedliche spezifische Bindungen an Muzin aufweisen.

Aus den Ergebnissen dieser Arbeiten werden Informationen über die mögliche Existenz einer unterschiedlichen Infektionsschwelle als auch ein neuer pathobiochemischer Ansatz im Sinne einer Adhärenzinhibition überprüft. Aus Unterschieden in der lokalen Reaktivität bei einer unterschiedlichen Infektionsschwelle könnten Rückschlüsse auf Veränderungen der lokalen Immunmechanismen gezogen werden.

Die Untersuchungen wurden unterstützt von der Universitären Forschungsförderung der Charité (Projekt-Nr. 98-176) und der Deutschen Gesellschaft für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde (DGZMK). Die Firma Medac stellte das Muzinprodukt (Saliva medac©) bereit.


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Thu May 3 14:26:08 2001