Schmidt-Westhausen, Andrea Maria: Experimentelle Untersuchungen zur Pathogenese und Therapie der oralen Candidiasis bei Immundefizienz

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Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Vorversuch: Bestimmung von Oligosaccharid-Lektin-vermittelten Adhäsionsmechanismen an acht verschiedenen C. albicans Stämmen

In folgendem wird eine Untersuchung zusammenfassend dargestellt, die in Zusammenarbeit mit dem Institut für Laboratoriumsmedizin und Pathobiochemie (Charité) durchgeführt wurde. Zunächst sollte die spezifische Bindung acht verschiedener C. albicans Stämme an Muzin und dessen enzymatischen Aufspaltungprodukte, den Glykopeptiden, untersucht werden. Gleichzeitig sollte festgestellt werden, ob Laborparameter wie Inkubationstemperatur und die Inkubationsdauer einen Einfluß auf die Expression von Muzinrezeptoren haben, um diese für den nachfolgenden Tierversuch standardisiert anwenden zu können.

Die Untersuchung der spezifischen Bindungskapazität wurde bei vorheriger Thermoinkubation der C. albicans-Zellen in einem Temperaturintervall von 23 bis 39°C vorgenommen. Dabei sollen Temperatur/Zeitkinetiken aufgestellt und bei verschiedenen C. albicans Stämmen vergleichend untersucht werden.

Tab. 4: Untersuchte C. albicans Stämme

Stammbezeichnung

Entnahmeort

DSM 1386 (ATCC 10231)

Bronchomykose

DSM 1577

Keine Angabe

DSM 1665 (ATCC 2091)

Keine Angabe

DSM 3454 (ATCC 32032)

Vagina

DSM 5817 (ATCC 10259)

Onychomykose

DSM 6569 (ATCC 14053)

Blut

DSM 6659

Keine Angabe

DSM 70014

Sputum

Die in Klammern hinter den Stammbezeichnungen der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM, Braunschweig) aufgeführten Nummern kennzeichnen die Hinterlegung bei der American Type Culture Collection; ATCC, Rockville, USA.

Es wurden acht C. albicans Stämme aus der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) ausgewählt und die mögliche Veränderung der Adhärenz durch lösliche Muzine und deren durch enzymatische Hydrolyse gewonnenen Spaltprodukte (Glykopeptide), untersucht (Tab. 4).


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Die Oberfläche der Zellen wurde dafür mit Biotin markiert und diese später auf muzinbeschichteten Mikrotiterplatten mit oder ohne der Zugabe von löslichem Muzin inkubiert.

2.1.2 Verwendetes Muzin

Das verwendete Muzin ist unter dem Namen Saliva medac® kommerziell verfügbar.

1ml enthält als arzneilich wirksamen Bestandteil 35mg Muzin aus dem Magen des Schweins, sonstige Bestandteile sind Methyl-4-hydroxybenzoat 1mg, Benzalkoniumchlorid, Natrium-EDTA, Wasserstoffperoxid, Xylitol, Pfefferminzöl und gereinigtes Wasser. Vor dem Einsatz werden die niedermolekularen Bestandteile durch Ultrafiltration entfernt, die Ausschlußgröße betrug 10 kD.

Die spezifische Bindung wurde aus der Differenz der Extinktionen beider Gruppen ermittelt. Die Färbung wurde mit Strepavidin-Peroxidase und Tetramethylbenzidine vorgenommen.

2.1.3 Herstellung der Glykopeptide aus Muzin

2g Muzin wurden in 100 ml Trispuffer gelöst und dreimal mit diesem Puffer über eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Ausschlußgröße von 10 kD gewaschen. 20mg Proteinase K (Boehringer, Mannheim) wurde dem Muzin zugegeben, die Inkubation fand bei 4°C über Nacht statt. Zur Abtrennung der Glykopeptide von der Protease sowie dem nicht hydrolysierten Muzin wurde dieses Gemisch erneut über eine 10 kD Membran ultrafiltriert. Das Volumen wurde mit Trispuffer auf die Ausgangsmenge aufgefüllt und im Kühlschrank bei 4°C gelagert.

Die Ergebnisse des Vorversuchs zeigten, daß eine spezifische Bindung an Muzin für alle untersuchten Stämme vorliegt. Die mittlere relative spezifische Bindung lag bei 38 % der gemessenen Gesamtbindung, alle acht untersuchten Stämme zeigten jedoch zusätzlich eine individuelle Bindungsfähigkeit (34-42 %). Diese Bindung ist temperaturabhängig, mit Maxima in höheren Temperaturbereichen. Für alle Stämme setzte die Temperatur einen Stimulus zur Ausbildung von Adhäsinen unabhängig von der Makromorphologie des Keims. Die Antwort auf den Temperaturreiz war zeitabhängig. Die Ausbildung der Adhäsine nach Thermoinkubation zeigte eine zweigipfelige Verteilung, deren Maxima bei 20 und 40 Minuten lagen.

Glykopeptide wiesen im Vergleich zu Muzin eine höhere spezifische Bindung an C. albicans (DSM 5817) auf, was anhand einer Kurve, die die Verdünnungsschritte in


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bezug auf den Median der relativen spezifischen Bindung (RSB) darstellt, gezeigt werden konnte (Abb. 1). Die Ausgangskonzentration von Muzin betrug dabei 35 mg/ml, die der Glykopeptidlösung 20 mg/ml.

Abb. 1: Spezifische Muzin- und Glykopeptidbindung an C. albicans (Stamm: DSM 5817)

Der Wert 0 auf der Abszisse zeigt an, daß lösliches Muzin in der Ausgangskonzentration vorlag, die in den Versuchen eingesetzt wurden. Pro Schritt wurde im Verhältnis 1:2 verdünnt.

2.2 Tierexperimentelle Untersuchungen

2.2.1 Tierversuchsgenehmigung

Die folgenden Tierversuche wurden entsprechend dem Tierschutzgesetz (Fassung vom 17.2.1993) vorgenommen, durch den Tierschutzbeauftragten der Charité genehmigt und über die Senatsverwaltung für Gesundheit unter dem Zeichen 0342/97 vom 6.11.97 bewilligt.


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2.2.2 Versuchstiere und Versuchstierhaltung

Für die Versuchsreihen wurden folgende Mäusestämme verwendet

1. männliche, homozygote Inzuchtmäuse (Balb/cAnCCrlBR) Haplotyp: H-2d , Farbe: Albino (n=27)

2. männliche SCID Mäuse (severe combined immunodeficiency) (n=30).

Diese Tiere zeichnen sich durch einen schweren kombinierten B- und T-Zelldefekt aus. Sie sind homozygot für das SCID-Gen (C. B-17/Icr scid/scid) sowie coisogen mit dem normalen C. B-17/Icr +/+ Stamm. Die Zucht dieses Stammes erfolgt im Isolator.

Beide Stämme wurden von der Firma Charles River, Deutschland, bezogen. Ihr Alter betrug zum Zeitpunkt der Lieferung 6 - 8 Wochen bei einem Gewicht von 18-20 g.

Die Tiere wurden ab dem Zeitpunkt der Lieferung in Gruppen von jeweils 3 Tieren in einem Standardkäfig Typ 2 (Kunststoffwanne mit Drahtdeckel, Grundfläche 350 cm2) gehalten. Die Fütterung erfolgte in Form von Alleinfutter in pelletierter Form bestehend aus 7-12 % Rohprotein, 2 % Rohfett, 6-8 % Rohfaser und 5-8 % Rohasche.

Die Futter- und Wasseraufnahme erfolgte ad libitum.

Die Einstreu der Tiere (Weichholzgranulat und Holzwolle, staubfrei, autoklavierbar) wurde einmal wöchentlich, die Tränkflaschen wurden dreimal wöchentlich erneuert. Käfige und Trinkflaschen wurden mit einem Spülmittel gereinigt, desinfiziert (Inzidin extra© N) und anschließend autoklaviert.

Der Tag und Nachtrhythmus betrug je 12 Stunden.

Vor Beginn der experimentellen Untersuchungen erfolgte zunächst eine 7tägige Akklimatisierungsphase.

Die Haltung der SCID Mäuse

Aufgrund der hochgradigen Immundefizienz wurden die Käfige der SCID Mäuse in einem Isolator untergebracht, die Umweltbedingungen waren bei einer Temperatur von 20°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 65 % konstant.

Die Tiere erhielten Futter und Wasser in sterilisierter Form, ebenso war die Sterilisation von Einstreu und Käfigkomponenten gewährleistet.

Das Wasser der Versuchstiere wurde vom 1. - 7. Tag mit 0,1 % Tetracyclinhydrochlorid, vom 8. - 14. Tag mit 0,01 % Lösung versetzt.


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2.2.3 Verwendeter C. albicans Stamm

Der Stamm (Stammbezeichnung DSM 3454, Herkunft: Vagina) wurde als gefriergetrocknete Kultur von der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) bezogen. Bei der American Type Culture Collection, Rockville, USA ist ein identischer Stamm unter der Bezeichnung ATCC 32032 hinterlegt. Innerhalb kurzer Zeit nach Erhalt der Stämme von der DSM wurde eine Stammsuspension mit definierter Zellzahl angelegt, sofort schockgefroren und tiefgekühlt gelagert.

Der Stamm wurde nach Empfehlung des Herstellers auf Agarplatten (Sabouraud-Glukose Agar mit Zusatz von 5mg Penicillin/Streptomycin/500ml Agarmedium) übernommen, vier Tage bei Raumtemperatur inkubiert und bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert. Spätestens alle vier Wochen wurde der Stamm überimpft, d.h. mit sterilen Schlaufen aufgenommen und auf frischen Agarplatten ausgestrichen.

Um von standardisierten Zellzahlen ausgehen zu können, wurden die Zellen unter sterilen Bedingungen in Flüssigmedium (RPMI 1640) aufgenommen und mit Hilfe eines automatischen Cytometer auf eine Zellzahl von ca. 1×106 bis 1x1010 pro ml - je nach benötigter Dosierung - eingestellt.

Der Stamm wurde danach ohne Flüssigmedium mit Flüssigstickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.

Durch Zugabe von frischem RPMI und Lagerung bei 4°C über einen Zeitraum von ca. einer halben Stunde wurden der Stamm jeweils direkt vor Beginn des Experiments aufgetaut.

Die jeweils benötigte Keimzahl wurde für die Inokulation der Tiere in sterilem PBS gelöst.

2.2.4 Versuchsplanung

Die Tierversuche lassen sich, thematisch gesehen, in zwei Abschnitte unterteilen:

Versuchsreihe A:

Basisversuch zur Bestimmung der minimalen Infektionsdosis

Versuchsreihe B:

Untersuchung zur Inhibition der Adhärenz von C. albicans an murine Epithelzellen mittels lokaler Applikation der in Versuchsreihe A ermittelten minimalen Infektionsdosis und Glykopeptiden.


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Versuchsreihe A diente zur Bestimmung der minimalen Infektionsdosis dar. Hierzu wurde ein dichothomes Verfahren verwendet. Es handelt sich bei dieser Methode um eine etablierte Vorgehensweise zur Ermittlung von Inokulationsdosen im Sinne einer Schrittoptimierung:

Jeweils eine Gruppe von 3 Balb/c Mäusen und eine Gruppe von 3 SCID Mäusen wurde mit einer definierten einmaligen Dosis von C. albicans inokuliert (Abb. 2). Begonnen wurde mit einer Inokulationsdosis von 106 C. albicans-Zellen/10µl, die den Tieren oral mittels Eppendorf-Pipette verabreicht wurde.

Abb. 2: Verfahren zur Bestimmung der minimalen Infektionsdosis

Bei der Inokulation der Substanzen bedurfte es keiner Sedierung der Versuchstiere, da diese die ihnen angebotene Substanz bereitwillig und vollständig aufnahmen.

Eine Woche post inoculationem wurden die Tiere mit einem Gemisch aus CO2/O2 getötet. Es folgte die Entnahme der Zunge.

Eine Hälfte der Zunge (Längsschnitt) wurde in 10 %, gepuffertem, wäßrigem Formalin fixiert. Die formalinfixierten Zungenhälften wurden in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und für die Paraffineinbettung in das Duplex-Gerät (Fa. Shandon, England) zur Paraffindurchtränkung eingebracht. Am darauffolgenden Tag wurden die Präparate ausgebettet, in Blöcke gegossen und am Schlittenmikrotom (Fa. Leitz,


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Deutschland) 5 µm dicke Serienschnitte in einem Abstand von 10-30 µm hergestellt. Anschließend erfolgte die Periodic-Acid-Schiff (PAS) -Färbung.

Die andere Hälfte wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -75°C bis zur weiteren Verarbeitung asserviert.

Die Serienschnitte (PAS-Methode) wurden pro Präparat nach folgenden Kriterien beurteilt: Eine Infektion lag dann vor, wenn mindestens ein Schnitt eine Candidastruktur im Stratum corneum der Papillae filiformes aufwies. Damit galt das Tier als positiv. Wurden 2/3 Mäusen, denen dieselbe Dosis verabreicht wurde, als positiv bewertet, so erfolgte eine Dosisreduktion um eine log Stufe und Inokulation bei wiederum 3 Mäusen, bis weniger als zwei Mäuse infiziert waren (Abb. 2). Diese „Schwelle“, d. h. die Keimmenge, die gerade noch in der Lage war, die Zunge von 2/3 Mäusen zu infizieren, wurde durch einen weiteren Inokulationsversuch mit derselben Keimmenge wiederholt. Wurde die Dosis bestätigt, diente diese als Grundlage für die Versuchsreihe B „Adhärenzinhibition durch Glykopeptide“.

Tabelle 5 zeigt die in Versuchsreihe A verwendete Anzahl von Tieren pro Inokulationsdosis

Tab. 5: Übersicht über die Anzahl der Versuchstiere, die für die Versuchsreihe A (Bestimmung der minimalen Infektionsdosis) verwendet wurden

Tierstamm

Keime/10 µl

Anzahl der Tiere

Balb/c

105

n=3

 

106

n=3

 

107

n=6

 

108

n=6

 

ohne (Kontrolle)

n=1

 

 

gesamt: n=19

SCID

104

n=2

 

105

n=6

 

106

n=3

 

107

n=6

 

ohne (Kontrolle)

n=4

 

 

gesamt: n=21


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Für Versuchsreihe B wurden 8 Balb/c Mäuse und 8 SCID Mäuse mit einer Suspension inokuliert, die aus der in Versuchsreihe A ermittelten Keimmenge und 10µl Glykopeptidlösung bestand. Eine SCID Maus wurde nur mit Glykopeptiden inokuliert.

2.3 Histologische Technik

2.3.1 Periodic-Acid-Schiff Reaktion (PAS)

Die Paraffinschnitte (5 µm) wurden wie folgt behandelt:

  1. Schnitte in Xylol entparaffinieren
  2. In absteigender Alkoholreihe (abs. Alkohol, 96 % Äthanol, 70 % Äthanol, Aqua dest.) wässern
  3. 5 min. in 0,5 % Perjodsäure vorbehandeln
  4. 1-2 min. in aqua dest. spülen
  5. 15 min. in Schiff´schem Reagenz einbringen
  6. dreimaliges Waschen in aqua dest.
  7. 3-5 min. Kernfärbung mit Hämalaun
  8. Bläuen der Kerne unter fließendem Leitungswasser
  9. Spülen in aqua dest.
  10. Schnitte durch eine aufsteigende Alkoholreihe (70 % Äthanol, 96 % Äthanol, abs. Alkohol, Xylol) entwässern und mit Eukitt© eindeckeln.

2.3.1.1 Lichtmikroskopische Auswertung

Die Auswertung der Serienschnitte erfolgte von einem Untersucher standardisiert an einem Labolux 12 Mikroskop bei 400facher Vergrößerung. Ließen sich in einem Schnitt PAS-positive Strukturen (Hyphen) nachweisen, wurde der Schnitt als positiv bewertet. Zusätzlich wurde das Vorhandensein eines subepithelialen Leukozyteninfiltrats in diesem Bereich dokumentiert.

Dieses wurde wie folgt semiquantitativ eingestuft:

keine Leukozyten

=

0

wenige Leukozyten

=

(+)

deutliches Infiltrat

=

+


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2.3.2 Kryostatschnitte

Für die Untersuchungen zur Bestimmung der Immunreaktion in Abhängigkeit von der Inokulationsdosis wurden von den in flüssigem Stickstoff schockgefrorenen Gewebeproben 5 - 7 µm dicke konsekutive Gefrierschnitte (Kryostat 1720 Leitz, Wetzlar, Deutschland), die auf fortlaufend numerierte Objektträger aufgebracht wurden, angefertigt. Nach einstündiger Lufttrocknung bei Raumtemperatur und 10 min. Fixierung in Azeton (Aceton ZA. Merck, Darmstadt, Deutschland) erfolgte die Lagerung bis zur Weiterverarbeitung in Kühltruhen bei 75°C.

2.3.3 Die Immunperoxidase-Methode Testprinzip

Die Aceton-fixierten Gefrierschnitte der zweiten Zungenhälfte wurden aufgetaut und getrocknet. Danach folgte die Immunperoxidase Reaktion.

Bei dem Immunperoxidase- Verfahren handelt es sich um ein immunhistochemisches Nachweisverfahren, dessen Prinzip auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion beruht, die durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht wird. Neben den Antikörpern selbst wird das Enzym Peroxidase, das mit Chromogenen ein Farbprodukt bildet, verwendet. Vier Methoden stehen hierbei zur Verfügung: 1. die direkte, 2. die indirekte, 3. Die Peroxidase-Antiperoxidase (PAP) und 4. Die (Strept-) Avidin-Biotin-Methode. Bei den vorliegenden Untersuchungen wurde die PAP-Methode sowie die Streptavidin-Biotin-Methode eingesetzt.

2.3.3.1 Peroxidase-Antiperoxidase (PAP) -Methode (Abb. 3)

Bei dieser Methode werden drei Reagenzien benötigt: Primärantikörper, Sekundärantikörper und der PAP-Komplex bestehend aus dem Enzym Peroxidase und einem Antikörper gegen Peroxidase. Der Primärantikörper ist spezifisch gegen das Antigen gerichtet. Der Sekundär- oder Brückenantikörper (link antibody) kann sowohl an den Primärantikörper als auch an den PAP-Komplex binden, da beide in derselben Tierspezies hergestellt wurden. Der Brückenantikörper wird im Überschuß zugefügt; dadurch bindet nur eine Hälfte seines Fab Fragments an den Primärantikörper, die andere Hälfte bleibt frei zur Bindung an den Antikörper des PAP-Komplexes. Das Enzym Peroxidase wird durch eine Substrat-Chromogenreaktion sichtbar gemacht.

2.3.3.2 (Strept-) Avidin-Biotin-Methode (Abb. 3)

Diese Methode basiert auf der Fähigkeit des Avidins, vier Moleküle des Vitamins Biotin physikalisch zu binden. Wie bei der PAP-Methode werden drei Reagenzien benötigt: 1. Primärantikörper 2. Sekundärantikörper konjugiert mit Biotin 3. Peroxida


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se konjugierter (Strept-) Avidin-Biotin-Komplex. Die freien Stellen des Avidinmoleküls ermöglichen die Bindung an das Biotin des Sekundärantikörpers. Das Enzym Per-oxidase - und damit das gesuchte Antigen - wird mit einem geeigneten Chromogen sichtbar gemacht.

Abb. 3: Prinzip der Peroxidase-Antiperoxidase- sowie der Avidin-Biotin-Methode (modifiziert nach einer Produktbeschreibung der Firma DAKO Diagnostika GmbH Hamburg, Deutschland)

2.3.3.3 Arbeitsablauf der Immunperoxidase-Technik

Die Kryostatschnitte (5-7 µm) wurden wie folgt behandelt:

Auftauen und Lufttrocknung der Präparate

 

20 min

Fixierung in Azeton

 

15 min

Präinkubation (Albumin oder Normalserum)

 

15 min

Abspülen mit PBS

 

 

Inkubation mit Primärantikörper

 

60 min

Waschen in PBS

3 x

5 min

Blockierung der endogenen Peroxidaseaktivität mit H2O2

 

10 min

Waschen in PBS

3 x

5 min

Inkubation mit Sekundär Antikörper

 

40 - 60 min

Waschen in PBS

3 x

05 min

Farbentwicklung mit AEC auf dem Schüttler

 

15 - 20 min

Reaktion in H2O stoppen

 

 

Gegenfärbung (Kernfärbung) mit saurem Hämalaun

 

2 min

Abspülen in H2O (Bläuen)

 

 

Wäßriges Eindeckeln mit Kaiser´s Glycerin-Gelatine

 

 


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2.3.3.4 Verwendete Antikörper

Primärantikörper

Für die immunhistochemischen Untersuchungen mit Hilfe der Immunperoxidase-Methode wurden gereinigte Antikörper gegen Maus-Zell-Oberflächenmoleküle eingesetzt (Hersteller: Pharmingen, Hamburg, Deutschland), die in Tabelle 6 dargestellt sind.

Es wurden Antikörper ausgewählt, die mit Differenzierungsantigenen reagieren,

  1. die auf Zellen exprimiert werden, die bei der Antigenverarbeitung von C. albicans eine Rolle spielen (antigenpräsentierende Zellen mit Expression von Klasse II MHC-Molekülen)
  2. deren Expression am Endothel durch Stimulation mittels inflammatorischer Mediatoren (Zytokine) hochreguliert wird.

Tab. 6: Primärantikörper und deren Spezifität sowie Arbeitshinweise zur Darstellung der Antigenverarbeitung von C. albicans

Spezifität

Clone

Arbeits-verdünnung

markierte Zellen und Moleküle

CD4

RM4-5

1:45

Helfer-T-Zellen

CD13

R3-242

1:50

Aminopeptidase N auf DZ, (BZ), Makrophagen

CD54 (ICAM-1)

3E2

1:200

akt. Endothel (ICAM-1), DZ, (akt.) Lymphozyten, Makrophagen

CD 62E

(E-Selectin, ELAM-1)

10E9.6

1:50

akt. Endothel (E-Selectin)

CD74

In-1

1:100

MHC-Klasse II-assoziierte invariante Kette (Ii) (involviert in intrazellulären Transport von MHC-Klasse II Molekülen und Antigenpräsentation)

CD80

16-10A1

1:90

(akt.) Makrophagen, DZ, (akt.) BZ

CD86 (B7-2)

GL1

1:50

(akt.) Makrophagen, DZ, (akt.) BZ

CD103 (Integrin alphaIEL chain)

2E7

1:200

CD8+-Zellen in Lamina propria


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Sekundärantikörper für CD 4, CD 13, CD 62E, CD 74, CD 86

Horseradish peroxidase (HRP) -conjugated goat anti-rat immunoglobulin-specific polyclonal antibody (multiple absorption) 1:110

(Fa. Pharmingen, Hamburg, Catalog Nr. 12117E)

Sekundärantikörper für CD 54, CD 80, CD 103

  1. Biotin-conjugated mouse anti-rat and hamster Ig, ? light chain 1:200
    (Fa. Pharmingen, Hamburg, Catalog Nr. 10132D) und
  2. Streptavidin-horseradish peroxidase (Sav-HRP) conjugate 1:600
    (Fa. Pharmingen, Hamburg, Catalog Nr. 13047E)

2.3.3.5 Testreihe zur Vermeidung unspezifischer Reaktionen bei der Immunperoxidase Technik beim Nachweis von Leukozytenantigenen

Um unspezifische Reaktionen (Schlierenbildung auf dem gesamten Präparat), die sich bei dem Einsatz von monoklonalen Antikörpers ergeben können, zu verhindern, wurden die Präparate einer Vorbehandlung unerzogen. Dazu erfolgte eine Präinkubation mit Hamster bzw. Ratte Normalserum (Fa. Dianova, Hamburg).

2.3.3.6 Kontrollen

Um unspezifische Reaktionen durch Wechselwirkungen des PAP-Komplexes oder Brückenantikörpers mit dem Gewebe auszuschließen, wurden bei jedem Reaktionsansatz Negativkontrollen mitgeführt. Hierzu wurden die Schnitte nur mit dem Brückenantikörper und dem PAP-Komplex inkubiert und ebenfalls die Wiederholungsreaktionen durchlaufen.

2.3.3.7 Lichtmikroskopische Auswertung

Die Auswertung der Präparate erfolgte standardisiert an einem Labolux 12 Mikroskop bei 400facher Vergrößerung.

Die Auszählung markierter Zellen innerhalb des Zungenrückenepithels und der Lamina propria erfolgte anhand eines Meßokulars (0,33 x 0,33 mm2). Der subepitheliale Bereich, der auf diese Weise ausgewertet werden konnte, betrug ca. 170 µm. Die Schnitte wurden so ausgewählt, daß 10 konsekutive Felder (3,3 x 3,3 mm2) in die Analyse eingingen, entsprechend einer Anzahl von ca. 840 Basalzellen. Präparate, die diesen Anforderungen nicht entsprachen, wurden nicht in die Auswertung einbezogen.


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Positive Reaktionen wurden von einem Untersucher semiquantitativ eingeteilt in:

-

=

keine positive Reaktion

(+)

=

1-2 positive Zellen

+

=

3-15 positive Zellen

++

=

16-50 positive Zellen

+++

=

> 50 positive Zellen

Die Aktivierung des Endothels wurde eingeteilt in:

-

=

keine Expression

+

=

geringe Expression

++

=

mittlere Expression

+++

=

starke Expression

Die Auswertung berücksichtigte sowohl die Menge der markierten Zellen als auch deren Verteilung innerhalb der Epithelstraten.

Die fotografische Dokumentation erfolgte mit Hilfe eines Orthoplan Photomikroskops auf Kodak-Ectachrome 64T Filmen.


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