Schmidt-Westhausen, Andrea Maria: Experimentelle Untersuchungen zur Pathogenese und Therapie der oralen Candidiasis bei Immundefizienz

82

Kapitel 4. Diskussion

4.1 Oligosaccharid-Lektin-vermittelte Adhäsionsmechanismen bei acht C. albicans Stämmen

Die Ergebnisse dieser Studie dienten aIs Grundlage für die Methode der C. albicans-Aufbereitung, um im nachfolgenden Tierversuch von standardisierten, reproduzierbaren Parametern ausgehen zu können. In der Untersuchung konnte eine spezifische Bindung an lösliches Muzin für alle untersuchten Stämme nachgewiesen werden. Dabei wurden die Rezeptoren zunächst nicht näher definiert, sondern nach rein funktionellen Kriterien die unterschiedliche Fähigkeit verschiedener Keime an diesen Rezeptor zu binden, beschrieben. Da Muzin ein heterogenes Oligoglykangerüst mit vielfachen Bindungsmöglichkeiten darstellt, kann diese Rezeptoreigenschaft auch von einer Gruppe von Rezeptoren innerhalb des Moleküls übernommen werden. Viele der chemischen Bestandteile der in der Einleitung beschriebenen Rezeptor-systeme finden sich auch im Muzin. Insbesondere das Adhäsin/Rezeptorsystem bei dem C. albicans über Lektine an Fucose oder N-Acetylglucosamin bindet, wird durch die nachgewiesene Bindung von C. albicans an Muzin bestätigt. Die Bindung an Muzin verläuft über ein universell verbreitetes Rezeptorsystem, das nicht auf bestimmte Lektintypen von C. albicans beschränkt ist. Durch den Einsatz von Muzin werden alle Adhäsinstrukturen, die bei der Adhärenz beteiligt sind und für die eine spezifische Bindung ermittelt werden kann ohne Differenzierung ihres Lektintyps erfaßt. Damit sind vergleichende Tests bezüglich der Wirkung des Muzins auf verschiedene C. albicans-Stämme möglich und nicht auf Stämme eines bestimmten Lektintyps beschränkt.

4.1.1 Höhe des Bindungspotentials

Die durchschnittliche spezifische Bindung aller Candida-Stämme im Bezug zur Gesamtbindungsfähigkeit von Candida an Muzin betrug 38 %. Klotz et al. zeigten, daß bei dem Einsatz einer 0,5 %-igen Muzinlösung eine Verdrängung bis zu 83 % erreicht werden konnte . In dieser Studie wurden zur Bestimmung der Adhärenz jedoch intestinale Zellen verwendet und die Verdrängung wurde nicht kompetitiv gemessen, sondern es fand zuvor eine Koinkubation der Keime mit Muzin statt. Die differierenden Ergebnisse scheinen demnach im Verfahren begründet.

Das Bindungspotential resultiert aus einem im Überschuß eingesetzten löslichen Muzin. Die Ergebnisse bestätigen, daß die Bindung an Muzin vom Verhältnis des immobilisierten Muzins zu löslichem Muzin abhängig sind, eine Verdrängung durch lösliches Muzin also nur durch ein Übermaß an löslichem Muzin zu erreichen ist. Möglicherweise werden bei einem größeren Verhältnis von Verdrängungsmuzin zu


83

Muzin mehr spezifische Rezeptoren besetzt, somit wäre eine ausgeprägtere Verdrängung als in dieser Studie nachgewiesen, möglich. Ein weiterer limitierender Faktor für die Verdrängung durch Muzin besteht in der Anzahl eingesetzter Keime.

4.1.2 Temperaturabhängigkeit

Die Ergebnisse zeigten eine Temperaturabhängkeit der spezifischen Bindung von C. albicans an Muzin, unabhängig vom ausgewählten Stamm. Somit scheint eine Membranumgestaltung oder Neusynthese, die mit der Änderung der Adhäsinexpression einhergeht, temperaturabhängig zu sein. Frühere Untersuchungen konnten ebenfalls zeigen, daß die Ausbildung von Adhäsinen durch die Wachstumsbedingungen der Zellen beeinflußt wird .

Die Ergebnisse zeigten, daß sich die Adhäsinexpression im untersuchten Temperaturintervall mit dem Anstieg der Temperatur erhöhte. Bei 25 und 27°C war die Expression am niedrigsten. Erst beim Erreichen höherer Temperaturen, die denjenigen Körperbereichen des Wirts entsprechen, an die sich der Mikroorganismus stammspezifisch anlagert, war eine deutliche Expression der Adhäsine vorhanden. C. albicans besiedelt selten Körperbereiche, deren Temperatur niedriger als 35°C beträgt. Selbst in Körperbereichen, die niedrigere Temperaturen aufweisen, wie z.B. Haut, werden intertriginöse Bereiche zu Kolonisation bevorzugt, da hier höhere Temperaturen vorliegen als im ungeschützten Hautbereich .

Für die Verarbeitung von C. albicans bedeutet diese Temperaturabhängigkeit, daß Versuchsaufbauten ohne Konstanthaltung der Temperatur nicht reproduzierbar sind. Odds et al. wiesen in ihren Untersuchungen darauf hin, daß bei der Entwicklung standardisierter Antimykotika-Suszeptibilitätstests experimentelle Variablen wie Temperatur einer Kontrolle unterliegen müssen . Aus vorliegenden Ergebnissen können Inkubationstemperaturen empfohlen werden, die bei 35°C lagen. Vom National Committee for Clinical and Laboratory Standards wird für Antimykotika-Suszeptibilitätstests ebenfalls eine Inkubationstemperatur von 35°C empfohlen .

4.1.3 Zeitabhängigkeit

Nicht der zeitliche Verlauf der Adhäsion, sondern der Einfluß der Inkubationsdauer sollte bei dem Versuchsaufbau berücksichtigt werden. Es sollte gezeigt werden, nach welcher Inkubationsdauer C. albicans auf einen Temperaturreiz mit der Ausbildung von Adhäsinen reagiert. Bei der Untersuchung der Stämme war für Stamm DSM 1577, 6569 und 6659 eine deutliche Zeitabhängigkeit erkennbar. Diese reagierten nach Temperaturreiz mit einem Anstieg der Adhäsinexpression, bei einem Maximum 40 Minuten und einem Abfall 60 Minuten nach Temperaturreiz. Die Adhäsinexpressi


84

on verlief dabei nicht linear ansteigend bis zum Zeitpunkt 40 Minuten, sondern zweigipfelig. Jeweils nach 20 Minuten erreichte die Expression ein Maximum, das niedriger ausfiel als bei 40 Minuten. Möglicherweise wird eine zweigipfelige Expression durch zwei unterschiedliche Modi bei der Adhäsinexpression hervorgerufen.

4.2 Tiermodell

In vorliegender Untersuchung wurde die Infektion mit C. albicans experimentell anhand eines Mausmodells dargestellt. Bisherige histopathologische Studien zeigten, daß das Mausmodell für die Darstellung der oralen Candidiasis beim Menschen geeignet ist .

Für Untersuchungen zu klinischen Veränderungen der oralen Candidiasis wurden Ratten wegen der größeren Mundhöhle und der besseren Zugänglichkeit bevorzugt . Da es sich bei vorliegender Untersuchung jedoch um eine histopathologische Studie handelte, konnte eine niedrigere Tierspezies gewählt werden. Ein weiterer Grund für die Wahl des Mausmodells war die Tatsache, daß C. albicans Bestandteil der physiologischen Mundflora der Ratte ist und daher für Untersuchungen zur Keimmenge und immunologischen Reaktionen weniger geeignet scheint .

Für immunologische Studien sind Mäuse als Versuchstiere hervorragend geeignet, da sie in einer Vielzahl an Inzuchtstämmen erhältlich sind, die bezüglich ihres Immunstatus genau charakterisiert sind.

Bei Balb/c Mäusen handelt es sich um Inzuchtmäuse, eine spezielle Züchtung, die in allen Loci homozygot ist. Die Individuen eines Stammes sind daher genetisch identisch.

Die homozygote scid/scid Inzuchtmaus, eine rezessive Mausmutation, zeichnet sich durch die fehlende Ausdifferenzierung von B- und T-Lymphozyten aus. Die Mutation im homozygoten Zustand hindert die Differenzierung von Lymphozyten aus Stammzellen durch einen Defekt der DNA-abhängigen Proteinkinase, die Tiere produzieren daher nur unbedeutende Mengen an Immunglobulinen oder T-Zell-Rezeptoren. Ihre lymphatischen Organe sind unterentwickelt, schwere Schädigung der B- und T-Lymphozytenfunktion, Lymphopenie sowie Hypoimmunglobulinämie sind die Folge . Dieses Mausmodell eines schweren kombinierten Immundefekts (SCID) bietet eine Möglichkeit, die Interaktion zwischen C. albicans und einem Wirt, dessen B- und T-Zell Funktionen unzureichend sind, zu untersuchen.

Untersuchungen zeigten, daß Antibiotika, darunter besonders Tetrazyklin, zur Unterstützung der Etablierung einer Candidiasis im Tiermodell geeignet sind . In einer Untersuchung von Jones et al. konnte dagegen nach


85

gewiesen werden, daß die Verwendung von gnotobiotischen, d.h. keimfrei zur Welt gebrachten und aufgezogenen Mäusestämmen bei der Etablierung einer Candidiasis ebenso effizient ist wie eine Vorbehandlung mit Tetrazyklin . Diese Methode ist jedoch teuer und technisch oft problematisch, des weiteren konnte gezeigt werden, daß die Monoinfektion mit C. albicans bei gnotobiotischen Tieren innerhalb weniger Wochen verschwand.

In vorliegender Arbeit wurden die Tiere eine Woche post inoculationem geopfert und die Zunge für die folgenden Untersuchungen entnommen. Eine Reihe von Forschergruppen haben den klinischen Verlauf der oralen Candidiasis primär anhand von Maus- und Rattenmodellen untersucht . Die genannten Studien kamen zu dem gemeinsamen Ergebnis, daß C. albicans schon in der Frühphase Gingiva, bukkale Mukosa und Zungenrücken infiziert. Der Zungenrücken scheint die Prädilektionsstelle für eine persistierende orale Candidiasis zu sein . Histopathologisch zeigen sich Veränderungen wie Hyperparakeratose, Akanthose, Abflachung des Epithels im dorsalen Bereich der Zunge und eine Entzündungsreaktion mit Mikroabszessen in den oberen Anteilen der Stachelzellschicht sowie ein mononukleäres Infiltrat im darunterliegenden Bindegewebe.

4.3 Auswahl des C. albicans Stammes

In vorliegender Untersuchung wurde ein Stamm der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) verwendet. Vorteil dieser Wahl eines DSM bzw. ATCC-Stammes ist, daß ein Vergleich mit Untersuchungsergebnissen anderer Studien möglich wird. Dieser Stamm wurde verwendet, da in der zuvor durchgeführten in vitro Untersuchung gezeigt werden konnte, daß er eine hohe Bindung an Muzin und O-Glykane aufweist.

Bei Durchsicht früherer Untersuchungen zu experimentell induzierter oraler Candidiasis wird deutlich, daß bei dem überwiegenden Teil eine Charakterisierung des verwendeten Stammes fehlt . Folge davon sind beträchtlich von einander abweichende Resultate innerhalb der selben Tierspezies bezüglich der Virulenz des Erregers und der mukosalen Reaktionen.

Eine Vielzahl von Untersuchern verwendete zur Inokulation der Tiere Candida Stämme aus Isolaten zufällig ausgewählter Patienten mit oraler Candidiasis , mit systemischer Candidiasis , in anderen Studien waren die Angaben über die Herkunft des Stammes nicht eindeutig bzw. es wurde ein Keim verwendet, der zwar durchgängig in allen Studien eingesetzt wurde, jedoch ausschließlich einer Arbeitsgruppe zur Verfügung stand


86

. Objektivierbare Ergebnisse, die die Verwendung definierter C. albicans Stämme voraussetzen, finden sich nur in kleiner Zahl .

4.3.1 Keimzahl

Da C. albicans nicht Teil der murinen oralen Flora ist , konnten die Tiere mit einer definierten und reproduzierbaren Anzahl von Keimen inokuliert werden.

Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, daß bei einmaliger Gabe von 108 C. albicans-Zellen innerhalb weniger Stunden eine Kolonisation der oralen murinen Mukosa stattfindet. Dabei konnten histologisch Blastosporen und Keimschläuche, doch keine penetrierenden Hyphen nachgewiesen werden. Vom 3. Tag nach Inokulation erfolgt eine Candida-Proliferation und Invasion in die Mukosa .

Angaben über die inokulierte Keimmenge schwanken aufgrund der Uneinheitlichkeit der verwendeten Methoden beträchtlich. So wurden in einigen Untersuchungen Tupfer in eine Candida-Suspension von 106 Zellen/ml getaucht und in die Mundhöhle des Tieres ausgestrichen, Daten zur tatsächlich eingebrachten Keimzahl existieren daher nicht . In Studien zur Besiedlung des Orogastrointestinaltrakts wurde dem Trinkwasser der Tiere 105 C. albicans-Zellen/ml zugesetzt, so daß die tatsächlich aufgenommene Keimmenge nur Schätzungen unterliegen kann .

Kritisch am Stand der bisherigen Untersuchungen ist zusammenzufassen, daß bislang unterschiedliche Techniken in bezug auf Inokulationsmethode (Keimbeimengung ins Trinkwasser vs. oraler Inokulation), Anzahl der Inokulationen, Verwendung modifizierender Komponenten (Antibiotika, Immunsuppressiva) und Einsatz unterschiedlicher Tierspezies und Stämme publiziert wurden. Eine Standardisierung der Methoden erfolgte bisher nicht, daher können die Ergebnisse der vielfältigen Studien nur mit Zurückhaltung verglichen werden.

4.4 Histologische Techniken

4.4.1 PAS-Technik

Die PAS-Färbung der C. albicans-Strukturen wurde gewählt, da mit dieser Methode kohlenhydrathaltige Komponenten (neutrale Glykoproteine, Glykoproteide, Glykogen) dargestellt werden können. Die Candida-Zellwand besteht aus beta-Glukanen, Mannoproteinen und Chitin, wobei die Hauptkomponente Kohlenhydrate (80-90 %) sind und alle morphologischen Formen von C. albicans ähnliche Zusammensetzungen aufweisen . Somit ist die PAS-Reaktion zur Sichtbarmachung von Blastosporen, Keimschläuchen und Hyphen etabliert.


87

4.4.2 Immunperoxidase-Methode

In vorliegender Untersuchung war die immunhistochemische Färbemethode mittels PAP-Methode an Azeton-fixierten Gefrierschnitten durch die käuflich erworbenen Konjugate vorgegeben. Die hier verwendete Biotin-Streptavidin-Methode zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität aus. Sie stellt eine Weiterentwicklung auf dem Sektor der Immunperoxidase-Färbungen dar und ist bis zu 1000fach empfindlicher als die Immunfluoreszenz. Die Verwendung monoklonaler Antikörper gewährleistet zudem spezifische Markierungen.

Die Kryostattechnik bietet einen guten Antigengehalt und erübrigt die vorhergehende Fixierung der Biopsien. Zu berücksichtigen ist bei der Methode, daß bei einer Dicke der Gewebeschnitte von 5-7 µm jeweils mehrere Zell-Lagen betrachtet werden, und es so zu Überlagerungen kommen kann.

4.5 Diskussion der Ergebnisse

4.5.1 Klinische Befunde

Keine der entnommenen Zungen wies bei 10facher Vergrößerung Veränderungen wie erythematöse, pseudomembranöse oder opake Veränderungen bzw. Abflachung der Papillen auf. Es liegt bislang keine Studie vor, die klinische Veränderungen der murinen Mukosa nach Inokulation mit C. albicans beschrieben hat, da in diesen Untersuchungen lediglich Ergebnisse histologischer Präparate ausgewertet wurden. Hingegen zeigten eine Reihe von Studien am Rattenmodell, daß klinische Veränderungen der Mundschleimhaut nach Inokulation mit Candida-Keimen auftreten, wie in Tabelle 15 dargestellt.

Diese Übersicht veranschaulicht die Heterogenität der verwendeten Stämme und Dosierungen bei der experimentellen Candidiasis am Rattenmodell.

Interessant ist, daß in der Mehrzahl der Untersuchungen die klinischen Veränderungen an der Rattenzunge denen der Glossitis rhombica mediana des Menschen ähneln, dennoch besteht keine Korrelation zwischen dem klinischen Befund, den die humanen Isolate auf der Rattenzunge hervorrufen und der klinischen Veränderung, der sie entnommen wurden .


88

Tab. 15: Literaturübersicht über klinische Befunde nach Inokulation von Ratten mit C. albicans. Zum besseren Vergleich der Studien wurden nur Tiere aufgeführt, die ohne weitere (Vor-) Behandlung mit dem angegebenen Stamm inokuliert wurden

Arbeitsgruppe

Tierspezies

C. alb. Stamm

Inok.-Menge

Läsionen

Allen et al. 1983

Sprague-Dawley-Ratten

Zufällig entnommen von

A. Prothesen-stomatitis

B. Ulcus

C. Ulcus

D. chronisch hyperplastische Candidiasis

5x106

1/w über 25 Wochen

A. keine

B. keine

C. bei 40% erythematöse Veränderung und Abflachung der Papillae Zungenmitte

D. keine

Allen et al. 1985

Sprague-Dawley-Ratten

„mucosa pathogen“

5x106

1/w über 20 Wochen

bei 80% erythematöse Läsionen Zunge

 

Allen et al. 1987

Sprague-Dawley-Ratten

16 Stämme aus drei Formen der oralen Candidiasis und einer Blutkultur

5x106

1/w über 16 Wochen

6 Isolate führten zu Veränderung und Abflachung der Papillae Zungenmitte

Dourov et al. 1987

Wistar-Ratten

C. albicans Stamm „4019“

1x106 1/w einmalige Gabe

Keine

Allen et al. 1988

Sprague-Dawley-Ratten

„mucosa pathogen“

5x106

3/w über 8 Wochen

bei 45% demarkierte Läsion, posteriore Zungenmitte

Allen et al. 1989

Sprague-Dawley-Ratten

„mucosa pathogen“

3x107 1/w

einmalige Gabe

bei 20% Atrophie der Papillae vallatae

Meitner et al. 1990

Sprague-Dawley-Ratten

isoliert aus oraler Candidiasis (Patient)

~ 5x106 1/w

einmalige Gabe

bei 100% kleine erhabene opake Bereiche an Gingiva und bukkaler Mukosa

Jorge et al. 1993

Wistar-Ratten

isoliert aus chronischer oraler Candidiasis (Patient)

3x108 3/w

32 Wochen

bei 10% Verlust der Papillen, Zungenrücken

O'Grady et al. 1993

Sprague-Dawley-Ratten

isoliert aus asymptomat. Keimträger

6x107 jeden 2. Tag über 11 Tage

keine

Allen et al. 1994

Sprague-Dawley-Ratten

A. „Stamm, der Läsionen bei Ratten induziert“

B. „Stamm, der keine Läsionen induziert“

1x107 jeden 2. Tag über 12 Tage

A. keine

B. bei 22% Papillenatrophie Zungenmitte


89

4.5.2 Histopathologie PAS

In vorliegender Untersuchung konnte gezeigt werden, daß nach einmaliger Gabe einer definierten Anzahl von C. albicans-Zellen/Inokulation bei immundefizienten SCID und immunkompetenten Balb/c Mäusen Hyphen in das Epithel einwandern.

Diese drangen nur bis in das Stratum corneum vor, das Stratum spinosum wurde in keinem Falle erreicht. Diese Beobachtungen bestätigen frühere Studien, die die Invasion bei immunkompetenten Mäusen ; Mäusen mit kombiniertem B- und T-Zelldefekt , iatrogen immunsupprimierten Mäusen mit Cyclosporin A (selektive Beeinträchtigung der T-Zell-vermittelten Immunität und NK-Zell-Aktivität) und Nude-Mäusen (ohne Thymus) untersuchten.

Einige der in Tabelle 15 dargestellten Untersuchungen kommen zu dem Ergebnis, daß lediglich bei Ratten mit klinisch sichtbaren Veränderungen der Zungenschleimhaut auch der histologische Nachweis einer Candida-Infektion erbracht werden konnte. Dieser war charakterisiert durch Invasion von Hyphen in das Stratum corneum, Abflachung der epithelialen Oberflächenmorphologie mit Parakeratose, Akanthose, Hyperplasie der Basalzellschicht, Formation von elongierten Reteleisten und verstärkter mitotischer Aktivität der Basalzellen . Im Gegensatz hierzu wurde bei den in vorliegender Untersuchung untersuchten Tieren (SCID und Balb/c Mäuse) keine Korrelation zwischen klinischen Veränderungen und Penetration von Candida-Hyphen festgestellt.

Es ist nicht auszuschließen, daß sich die bei Ratten beobachteten Befunde nicht auf das Mausmodell übertragen lassen, zumal bisher keine klinisch-histopathologischen Korrelate zu letzterem vorliegen. Andererseits könnte auch der Zeitpunkt der Organentnahme für die genannten Unterschiede maßgeblich sein, wenngleich zwei Untersuchungen am Rattenmodell zeigen konnten, daß nach einmaliger Inokulation und Opferung der Tiere nach einer Woche klinische Veränderungen der Zunge, Gingiva und bukkaler Mukosa auftraten .

Ein älteres Konzept zur Pathogenese der Candidiasis ging davon aus, daß die Transformation der Blastosporen in die Hyphenphase den Wechsel einer Besiedlung in eine Erkrankung anzeigt und daß die Penetration des Epithels durch Hyphen eine Wirtsantwort hervorruft . In weiteren Studien konnte dagegen gezeigt werden, daß auch eine Invasion von Candida-Hyphen in die oberste Epithelschicht ohne klinische Zeichen und mukosale Immunreaktion stattfinden kann. Diese Beobachtungen scheinen von dem verwendeten Isolat abzuhängen . Selbst Cyclosporin A-immunsupprimierte Ratten wiesen unter Verwendung eines „nicht-Läsionen-induzierenden“ Isolats lediglich Blastosporen und Hypheninvasion im un


90

veränderten Stratum corneum (Orthokeratose) auf, wobei eine inflammatorische Reaktion fehlte .

Neben dem Nachweis von Candidaelementen in der Keratinschicht der Zungenmukosa wurde in dieser Arbeit die Frage nach einer Assoziation zwischen Keiminvasion und einem reaktiven zellulären Infiltrat gestellt. Übereinstimmend mit o.g. Ergebnissen zeigte sich, daß nur in der Hälfte der Fälle, in denen eine Keiminvasion nachgewiesen werden konnte, Entzündungszellen vorhanden waren. Dabei bestand kein Unterschied zwischen immundefizienten und immunkompetenten Tieren. Eine maßgebliche Erklärung hierfür ist, daß ein Isolat, welches keine klinisch sichtbaren Veränderungen hervorruft, gleichwohl eine Infektion herbeiführen kann. Ein Zeichen eines erfolgreichen Mikroorganismus ist nicht seine Fähigkeit, eine Erkrankung zu verursachen, sondern seine Möglichkeit zu adhärieren, zu überleben und sich zu vermehren .

In Untersuchungen von Biopsien HIV-positiver und HIV-negativer Individuen mit erythematöser Candidiasis wurde beobachtet, daß in vielen Fällen weder Hyphen noch Blastosporen, jedoch ein intensive Entzündungsreaktion zu beobachten ist . Daraus wurde gefolgert, daß es sich bei der erythematösen Form um eine Hypersensitivitätsreaktion gegen Candida-Antigene handeln könnte. Bei der pseudomembranösen Form hingegen kam es auch bei ausgeprägter Hypheninvasion in die Keratinschicht zu einer schwachen Reaktion.

4.5.2.1 Bestimmung der minimalen Infektionsdosis

In vorliegender Untersuchung konnte gezeigt werden, daß ein deutlicher Unterschied besteht in der Anzahl der Keime, die notwendig sind, eine Infektion bei immunkompetenten bzw. immundefizienten Mäusen zu etablieren. Die minimale Dosis, die benötigt wird, um bei Balb/c Mäusen eine Invasion von Hyphen hervorzurufen, war 1000fach höher als die bei SCID Mäusen benötigte. Eine Dosis-Wirkungsbeziehung wurde in keiner der bisher publizierten tierexperimentellen Studien zur mukosalen Candida-Infektion untersucht.

Untersuchungen beim Menschen zeigten, daß unabhängig von der Art der Probenentnahme (Abstrich, Mundspülung) keine Korrelation zwischen Anzahl der nachgewiesenen Keimzahlen und dem Auftreten einer oralen Candidiasis besteht, so daß ein „Schwellenwert“ festgelegt werden könnte . Immunkompetente Individuen ohne klinische Manifestationen einer Candidiasis weisen unter Verwendung der Abstrichtechnik bis zu 103 CFU/ml auf , bei Patienten mit HIV-Infektion wurden in einigen Fällen trotz klinischer Veränderungen im Sinne einer oralen Candidiasis lediglich 50 CFU/ml nachgewiesen .


91

Die Ergebnisse der Dosis-Wirkungsbeziehung, die in vorliegender Studie nachgewiesen werden konnte, müssen wie jeder Tierversuch generell in Hinblick auf die Übertragbarkeit auf den Menschen diskutiert werden. Candida spp. sind nicht Teil der murinen oralen Flora, während dieser Mikroorganismus bei 20 % - 60 % als Kommensale des Orogastrointestinaltrakts von gesunden Individuen vorkommt . Eine einzige Studie konnte nachweisen, daß C. albicans nach oraler Aufnahme von 1012 Keimen bei einem Immungesunden via intestinale Mukosa zu einer Fungämie begleitet von klinischen Zeichen einer Sepsis führte .

Dosis-Wirkungsbeziehungen finden sich beim Menschen bei Infektionen mit Keimen, die obligat humanpathogen sind. Studien an Freiwilligen zeigten, daß die orale Aufnahme von 103 Salmonellen (S. typhi) zur Infektion der Darmmukosa und Erkrankung führt , die Infektionsdosis von Shigellen liegt bei ca. 101-2, Campylobacter jejuni bei 102-6, E. coli bei 108 Keimen.

4.5.2.2 Inokulation der Infektionsdosis und Glykopeptiden

Ziel vorliegender Untersuchung war u.a. die Bestimmung der Infektiosität eines C. albicans Inokulats in Gegenwart von anti-adhäsiven Substanzen (aus Muzinen abgespaltenen Glykopeptiden) in vivo. Hierzu wurde die für die Infektion erforderliche Mindestmenge an C. albicans jeweils mit Glykopeptiden vermischt und auf die murine Mukosa appliziert.

In einer in vitro Studie konnte zuvor nachgewiesen werden, daß jeder der acht untersuchten C. albicans Stämme, unter denen auch der verwendete Stamm war, eine spezifische Bindung an lösliches Muzin aufwies. Die Bindung an Muzin verläuft über ein universell verbreitetes Rezeptorsystem, welches nicht auf wenige Lektintypen von C. albicans beschränkt ist. Durch den Einsatz dieses ubiquitär auf verschiedene Rezeptormechanismen wirkenden Stoffes, wurden alle Adhäsinstrukturen, die bei der Adhärenz an Muzin beteiligt sind und für die eine spezifische Bindung ermittelt werden kann ohne die Ausdifferenzierung ihres Lektintyps erfaßt. Damit ist die Wirkung des Muzins an verschiedenen C. albicans-Stämmen im Vergleichstest möglich und nicht auf Stämme eines bestimmten Lektintyps beschränkt.

Glykopeptide, d.h. die enzymatischen Aufspaltungprodukte von Muzin, wurden verwandt, um die lektinbindenden Anteile des an der Zelladhäsion beteiligten (Epithelzell-) Rezeptors zu blockieren. Diese Glykopeptide weisen eine höhere spezifische Bindung auf. Hierfür gibt es verschiedene Erklärungsansätze:

a) Die verminderte sterische Hemmung bei kleineren Teilchen ergibt eine bessere Erreichbarkeit der Rezeptoren eines Typs und damit einen erhöhten Anteil an spezifischer Bindung.


92

b) Durch die Veränderung der Einzelbestandteile können nicht nur eine größere Anzahl von Rezeptoren, sondern weitere Rezeptortypen reagieren. Der Einfluß bestimmter Anteile des ehemaligen Muzinmoleküls z.B. der des Kohlenhydratanteils, könnte proportional zu anderen Teilbereichen größer werden. Für die verstärkte Inhibition durch Glykopeptide spricht eine Studie von Brassart et al. . Sie untersuchten die Auswirkungen verschiedener Glykopeptide aus der Nabelschnur von Neugeborenen auf die Adhärenzfähigkeit von C. albicans. Bei der weiteren Fraktionierung erreichte die Unterfraktion der O-Glykane den stärksten inhibitorischen Effekt.

Bei Bakterienstämmen wie z.B. Streptococcus pneumoniae an humane oropharyngeale Epithelzellen oder Haemophilus influenzae an die humane bukkale Mukosa konnte die protektive Wirkung von Glykokonjugaten durch Inhibition der Adhärenz in in vitro Untersuchungen nachgewiesen werden. Anhand eines Mausmodells wurde eine Harnwegsinfektion durch E. coli mit einem Mannose-spezifischen Fimbrienlektin durch Glykoproteine kompetitiv gehemmt .

Wie schon in der Kapitel 1 (Einleitung/ Literaturübersicht) dargestellt, zeigten in vitro Untersuchungen, daß auch die Adhäsion von C. albicans an vaginale und bukkale Epithelzellen durch verschiedene Lektine bzw. Zucker inhibiert werden kann .

Die Ergebnisse vorliegender Untersuchung konnten nachweisen, daß bei gleichzeitiger Inokulation von Glykopeptiden und 105 C. albicans - Zellen in Serienschnitten der Zungenmukosa von acht SCID Mäusen keine Invasion von Hyphen nachweisbar war. Da für die Serienschnitte der halben Zunge von der Mitte aus begonnen wurde, wäre auf diese Weise in jedem Falle die Prädilektionsstelle für eine Infektion erfaßt worden. Nur bei einer Maus wurden vereinzelt Entzündungszellen nachgewiesen, die jedoch nicht Reaktion auf die Adhärenz von C. albicans an das Epithel sondern ebenso Reaktion auf Mikroläsionen darstellen könnte. Den Ergebnissen zufolge reichte die Glykopeptidkonzentration bei dieser Inokulationsmenge aus, um eine Adhärenz zu verhindern.

Die Balb/c Mäuse wurden mit 108 C. albicans-Zellen im Glykopeptidgemisch inokuliert. Die Ergebnisse zeigten, daß bei 2/8 Mäusen (25 %) eine Invasion von Hyphen erfolgte, 19/96 Schnitten (19,8 %) waren PAS-positiv. Nach einmaliger Inokulation von 108 Zellen ohne Zugabe von Glykopeptiden hingegen wiesen 5/6 Mäusen (83 %) PAS-positive Strukturen auf. Obwohl die Anzahl der Tiere gering war, ergibt sich ein Trend in bezug auf eine antiadhäsive Wirkung und eine Abnahme der Infektiosität auch bei einer 1000fach höheren Keimzahl.

Ein bestimmender Faktor für die unterschiedliche Inhibition innerhalb der Versuchstiergruppen scheint die Anzahl der Keime in Relation zum Angebot der Glykopeptide


93

zu sein. Diese Annahme wird durch Untersuchungen bestätigt, die zeigen konnten, daß nur bei einem Überschuß an gelöstem Muzin die Rezeptoren für C. albicans kompetitiv inhibiert werden . Die Wirkung des Muzins bzw. seiner Untergruppe den Glykopeptiden ist weiterhin von der Konzentration abhängig. Bovines Muzin einer Konzentration von 0,5 % vermindert die Adhäsion von Candida spp. an intestinale Zellen um 83 %, niedrigere Muzinkonzentrationen (0,05 %) nur um ca. 40 % . Glykoproteine und Muzine führen, wenn im Überschuß vorhanden, zur Blockierung von Epithelrezeptoren, indem sie sich auf die Rezeptoren oder direkt an den Keim anlagern .

4.5.2.3 Analyse der Infektionsexperimente

In vorliegender Untersuchung konnte makroskopisch nicht beurteilt werden, ob eine Infektion der oralen Mukosa vorlag, da keine klinischen Veränderungen der Zunge im Sinne einer oralen Candidiasis vorlagen. Somit mußte der Nachweis einer Infektion mikroskopisch nach histologischer Aufbereitung mittels Serienschnitten und PAS-Reaktion erfolgen. Die Anzahl der Tiere, die auf diesem Wege beurteilt werden konnten, war durch die Vorgehensweise limitiert. Darüber hinaus war ein Schwerpunkt dieser Arbeit die Festlegung der minimalen Infektionsdosis für Balb/c und SCID Mäuse, die die Grundlage der Adhärenzinhibitionsversuche bildeten. Eine eindeutige, statistisch gesicherte Bewertung des Effekts der Inokulationsdosis auf die Entstehung einer Infektion bezogen auf das einzelne Tier war aufgrund der z.T. geringen Gruppengröße nicht möglich und müßte durch höhere Fallzahlen validiert werden.

Dennoch ergaben sich bei der Analyse der Ergebnisse folgende Tendenzen: In der Gruppe der Balb/c Mäuse war ein Unterschied bezüglich der Inokulationsmengen von 107 und 108 Keimen festzustellen. Die Zahlen deuten darauf hin, daß bei einer Inokulation von 108 C. albicans-Zellen häufiger eine Infektion entsteht als bei Inokulation von 107 Keimen. Interessanterweise entsprach die Keimmenge von 108 der minimalen Infektionsdosis, dem sog. Schwellenwert. Unterschiede zwischen den Inokulationsmengen von 105, 106 und 107 auf die Entstehung einer Infektion wurden nicht gefunden. Bei der Prüfung des Effekts der Inokulation von 108 Keimen versus 108 Keimen zusammen mit Glykopeptiden wiesen die Zahlen auf einen Unterschied hin: Werden 108 C. albicans-Zellen zusammen mit Glykopeptiden inokuliert, entstehen weniger häufig Infektionen als bei Inokulation derselben Keimmenge ohne Glykopeptide.

In der Gruppe der SCID Mäuse wurden keine Unterschiede zwischen den Inokulationsmengen von 105, 106 und 107 C. albicans-Zellen auf die Entstehung einer Infektion gefunden. Eine Prüfung der Unterschiede zwischen der Inokulationsdosis von 104


94

versus 105 war im Vierfeldertest nicht durchführbar. Durch eine größere Anzahl der Tiere pro Gruppe könnte statistisch gesichert werden, ob nach Inokulation der Infektionsdosis von 105 Keimen versus der Inokulation von 104 Keimen, bei der alle Serienschnitte PAS-negativ waren, ein Unterschied nachgewiesen werden kann. Bei Prüfung des Effekts der Inokulation von 105 Keimen versus 105 Keimen zusammen mit Glykopeptiden wiesen die Zahlen auch bei SCID Mäusen auf einen Unterschied hin: Werden 105 C. albicans-Zellen zusammen mit Glykopeptiden inokuliert, entstehen weniger häufig Infektionen als bei Inokulation derselben Keimmenge ohne Glykopeptidzusatz. Wie bei der Auswertung der PAS-Befunde der Serienschnitte nachgewiesen werden konnte, war kein Serienschnitt der Zungen von 8 Mäusen, die mit der Keim/Glykopeptidmischung inokuliert wurden, PAS-positiv.

4.5.3 Immunhistologie

In vorliegender Studie wurde der Zeitpunkt der Zungenentnahme eine Woche post inoculationem so gewählt, daß zwei Phasen der Immunabwehr erfaßt werden konnten. Bis zum Einsatz der erworbenen Immunantwort als Reaktion des Immunsystems auf die Adhärenz und Invasion eines Mikroorganismus vergehen vier bis sieben Tagen, da die antigenspezifischen T- und B-Zellen erst proliferieren und zu Effektorzellen differenzieren müssen.

Ein Ziel vorliegender Untersuchung war, die zelluläre Immunantwort im Epithel sowie subepithelialen Bindegewebe bei definierten Keimmengen und in Abhängigkeit zum Immunstatus zu untersuchen. Hierzu wurde die Antigenexpression immunkompetenter Zellen, die zur Abwehr einer Candida-Infektion relevant sind, dargestellt. Weiterhin sollte die Aktivierung des Endothels in Abhängigkeit zu Keimmenge und Immunstatus untersucht werden. Diese wurde anhand der Expression von Adhäsionsmolekülen, die zu einer erhöhten Leukozytenmigration an den Infektionsort führen, dargestellt. Weiterhin sollte die Immunantwort der oralen Mukosa auf die Inokulation von C. albicans in Anwesenheit von Glykopeptiden charakterisiert werden.

Bisherige immunhistologische und elektronenmikroskopische Studien zeigen, daß im oralen Epithel eine konstante Population immunkompetenter Zellen, die einer lokalen immunologischen Barriere entsprechen, vorhanden ist . Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß Langerhans-Zellen (LHZ) und Lymphozyten sowohl in der Basalzellschicht als auch suprabasal und im Stratum spinosum lokalisiert sein können. Anhand ultrastruktureller Untersuchungen wurde eine Migration von Lymphozyten in das Epithel und LHZ aus dem Epithel nachgewiesen. In Hinblick auf Anzahl, Verteilung und Migration immunkompetenter Zellen ließen sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen muriner und humaner oraler Mukosa feststellen .


95

In der vorliegenden Arbeit wurden monoklonale Antikörper gegen Oberflächenantigene verwendet, die einerseits zur Identifikation der Zellen andererseits zur Markierung des Differenzierungsstadiums, das mit spezifischen Funktionen assoziiert ist, dienten.

Wesentlich bei dem vorliegenden Candidiasismodell bei der Maus ist, daß nicht sämtliche CD-Antigene, die beim Menschen bereits definiert sind, ein Maushomolog besitzen, da sich bestimmte Molekülstrukturen bei der Maus (bislang) nicht darstellen lassen.

Tab. 16: Übersicht der in der Untersuchung dargestellten CD-Antigene, deren Funktion sowie Bezug zur Immunglobulinsuperfamilie

CD-Antigen

murine Zellen, die das Antigen exprimieren

Funktion

Verbindung zu

CD4

Helfer-T-Zellen

Corezeptor für MHC-Klasse-II-Moleküle

Immunglobulin-superfamilie

CD13

Aminopeptidase N auf LHZ, (BZ), Makrophagen

Zink-Metallproteinase

 

CD54

akt. Endothel, LHZ, (akt.) B-Zellen, Makrophagen

und T-Lymphozyten

Interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM-1); bindet das CD11a/CD18-Integrin (LFA-1) und das CD11b/CD18-Integrin (Mac-1)

Immunglobulin-superfamilie

CD 62E

akt. Endothel (E-Selectin)

endothelium leukocyte adhesion molecul (ELAM); bindet Sialyl-Lewis-x; vermittelt die Interaktion zwischen Blutplättchen und Endothelzellen bzw. Monozyten sowie das Entlangrollen von Neutrophilen am Endothel

C-Typ-Lektin, EGF- und CCP-Superfamilie

CD74

B-Zellen, Makrophagen, LHZ, MHC-Klasse II positive Zellen

MHC-Klasse-II-assoziierte invariante Kette (Ii) (involviert in intrazellulären Transport von MHC-Klasse-II Molekülen und Antigenpräsentation)

 

CD80

(akt.) Makrophagen, (akt.) BZ

T-Zell-Costimulator, Ligand für CD28 und CTLA-4

Immunglobulin-superfamilie

CD86

(akt.) Makrophagen, (akt.) BZ

T-Zell-Costimulator, Ligand für CD28 und CTLA-4

Immunglobulin-superfamilie

CD103

CD8+-Zellen in Lamina propria

alphaE-Integrin

Integrin-alpha


96

Weiterhin lassen sich, wenn auch nur wenige, Unterschiede feststellen zwischen der Antigen-Expression muriner und humaner Zellen, so daß in Tabelle 16 veranschaulicht wird, welche murinen Zellen das Antigen exprimieren und welche Funktion mit der Expression verbunden ist.

Die zu charakterisierenden murinen Zellen exprimieren folgende Oberflächenantigene:

Antigenpräsentierende Zellen (APZ)

Makrophagen: CD13, CD54, CD74, CD80, CD86

LHZ: CD13, CD54, CD74, CD80 CD86

B-Zellen: CD13, CD54, CD 74, CD80, CD86

T-Zellen: CD4, CD54, CD103

Endothelzellen: CD54, CD62E,

Die Expression der murinen Antigene ist bei einigen der o.g. Zellen abhängig von ihrem Aktivierungsstadium (aktivierte Makrophagen exprimieren CD74, aktivierte LHZ CD54 , aktivierte T-Zellen CD54; aktivierte B-Zellen CD54, CD80, CD86, aktiviertes Endothel CD54, CD62E).

Das murine L3T4 Antigen (ursprüngliche Bezeichnung) entspricht dem CD4 Antigen des Menschen und konnte durch einen monoklonalen Antikörper (Ratte-antiMaus) charakterisiert werden. Im Gegensatz zu dem homologen Protein beim Menschen zeigten Untersuchungen, daß murines CD4 Antigen nur auf T-Zellen exprimiert wird .

Ein deutlicher Unterschied bezüglich des Immunstatus der Tiere war sowohl bei der Menge als auch bei der Verteilung dieser Zellen innerhalb der Zellschichten zu finden. Während bei niedrigen Inokulationsmengen SCID Mäuse die Expression reduziert war und abgesehen von der höchsten Inokulationsdosis subepithelial stattfand, war bei Balb/c Mäusen der subepitheliale Bereich und die Basalzellschicht involviert. Auch nach Gabe von Keimen mit Glykopeptidzusatz fanden Reaktionen bei SCID Mäusen ausschließlich in der superfiziellen Lamina propria, bei Balb/c Mäusen wiederum im Stratum basale und direkt unterhalb der Basalzellschicht statt.

Die Aminopeptidase N (CD13) der Maus ist ein Marker für APZ und wird mit MHC-Klasse II Molekülen coexprimiert. Er markiert Aminopeptidase N (APN) auf Makro


97

phagen, dendritischen Zellen und B-Zellen, jedoch nicht auf T-Zellen und Thymozyten. APN wird eine Rolle bei der Antigenverarbeitung zugeschrieben .

Bei beiden Mäusestämmen konnte ein Anstieg der Menge an CD13 exprimierenden Zellen in Abhängigkeit von der Inokulationsdosis in der gesamten Lamina propria gefunden werden. Ein Unterschied zeigte sich darin, daß SCID Mäuse bei einer Keimmenge von 105 deutlich mehr CD13-exprimierende Zellen zu beobachten waren als bei Balb/c Mäusen. Ebenso verhielt es sich mit den höheren Inokulationsdosen. Bei 106 Keimen zeigten SCID Mäuse eine beträchtliche Expression, die der Balb/c Mäuse war dagegen minimal. Interessanterweise zeigte sich bei der jeweils höchsten Inokulationsdosis (SCID => 107 und Balb/c => 108) ein Abfall der Zahl CD13+ Zellen in der Lamina propria gegenüber der um eine log Stufe geringeren Dosis. Die Inokulation von Keimen und Glykopeptiden reduzierte in beiden Stämmen deutlich die Expression von positiven Zellen, diese waren im subepithelialen Bereich und in der Lamina propria lokalisiert.

Das interzelluläre Adhäsionsmolekül (ICAM-1) CD54 Antigen wird sowohl auf dem (Maus-) Endothel exprimiert als auch auf APZ und murinen und humanen LHZ . Eine Bindung an diese Moleküle befähigt die T-Lymphozyten dazu, durch Blutgefäße zu wandern. Bei Stimulation durch inflammatorische Mediatoren wie Lipopolysaccharide oder Zytokine steigt die Expression von CD54. Weiterhin erhöht CD54 die antigenspezifische T-Zell Aktivierung .

Bei beiden Stämmen fanden sich ICAM-1 positive Zellen in der superfiziellen Lamina propria, das Endothel war durchgehend aktiviert. Deutlich unterschieden sich die immundefizienten Mäuse jedoch von Balb/c Mäusen bezüglich der Menge exprimierender Zellen: Während Balb/c Mäuse erst bei der höchsten Inokulationsdosis eine starke Expression im subepithelialen Bereich und eine deutliche Aktivierung des Endothels zeigten, wurde bei SCID Mäusen eine hochgradige Expression schon ab einer Inokulationsdosis von 105, also der Dosis, die eine Infektion der oberen Epithelschichten auslöste, erreicht. Auf die Gabe des Keim-Glykopeptidgemisches reagierten beide Stämme mit einer geringfügigen Expression in der oberen Lamina propria und einer minimalen Aktivierung des Endothels.

Bei dem CD62E Antigen (E-Selectin, auch bekannt als endothelial-leukocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1) handelt es sich um ein Zelloberflächenmolekül ebenfalls aus der Gruppe der Adhäsionsmoleküle, den Selektinen. Es wird auf Endotoxin- oder Zytokin-stimulierten (Maus-) Endothelzellen exprimiert .


98

Eine Expression von E-Selectin konnte weder bei SCID noch bei Balb/c Mäusen bei keiner Inokulationsmenge und noch ohne Inokulation nachgewiesen werden.

Das CD74 Antigen spielt beim intrazellulären Transport von MHC-Klasse-II Molekülen und der Antigenpräsentation eine Rolle. Untersuchungen konnten zeigen, daß bei Mäusestämmen, denen CD74 Antigen (MHC-Klasse-II assoziierte invariante Kette) fehlte, der Transport von MHC-Klasse II Molekülen insuffizient war, so daß eine Reduktion der Menge und Funktion von Klasse II Komplexen auf der Zelloberfläche resultierte. Die Folge waren eine verminderte CD4+-Zell Aktivierung . Während beim Menschen aktivierte T-Zellen MHC-Klasse II Moleküle exprimieren, sind bei Mäusen alle T-Zellen MHC-II-negativ.

Bei der Verteilung der markierten Zellen innerhalb der Strata ergab sich bei beiden Mäusestämmen ein ähnliches Verteilungsmuster. Reaktionen verliefen im unteren Anteil des Stratum spinosum, subepithelial und in der Lamina propria. Während die Lamina propria von SCID Mäusen schon bei niedrigen Inokulationsdosen in geringem Ausmaß beteiligt war, wurden CD74+-Zellen bei Balb/c Mäusen in der Lamina propria erst bei Inokulation von 107 und 108 Keimen beobachtet. Bezüglich der Anzahl exprimierender Zellen ergab sich bei SCID Mäusen ein heterogenes Bild, eine Abhängigkeit von der Inokulationsmenge konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Balb/c Mäuse reagierten hingegen bis zu einer Inokulationsmenge von 107 C. albicans-Zellen mit einer geringen, bei 108 Keimen mit einer starken Expression. Die Inokulation von C. albicans mit Glykopeptiden führte bei Balb/c Mäusen zu einer deutlichen Reduktion exprimierender Zellen auf eine bis zwei Zellen pro Schnitt und Epithellage. Bei SCID Mäusen war die Expression nach Gabe von Keimen und Glykopeptiden gering und dementsprechend vergleichbar mit SCID Mäusen, die nicht mit C. albicans inokuliert wurden.

Die Bildung von T-Effektorzellen wird ausgelöst, wenn die antigenspezifischen Rezeptoren und die Corezeptoren, entweder CD4 oder CD8, an einen Peptid:MHC-Komplex binden. Darüber hinaus wird noch ein zweites Signal von der APZ benötigt, um eine klonale Expansion der antigenspezifischen naiven T-Zelle hervorzurufen. CD80 und CD86, beides strukturverwandte Glykoproteine, gehören zu diesen costimulierenden Molekülen auf APZ. Man findet sie ausschließlich auf der Oberfläche von Zellen, die das T-Zell Wachstum anregen können. Während man bis vor einiger Zeit davon ausging, daß LHZ keine costimulierende Aktivität aufweisen, zeigen neuere Untersuchungen, daß sie sowohl CD86 als auch CD80 exprimieren .


99

Sowohl bei SCID als auch Balb/c Mäusen fand sich nur eine unerhebliche Anzahl an CD80-exprimierenden Zellen. Ein Unterschied ließ sich jedoch in Bezug auf deren Lokalisation feststellen: Während CD80+-Zellen bei SCID Mäuse im subepithelialen Bereich nachgewiesen wurden, konnte bei Balb/c Mäusen eine Expression in der Lamina propria beobachtet werden.

Ein Unterschied bei der Antigenexpression zwischen den beiden Tierstämmen zeigte sich bei CD86. Während dieses Antigen bei SCID Mäusen bei allen Inokulationsmengen von einer geringen Zellzahl subepithelial und in der Lamina propria exprimiert wurde, zeigte sich bei Balb/c Mäusen und der Inokulationsdosis, die zu einer Hypheninvasion führte, eine Expression in vier Bereichen des Epithels, die Anzahl CD86 exprimierender Zellen war subepithelial am höchsten.

Das CD103 Antigen ist ein mukosales Lymphozyten-Integrin und spielt nach mikrobieller Kolonisation eine Rolle bei der Entwicklung, Zunahme und Verstärkung CD8+-intraepithelialer Lymphozyten . Der Antikörper gegen CD103 reagiert mit einer Subpopulation von CD8+-T-Zellen. Studien an CD103-defizienten Mäusen zeigten eine Reduktion mukosaler T-Lymphozyten in Epithelzellen und der Lamina propria .

Sowohl SCID als auch Balb/c Mäuse exprimierten dieses Antigen in der superfiziellen Lamina propria, in der Basalzellschicht als auch bei höheren Inokulationsdosen im unteren Bereich des Stratum spinosum. Deutlich wird dennoch, daß bei SCID Mäusen die Expression dieses Antigens in Abhängigkeit von der Inokulationsdosis ansteigt, bei den höheren Inokulationsdosen jedoch nur wenig exprimiert wird. Bei Balb/c Mäusen dagegen findet sich ein Anstieg der Expression nahezu linear zur Inokulationsdosis. Eine Reduktion von CD103+-Zellen nach Gabe des Keim-Glykopeptidgemisches konnte bei SCID und Balb/c Mäusen in dem selben Maße und in den dieselben Bereichen (Basalzellschicht und direkt unterhalb) beobachtet werden.

4.5.3.1 Immunreaktion nach Invasion von C. albicans in das murine Epithel

Wie die Ergebnisse der PAS-Untersuchungen zeigten, führte die Inokulation von 105 Keimen bei den SCID Mäusen zu einer Hypheninvasion in das Stratum corneum, während Balb/c Mäusen zur Infektion der Zungenmukosa eine tausendfach höhere Menge benötigten.

Vergleicht man den „Schwellenwert“ von 105 Keimen bei SCID Mäusen mit dem der Balb/c Mäuse, der bei 108 lag, ergibt sich folgende Verteilung immunologischer Reaktionen:


100

Das Endothel war nach Invasion in beiden Gruppen deutlich aktiviert (CD54), sub-epithelial fand sich eine große Anzahl APZ. In beiden Gruppen wurde darüber hinaus im Stratum basale eine große Anzahl CD103+-Zellen beobachtet, die Hinweis auf eine Entwicklung CD8+-Lymphozyten gaben. In Untersuchungen zur Verteilung immunkompetenter Zellen bei oraler Candidiasis HIV-infizierter Patienten lagen Lymphozyten, die mit einem Antikörper gegen CD8 Antigen detektiert wurden, ebenfalls im Stratum basale . Da in jener Studie keine immunkompetente Kontrollgruppe mit oraler Candidiasis zum Vergleich herangezogen wurde, konnte nicht gezeigt werden, ob CD8+-Zellen hauptsächlich in der Basalzellschicht und in geringer Zahl im Stratum spinosum und subepithelial nachweisbar waren, so wie es in vorliegender Studie anhand des Entwicklungsmarkers für CD8-Lymphozyten (CD103) beobachtet werden konnte. Untersuchungen zur Verteilung und Dynamik muriner und humaner intraepithelialer Lymphozyten in der normalen oralen Mukosa zeigten jedoch, daß diese gelegentlich die Basalmembran durchqueren und daß nicht in allen Fällen eindeutig nachgewiesen werden kann, ob diese in das Epithel einwandern oder durch die Basalmembran in die Lamina propria wandern

Die Zellen der Balb/c Mäuse reagierten auf die Hyphen-Invasion zusätzlich mit einer deutlichen Expression des Glykoproteins CD86, welches zu den costimulierenden Molekülen auf APZ gehört und in die Bildung von T-Effektorzellen involviert ist. Dieses Protein war besonders subepithelial aber auch bis in das obere Stratum spinosum nachweisbar. In normalem murinen Epithel exprimieren nur wenige LHZ bzw. dendritische Zellen CD86 Antigen, wohingegen Balb/c Mäuse nach Kontakt mit einem Hapten (Dinitrofluorobenzol) mit einer vermehrten Expression reagieren . Dieses kostimulierende Signal war in der vorliegenden Studie bei immundefizienten Mäusen nach Inokulation von C. albicans wenig ausgeprägt, d.h. die Proliferation und Differenzierung der naiven T-Zellen zu T-Effektorzellen könnte somit erschwert sein.

In beiden Gruppen war keine Expression des zweiten costimulierenden Signals (CD80) zu beobachten. Ursache hierfür kann der Zeitpunkt der Organentnahme sein, da Studien am Mausmodell zeigten, daß CD80 später als CD86 exprimiert wird. In einer früheren Untersuchung an Balb/c Mäusen konnte zudem gezeigt werden, daß die Expression von CD80 Antigen nach Stimulation mit einem Fremdantigen geringer ist als die von CD86 .

Ein deutlicher Unterschied zeigte sich auch bei der CD74 Expression. Während sich bei immunkompetenten Mäusen nach Keiminvasion vermehrt CD74+-Zellen subepi-thelial und im unteren Stratum spinosum nachweisen ließen, war bei SCID Mäusen die Anzahl CD74+-Zellen gering, jedoch in denselben Epithelschichten zu beobach


101

ten. Wie Untersuchungen an Mäusen zeigten, wird dieses Antigen zum regelrechten Transport von MHC-Klasse II Molekülen an die Zellmembran der APZ benötigt. Fehlt die invariante Kette, resultiert daraus eine reduzierte Anzahl von MHC-Klasse II Molekülen, eine insuffiziente Bindung an die Fremdantigenpeptide und in Folge eine verminderte Produktion von CD4+-T-Zellen .

Den Ergebnissen bei der Inokulationsdosis von 105 C. albicans-Zellen zufolge könnte vermutet werden, daß die Keiminvasion in das Epithel bei SCID Mäusen keine Folgen auf die Expression von CD74 hat. Betrachtet man jedoch die Keimmengen um eine log Stufe darüber und darunter, so wird deutlich, daß CD74+-Zellen sowohl im unteren Stratum spinosum als auch in hoher Anzahl im subepithelialen Bereich nachweisbar waren. Daher scheint die bei einer Inokulationsmenge von 105 C. albicans-Zellen beobachtete reduzierte Expression von CD74 nicht typisch für Mäuse mit B- und T-Zelldefekt zu sein.

Das Enzym Aminopeptidase N (CD13) konnte subepithelial in beiden Tiergruppen bei der jeweils für eine Infektion benötigten Inokulationsdosis nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu fanden Romagnoli et al. bei HIV-seropositiven Individuen in der unveränderten Mukosa eine Reduktion der Expression von MHC-Klasse II Molekülen auf LHZ . Eine Erklärung für die unterschiedlichen Ergebnisse könnte sein, daß das CD13 Antigen nicht nur von LHZ, sondern ebenso von Makrophagen und B-Zellen exprimiert wird, so daß in dieser Untersuchung keine Aussage über diese spezifische Funktion der LHZ abgeleitet werden kann.

Bei B- und T-Zell defizienten Mäusen waren CD4+-Zellen nur vereinzelt (1-2 positive Zellen pro Zunge) nachweisbar und auf den subepithelialen Bereich beschränkt. Bei Balb/c Mäusen konnten CD4+-Zellen jedoch bis ins untere Stratum spinosum beobachtet werden. Ähnliche Ergebnisse bezüglich der Restriktion von CD4+-Zellen auf den subepithelialen Bereich konnten bei HIV-infizierten Individuen mit oraler erythematöser Candidiasis beobachtet werden . Weiterhin zeigten immunhistochemische Untersuchungen von Biopsien HIV-seropositiver Personen mit erythematöser und pseudomembranöser Candidiasis, daß im gesamten Epithel keine CD4+-Lymphozyten nachweisbar waren. Auch im Epithel gesunder, HIV-seronegativer Individuen fanden sich keine CD4+-T-Lymphozyten . Im Gegensatz hierzu konnten in anderen Studien CD4+-Lymphozyten in der normalen humanen Mukosa auch intraepithelial nachgewiesen werden .

Wie in Material und Methoden dargestellt, handelte es sich bei dem verwendeten Marker um einen monoklonalen Antikörper ausschließlich gegen murine CD4+-T-Zellen. Studien zeigten, daß das CD4 Antigen bei der Maus lediglich auf T-Zellen exprimiert wird und nicht wie bei dem homologen Protein von Ratte und Mensch zu


102

sätzlich auf Makrophagen . Das CD4 Antigen ist weiterhin auf humanen LHZ in kleinen Mengen vorhanden .

Die Markierung der CD4+-Zellen zeigte, daß der Antikörper RM4-5 (Pharmingen, Hamburg, Deutschland) dendritische Zellen markierte (Abb. 25 und 26).

Daher muß im Gegensatz zu den Angaben des Herstellers sowie o.g. Untersuchungen angenommen werden, daß auch dendritische Zellen der Maus eine CD4 Antigendeterminante aufweisen. In einer Studie wurde bislang der Nachweis für eine Expression von CD4 und CD8 in murinen dendritischen Thymuszellen erbracht .

Weder bei der Inokulationsmenge, die eine Infektion hervorrief, noch bei anderen Keimmengen wurde E-Selectin (CD62E) exprimiert. Das Adhäsionsmolekül ist an der Leitung phagozytierender Zellen zu den Infektionsherden beteiligt. Durch eine Wechselwirkung zwischen dem auf den Endothelzellen induziertem Selektin und dem Leukozyten kommt es zunächst zu einer schwachen Bindung des Leukozyten an das Gefäßendothel. Da diese Bindung nicht stark genug ist, wird zusätzlich ICAM-1 (CD54) auf dem Endothel exprimiert, wodurch der Leukozyt stabilisiert wird. Hiermit wird das „rolling“ beendet und der Leukozyt kann sich durch die Endothelzellen hindurchzwängen. In einer aktuellen Studie an E-Selectin-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, daß es trotz fehlender endothelialer Selektine zu einer Migration von Leukozyten an den Infektionsort kam. Bei Mäusen mit ICAM-1 Defekt jedoch blieb die Einwanderung von Leukozyten komplett aus . In einem weiteren Mausmodell konnte im Verlauf einer experimentellen murinen Listeriose eine generelle Expression von P-Selectin (CD62P) und ICAM-1 in den untersuchten Organen (Leber, Milz) beobachtet werden; die Expression von E-Selectin dagegen war äußerst schwach . Schon in früheren Studien konnte gezeigt werden, daß E-Selectin zwar an die Migration muriner Leukozyten zum Infektionsort beteiligt ist, die Selektine CD62P und CD62L (P- und L-Selectin) in diesem Prozeß jedoch die dominante Rolle spielen .

Vorliegende Untersuchung gibt Hinweis darauf, daß nicht nur nach viraler, sondern auch nach Infektion mit C. albicans eine CD62E Expression nicht zwingend notwendig ist, um eine Leukozytenwanderung zu ermöglichen. Diese Beobachtung traf für immunkompetente und immundefiziente Mäuse zu. Da die Expression von E-Selectin auf Endothelzellen Kennzeichen einer akuten, durch Zytokine vermittelten Entzündungsreaktion ist, kann eine weitere Erklärung für den fehlenden Nachweis von E-Selectin der Zeitpunkt der Organentnahme sein. Möglicherweise wird das Antigen zu einem früheren Zeitpunkt exprimiert, so daß dieses eine Woche post inoculationem nicht mehr nachweisbar ist.


103

Die Ergebnisse der Untersuchung zeigten, daß bei immundefizienten Mäusen ohne Inokulation, nach Inokulation und Invasion von C. albicans in das Epithel die Anzahl CD4+-Zellen in der oralen Mukosa reduziert und ein zur Aktivierung von naiven T-Zellen benötigtes costimulierendes Signal der APZ nur in geringem Maße vorhanden war. Weiterhin beschränkten sich Immunreaktionen bei immundefizienten Mäusen abgesehen von CD74 auf den subepithelialen Bereich, während bei immunkompetenten Tieren APZ einschließlich CD4+-dendritischer Zellen intraepithelial zu finden waren. Untersuchungen konnten zeigen, daß die Zahl von LHZ in der Zungenmukosa bei SCID Mäusen verglichen mit Balb/c Mäusen nicht reduziert ist . Bezogen auf vorliegende Ergebnisse könnte gefolgert werden, daß bei SCID Mäusen die intraepitheliale Schutzfunktion bei gleicher Anzahl von LHZ durch eingeschränkte Reaktionen auf ein Fremdantigen reduziert ist, so daß schon geringe Inokulationsdosen zu einer mukosalen Infektion führen können.

Weitere Ursache für eine Infektion bei geringerer Inokulationsdosis bei immundefizienten Tieren kann eine Veränderung eines Mechanismus sein, der der Adhärenz und Invasion des Pathogens vorgeschaltet ist. Ein wesentlicher Faktor ist hierbei die Zusammensetzung des Speichels und der Speichelmuzine. In vitro Untersuchungen zeigten, daß Speichel von Patienten unter Chemoradiotherapie eine reduzierte Adhärenzinhibition gegenüber C. albicans aufweist. Ursache hierfür war die durch die Therapie induzierte Reduktion des Glykoproteins Lactoferrin im Speichel, es erfolgte ein Anstieg der adhäsiven Eigenschaften sowohl von C. albicans als auch den oralen Epithelzellen .

4.5.3.2 Immunreaktion nach Inokulation von C. albicans in Abhängigkeit zur Inokulationsdosis

Die Ergebnisse der Immunreaktionen in Abhängigkeit zur Inokulationsdosis und dem Immunstatus müssen zurückhaltend interpretiert werden, obwohl beiden Gruppen 105, 106 und 107 C. albicans-Zellen inokuliert wurden. Von maßgeblicher Bedeutung ist jedoch, daß eine Invasion von Hyphen und damit eine Infektion bei SCID Mäusen bereits bei einer Inokulation von 105 Keimen auftrat. Bei Balb/c Mäusen wurde ebenfalls eine Menge von 105 Zellen inokuliert, doch fand in dieser Gruppe erst eine Hypheninvasion bei einer Inokulationsmenge von 108 Keimen statt. Weitere Steigerungen der Keimmenge wurden nicht vorgenommen, da Ziel der Untersuchung die Festlegung einer minimalen Infektionsdosis war. Ein weiterer Grund, der eine vorsichtige Interpretation verlangt, ist die geringe Anzahl der Tiere. Dennoch schienen bei SCID Mäusen die Immunreaktionen nach Inokulation zwei Mechanismen zu folgen: 1. Vermehrte Expression (ICAM-1 im Endothel und subepithelial) nach Invasion


104

von Candida-Hyphen, unabhängig von der steigenden Dosis 2. Expression in Abhängigkeit zur Inokulationsdosis (CD13, CD86), was auf eine regelrechte, der Menge der Fremdantigene angepaßte Antigenverarbeitung in den APZ schließen läßt.

4.5.3.3 Immunreaktion nach Inokulation der Infektionsdosis und Glykopeptiden

Den Ergebnissen der PAS-Untersuchungen bei SCID Mäusen zufolge, reichte die Konzentration an Glykopeptiden bei einer Inokulationsmenge von 105 Keimen aus, um eine Adhärenz zu verhindern. Balb/c Mäusen wurden mit der Infektionsdosis von 108 C. albicans-Zellen und Glykopeptiden inokuliert, wobei in 2/8 Mäusen eine Invasion von Hyphen stattfand. Die immunologischen Reaktionen des Wirtes auf diese Verbindung entsprach in bezug auf die Verteilung innerhalb der Strata und Menge exprimierender Zellen bei SCID und Balb/c Mäusen denen ohne Inokulation. Interessanterweise zeigte sich bei SCID Mäusen ohne Keiminokulation dennoch ein deutlich aktiviertes Endothel, welches bei der Gabe von Glykopeptiden und Keimen nicht zu beobachten war. Möglicherweise läßt sich die Beobachtung dadurch erklären, daß in vorliegender Untersuchung ausschließlich die Invasion von C. albicans mittels PAS-Methode nachgewiesen wurde. Daher ist es nicht auszuschließen, daß, vor allem bei Mäusen mit kombinierten B- und T-Zelldefekt, diese Reaktion durch andere Fremdantigene wie Bakterien bestimmt wurde.

Wie im vorherigen Abschnitt diskutiert wurde, zeigten Balb/c Mäuse, die mit der minimalen Infektionsdosis inokuliert wurden, immunologische Reaktionen bis hin in den unteren (CD4, CD74, CD86 und CD103) und oberen Bereich des Stratum spinosum (CD86). Bei zusätzlicher Gabe von Glykopeptiden waren diese hauptsächlich auf den subepithelialen Bereich begrenzt.

Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchung zeigten, daß die lokalen murinen Immunreaktionen bei Zugabe von Glykopeptiden denen ohne C. albicans-Inokulation ähnelten. Hieraus läßt sich schließen, daß ein Glykan-vermittelter Schutz in vivo die Infektiosität von C. albicans durch Inhibition der Adhäsion an das murine Epithel mindern kann.

Die protektive Wirkung des Glykananteils löslicher Glykokonjugate wurde bereits in bezug auf Bakterien in in vitro und in vivo Untersuchungen belegt. Bereits in den siebziger Jahren konnte sowohl eine prophylaktische Wirkung von keimspezifischen löslichen Glykanen auf die Infektion der Schleimhaut als auch eine Desorption durch Glykokonjugate nach Adhärenz von Bakterien nachgewiesen werden . Am Beispiel von E. coli wurde gezeigt, daß sich die Glykanspezifität verschiedener Bakterien erheblich von einander unterscheidet, selbst innerhalb von Subspezies werden wesentliche Unterschiede in der Spezifität der Glykanbindung beobachtet .


105

Darüber hinaus konnten Präparationen des GlcNAc-Polymers Chitin vor C. albicans induzierter muriner Vulvovaginitis schützen .

Tierexperimentell wurde schon in früheren Studien belegt, daß eine verminderte Speichelproduktion und damit eine Reduktion von Muzinen zu einer schnelleren Besiedlung der Mundhöhle mit Streptococcus mutans und C. albicans sowie zu einer verzögerten Wundheilung führt .

4.6 Kritische Aspekte und Perspektiven

Die Therapie der oralen Candidiasis besteht in der lokalen oder systemischen Applikation von Antimykotika. Es werden zunehmend Resistenzen nach Langzeittherapie Azolderivaten (Ketoconazol, Fluconazol) beobachtet, darüber hinaus treten Kreuzresistenzen mit anderen Fungistatika auf . In vorliegender Studie wurde von einer Oligosaccharid-Lektin-vermittelten Invasion des Wirtes ausgegangen, woraus sich direkt ein protektives Interventionskonzept ableiten ließ. Es sollte daher ein alternativer Weg, nämlich das Eingreifen in den Adhärenzprozeß von C. albicans untersucht werden, da die Adhärenz den ersten Schritt auf dem Weg zur Infektion darstellt .

Die Ergebnisse vorliegender Arbeit zeigten, daß eine Inhibition der Adhärenz von C. albicans durch Glykopeptide, gewonnen aus einem Präparat, das in Deutschland zum Einsatz bei Xerostomie eingeführt wurde, erreicht wurde. In vitro Untersuchungen zeigten, daß die Bindung dieses Präparats an verschiedene Lektine ca. 10fach stärker ist als die von menschlichem Speichel, so daß dessen Schutzkapazität die des menschlichen Speichels übertrifft .

Aus vorliegender Untersuchung ergeben sich folgende Fragen bzw. Ansätze für zukünftige Forschungsschwerpunkte :

  1. Ist eine adhäsionsinhibitorische Wirkung von Glykopeptiden auch dann gewährleistet, wenn diese nicht zuvor mit C. albicans vermengt werden. Erfolgt eine Desorption durch Glykopeptide auch nach Adhärenz von C. albicans, so wie es für E. coli bei der Maus nachgewiesen werden konnte.
  2. In welchem Verhältnis müssen Glykopeptide zur Anzahl der Mikroorganismen stehen. Bei der Frage der benötigten Dosis muß die Wirkung der von C. albicans sezernierten Säureproteinasen berücksichtigt werden, die in vitro Muzin hydrolytisch spalten können und schon von Blastosporen, die an Epithelzellen adhärieren, exprimiert werden .
  3. Ist die Gabe von Glykopeptiden auch bei klinisch apparenter Candida-Infektion wirksam oder kann sie lediglich der Prävention dienen.

    106

  4. Stellt die Adhärenzinhibition einen alternativen Weg bei Resistenzen gegenüber Antimykotika dar. Hierzu konnte eine in vitro Studie bereits nachweisen, daß azolresistente Keime eine ebenso spezifische Bindung an Muzine aufweisen, wie nicht resistente Stämme . Bei einigen der resistenten Stämme wurde überdies eine höhere spezifische Muzinbindung beobachtet. Ursache dafür sind möglicherweise Veränderungen des Lektintyps während der Azoltherapie, wie auch von Korting et al. beschrieben . Veränderungen des Lektintyps ziehen jedoch nur in geringem Maße Veränderungen der Zellmembranbestandteile nach sich, welche das Adhärenzverhalten an Muzin beeinflussen könnten. Selbst bei Änderung des Lektintyps unter Azoltherapie behalten Muzine die Fähigkeit, den Keim zu verdrängen.
  5. Welche Struktur des Glykananteils der Glykopeptide bestimmt die Adhärenzinhibition.

Der Einsatz von Muzin oder dessen Spaltprodukten zur Prophylaxe bzw. zur Therapie bietet einen weiteren Vorteil, da es sich hierbei um einen physiologischen Bestandteil vieler Körpersekrete handelt. Die Resorption ist ebenso wie die Toxizität gering. Unerwünschte Wirkungen nach Gabe tierischen Muzins sind bisher bei der prophylaktischen Anwendung nicht beobachtet worden.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Thu May 3 14:26:08 2001