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1  Einleitung – Die Problematik

1.1 Tumortherapie und Prognose

Die medikamentöse Behandlung mit konventionellen „antineoplastischen“ Substanzen stellt nach wie vor die Therapie der Wahl für die meisten disseminierten Tumorerkrankungen und insbesondere hämatologische Neoplasien dar. Nahezu allen konventionellen Zytostatika ist dabei gemeinsam, dass sie mit dem regelhaften Ablauf des Zellzyklus interferieren. Die quantitativ und qualitativ bedeutendste Gruppe stellen hier neben Spindelgiften, Anti-Mikrotubulus-Agentien, Proteasom-Inhibitoren oder Translationshemmern die DNA-interagierenden Wirkstoffe dar, die auf biochemisch unterschiedliche Weise mit der DNA-Replikationsmaschinerie interferieren [1]. Basierend auf empirischen Studien sind so eine Vielzahl an Monotherapien oder Kombinationsregimen entwickelt worden, die bevorzugt Zellen mit hoher mitotischer Aktivität angreifen sollen, grundsätzlich allerdings relativ geringe Spezifität und hohe Toxizität für Normalgewebe und Gesamtorganismus aufweisen. Enttäuschenderweise sind trotz vieler neuer Wirkstoffe auf dem Gebiet der konventionellen Chemotherapie über mehrere Dekaden kaum substantielle Prognoseverbesserungen erzielt worden. Beispielsweise ist das 1976 vorgestellte CHOP-Schema (Cyclophosphamid, Doxorubicin, Vincristin und Prednison) zur Behandlung vieler hochmaligner Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) bis dato nicht von einem überlegenen Regime abgelöst worden [2, 3]. Selbst Hochdosis-Therapien, bei denen dosis-limitierende Knochenmarkstoxizität durch hämatopoietischen Stammzell-Support kompensiert wird, konnten in den meisten Tumorentitäten nicht zu verlängertem Patientenüberleben führen [4, 5]. Ebenso ist der Erfolg sogenannter „Next-Line“-Therapien nach Versagen eines Initialregimes als Ausdruck des im wesentlichen ähnlichen Wirkmechanismus der meisten konventionellen Zytostatika begrenzt. Damit stellt a priori- oder erworbene Chemoresistenz den entscheidenden prognose-limitierenden Faktor für Patienten mit disseminierter Tumorerkrankung dar.

1.2 Chemoresistenz als Prä- und Post-Schädigungsproblem

Über viele Jahre war angenommen worden, dass der Angriff von Zytostatika an subzellulären Strukturen unmittelbar und unabdingbar zu einer massiven Zellschädigung führt, die mit dem Überleben der betroffenen Zelle unvereinbar ist. Folglich konzentrierte sich die Exploration von Resistenzmechanismen auf Prinzipien, die während der „Prä-Schädigungsphase“, also vor der potentiellen Interaktion eines Wirkstoffs mit seiner intrazellulären Zielstruktur, eingreifen. Neben systemischen pharmakokinetischen Aspekten wie Wirkstoff-Bioverfügbarkeit, Halbwertszeit oder lokaler Wirkkonzentration und intratumoraler Verteilungshomogenität sowie der Induktion von substanz-spezifisch metabolisierenden Enzymen sind insbesondere Zytostatika-Efflux-Pumpmechanismen als Paradigmen der klinisch so häufig gesehenen „Multi-Drug-Resistenz“ (MDR) diskutiert worden [6, 7]. Entsprechende Arbeiten konnten zeigen, dass das MDR-kodierte P-Glykoprotein und verwandte Genprodukte als Transmembran-Pumpen mit breiter Substratspezifiät gegenüber biochemisch unterschiedlichen Zytostatika-Klassen fungieren und somit die intrazelluläre Wirkstoffkonzentration einer Vielzahl gängiger Chemotherapeutika reduzieren. Obwohl MDR-Genamplifikation oder -Überexpression in Tumoren gefunden wurde und diese auch mit Insensitivität gegenüber P-Glykoprotein-affinen Zytostatika in vitro korreliert werden konnten, haben dieser Resistenzmechanismus und die Wirksamkeit sogenannter „MDR-Reversal“-Pharmaka nur begrenzte klinische Signifikanz erlangt [8, 9].

Da auch gegen Zytostatika ohne P-Glykoprotein-Affinität Kreuzresistenzen auftreten, war offenkundig, dass MDR-verwandte Mechanismen allenfalls für einen [Seite 8↓]Teilaspekt des klinischen Problems verantwortlich sind. Die bekannte Tatsache, dass auch unter strahlentherapeutischer Behandlung, die wohl ähnlich wie Zytostatika in erster Linie DNA schädigt, aber gegen die keine wirklichen „Pre-Damage-Resistenzmechanismen“ existieren, ebenfalls Therapieresistenz erzeugt wird, unterstützte die Hypothese, dass nicht der Schaden selbst unumgänglich letal ist, sondern lediglich einen zellulär kontrollierten „Post-Damage“-Prozess triggert, der über das weitere Schicksal der Zelle entscheidet. In der Tat ist der durch Zytostatika erzeugte Initialschaden an zellulären Strukturen, insbesondere DNA, häufig so gering, dass er unter bestimmten Umständen reparabel ist.

1.3 Tumorbiologie und Therapiesensitivität

Wenn zelluläre Signalkaskaden die tatsächlichen Vollstreckerinstanzen des Zytostatika-Stimulus darstellen, könnten genetische Veränderungen das Therapieresultat modifizieren. Während Zellen des Normalgewebes genomisch stabil sind, sind allen Tumorzellen genetische Aberrationen immanent. Dabei verfügen etablierte Tumorzellen nicht nur über eine sehr breite genetische Variabilität bzw. Überlebensfähigkeit trotz zahlreicher Mutationen, wodurch sie für chemotherapie-induzierte Selektionsprozesse empfänglicher werden als Normalzellen. Um überhaupt das Vollbild eines neoplastisch-atypischen Phänotyps zu akquirieren, müssen Zellen bereits im Zuge der malignen Transformation eine Sequenz genetischer Krisen durchlaufen, die mit charakteristischen Defekten in zellulären Kontrollprogrammen und veränderter Chemosensitivität einhergehen.

1.3.1 Aktivierte Onkogene als „driving force“ der malignen Transformation

Malignes Wachstum entspricht einer Nettozunahme der Zellzahl und damit einer Imbalance der Homeostase von Teilungs- und Absterberate. Mitose und Apoptose sind komplex überwachte Schlüsselaufgaben der Zelle. Es gibt Hinweise, dass ein initialer Zelltod-Defekt – von embryonalen, also ohnehin expandierenden Geweben abgesehen – alleine nicht hinreichend tumorigen ist, weil die passive Reduktion der Absterberate von einer funktionierenden Proliferationskontrolle aktiv kompensiert werden kann [10, 11]. Im Gegensatz dazu sind akut aktivierte Mitogene potentiell tumorigen, da sie Proliferation autonomisieren, also von einer zellulären Gegenregulation entkoppeln. Mitogene Onkogene wie myc oder ras stellen daher typischerweise das Initialereignis der malignen Transformation dar und funktionieren als Motor der klonalen Expansion. Diese Läsionen, in denen eine intakte „Todesmaschine“ latent verfügbar ist, sind konsequenterweise hypersensitiv für Todessignale. Entsprechend konnte in Mausmodellen induzierbarer bzw. regulierbarer Onkogene demonstriert werden, dass hyperproliferative Läsionen – wenn sie hier überhaupt entstehen – während einer Initialphase potentiell reversibel sind [12, 13, 14, 15]. Es ist daher eine attraktive Hypothese, dass Tumoren in dieser frühen Progressionsphase durch die Aktivierung eines mitogenen Onkogens besonders chemosensibel werden, woraus sich die typischerweise höhere Zytostatika-Empfindlichkeit von Tumorgewebe gegenüber Normalgewebe erklären könnte [16, 17, 18].

1.3.2 Checkpoint-Kontrolle regelhafter Zellzyklus-Passage

Maligne Transformation ist ein Kräftespiel zwischen onkogenen Faktoren und zellulären Gegenmaßnahmen. Tumormanifestation ist daher die Konsequenz durchbrochener Tumorsuppressor-Mechanismen, sogenannter zellulärer „Failsafe-Programme“. Aufgabe der Failsafe-Programme ist es, Zellen mit potentiell malignen Veränderungen im Pool proliferierender Zellen zu identifizieren und durch forcierten Zellzyklus-Exit deren Expansion zu verhindern. Failsafe-Programme müssen daher über einen Sensor- und einen Exekutions-Arm verfügen. Während der Zellzyklus-Passage [Seite 9↓]werden an diversen Schlüsselstellen, den sogenannten „Checkpoints“, Kriterien regelhafter Zellzyklus-Progression und DNA-Replikation abgefragt [19]. Werden Irregularitäten detektiert, ergreift die Checkpoint-Kontrolle adäquate Maßnahmen: die Zellzyklus-Passage wird arretiert und der Defekt entweder repariert, oder aber die Zelle wird durch Einschleusung in ultimative Programme wie Apoptose oder Seneszenz (siehe unten) von weiterer Proliferation definitiv ausgeschlossen [18, 20]. Aktivierte Onkogene sind daher „zweischneidige Schwerter“: die mitogene Komponente ist typischerweise mit einer pro-apoptotischen oder pro-seneszenten Komponente als Ausdruck der zellulären Gegenregulation vergesellschaftet [21, 22, 23, 24].

1.3.3 Apoptose als zelluläres Failsafe-Programm

Die Existenz einer genetisch kontrollierten Zelltod-Signalkaskade mit charakteristischen morphologischen Veränderungen wie Membran-Ausstülpungen, Kernfragmentierung und Chromatin-Kondensation ist seit über drei Dekaden bekannt [25]. Verschiedene pro-apoptotische Stimuli – aktivierte Onkogene, DNA-Schädigung, oder „Todesrezeptor“-Liganden wie Fas/CD95 und Tumornekrosefaktor [26, 27, 28] – können auf verschiedene Weise eine Sequenz intrazellulärer Effektoren aktivieren, wobei der extrinsische Rezeptor-Pathway von einer intrinsischen mitochondrialen, Cytochrom C-freisetzenden Kaskade prototypisch unterschieden wird. Nach potentieller Kreuzverschaltung der beiden Kaskaden werden in einer gemeinsamen Endstrecke Proteasen der Caspase-Familie und Nukleasen aktiviert, die den Zellsuizid in charakteristischer Weise exekutieren [29, 30]. Wichtig ist, dass diese Sequenz – ähnlich wie das Gerinnungs- oder das Komplementsystem – über multiple Kontrollmechanismen und Inhibitoren verfügt. Neben „Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs)“ und pro-apoptotischen Inhibitoren der Inhibitoren (z.B. Smac/Diablo [31]) sind vor allem die anti-apoptotischen Bcl2-Familienmitglieder bcl2 und bcl-xl wichtige „Pro-Survival“-Regulatoren des Apoptose-Programms [32, 33]. Die überlebensfördernde Rolle der meisten Gegenregulatoren ist dabei weniger als ein aktiver Apoptose-Antagonismus, sondern eher als eine bedarfsgerechte Sollwertverstellung der Todesschwelle zu verstehen. So wird die Apoptose-Hemmung durch Bcl2-Überexpression nicht unter optimalen nutritiven Bedingungen, sondern erst unter Serumentzug evident [34]. Entsprechend haben bcl2 oder bcl-xl trotz deren wichtiger Rolle in verschiedenen Tumorentitäten – wie beispielsweise die Bcl2-Überexpression im follikulären Lymphom [35] – kein eigentlich onkogenes Potential wie mitogene Onkogene, sondern erleichtern passiv die maligne Transformation.

Nicht alle Onkogene aktivieren Apoptose, doch kann Apoptose die charakteristische Akut-Reaktion sein. So provoziert myc trotz seiner mitogenen Potenz typischerweise massiv Apoptose [21]. Abhängig von den lokalen Wachstumsbedingungen, d.h. vor allem Zytokinkonzentration und Oxygenierung, ist entweder Proliferation oder Apoptose die dominierende onkogene Funktion [36, 37]. Apoptose fungiert also als onkogen-responsives Failsafe-Programm, indem entweder die Entstehung onkogen-mediierter Präkanzerosen effektiv verhindert wird oder aber – zumindest während einer prämalignen Phase – die Spontanregression der hyperplastischen Läsion eingeleitet wird [15, 38].

1.3.4 Seneszenz als zelluläres Failsafe-Programm

Im Gegensatz zu einem vorübergehenden Zellzyklus-Stopp stellt zelluläre Seneszenz einen terminalen Wachstumsblock dar, der seneszente Zellen irreversibel aus dem Pool sich aktiv teilender Zellen eliminiert. Seneszenz wurde vor mehr als vier Dekaden erstmalig von Hayflick und Moorhead beschrieben, die mit diesem Begriff der „Zellalterung“ den terminalen Teilungsstopp von kultivierten Fibroblasten nach Ausschöpfung einer endlichen Zahl an Zelldivisionen, auch „Hayflick-Limit“ genannt, charakterisierten [39]. Zugrunde liegender Mechanismus dieser „mitotischen Uhr“ ist die progressive Verkürzung und konsekutive De-Protektion der Chromosomen-Enden bei [Seite 10↓]jeder Zellteilung [40, 41], falls die Telomer-Länge nicht enzymatisch restauriert wird [42]. Phänotypisch von replikativer Seneszenz ununterscheidbar ist die akut induzierbare und daher prämature Seneszenz. Diese telomer-unabhängige Form der Seneszenz kann durch zelluläre Stresse wie aktivierte Onkogene, reaktive Sauerstoff-Spezies oder DNA-Schädigung ausgelöst werden [20, 23, 24, 43, 44]. Da seneszente Fibroblasten ein charakteristisches Genexpressionsprofil aufweisen [45] und mit β-Galaktosidase im sauren pH-Optimum (seneszenz-assoziierte SA-β-Gal-Aktivität) einen biochemischen Marker exprimieren, der in sich teilenden Zellen (und auch in „quiescenten“ Zellen in G0-Phase) nicht gefunden wird [46], wurde vermutet, dass prämature Seneszenz ähnlich wie Apoptose ein spezifisches, genetisch kodiertes Stress-Response-Programm darstellt. In Kultur imponieren seneszente Zellen durch ihr flächiges, vakuolen-reiches Zytoplasma. Diese Zellen bleiben metabolisch aktiv, doch ist über das Schicksal seneszenter Zellen in vivo wenig bekannt. Während replikative Seneszenz als ein weithin akzeptierter biologischer Zustand des hohen Zellalters nach ausgeschöpftem Teilungspotential gilt, wird das Konzept prämaturer Seneszenz durchaus kontrovers als Kultur-Artefakt mit unbekannter Signifikanz in vivo diskutiert [47]. Es wird zwar eine Akkumulation SA-β-Gal-positiver Zellen in Gewebsproben älterer Menschen gefunden [46], doch ist unklar, inwieweit prämatur seneszente Zellen durch Phagozytose rasch abgeräumt werden können. Zwar ist mittlerweile klar, dass p53 und die p16INK4a/Rb-Achse, ARF, p15INK4b und das Promyelozyten-Leukämie-Genprodukt PML eine entscheidende Rolle in der genetischen Kontrolle von prämaturer Seneszenz spielen [48, 49, 50, 51, 52], doch sind Stimulus-Effektor-Kaskaden und Querverschaltungen analog zu Apoptose-Programmen für das „Seneszenz-Netzwerk“ bisher weit weniger detailliert beschrieben.

Im Gegensatz zu pro-apoptotischen mitogenen Onkogenen gibt es Onkogene, die bevorzugt akut Seneszenz als zelluläres Failsafe-Program auslösen. Onkogenes Ras gilt als Prototyp eines Onkogens mit seneszenter Ko-Aktivität [23]. Mehrschritt-Modelle der Spinaliom-Genese aus hyperproliferativen Läsionen legen nahe, dass initiale Ras-Aktivierung zu papillomartigen Tumoren führt, die durch Spontanregression ad integrum abheilen können, wenn nicht sequentiell tumor-promovierende „Failsafe“-Defekte erworben werden [53, 54]. Interessanterweise sind mitogene und pro-seneszente Pathways dabei zumindest teilweise identisch: prämature Seneszenz infolge onkogenem Ras wird durch den mitogenen MAP-Kinase-Signalweg eingeleitet [55]. Es ist derzeit nicht klar, ob Umgebungsfaktoren (wie für onkogenes myc (siehe oben) diskutiert) das Gleichgewicht zwischen mitogener Funktion und pro-seneszenter Failsafe-Gegenregulation verschieben, oder ob die transformierende Potenz dieser Onkogen-Klasse nur in Anwesenheit kooperierender Mutationen evident wird.

1.3.5 p53 als Wächter der zellulären Integrität

p53 ist der wichtigste Mediator der zellulären Wachstumskontrolle. p53 überwacht nicht nur mehrere Zellzyklus-Checkpoints, wie beispielsweise den G1-, G2- oder sogenannten Spindel-Checkpoint, sondern ist zentral an der Exekution von Zellzyklus-Arrest und Failsafe-Programmen wie Apoptose und Seneszenz beteiligt [56, 57, 58]. Darüberhinaus kontrolliert p53 mit DNA-Reparatur, Angiogenese oder chromosomaler Stabilität noch eine Reihe weiterer Funktionen, die für die Zell- und Gewebsintegrität essentiell sind. p53 fungiert als Tumorsuppressor, weil es inadäquate Proliferationssignale registriert und zelluläre Gegenmaßnahmen ergreifen kann. Signale mitogener Onkogene wie myc oder ras führen zur Aktivierung von p53, welches dann Failsafe-Programme induziert und so zur Elimination von Zellen mit onkogener Aktivierung führt [59, 60, 61]. p53-abhängige Apoptose und Seneszenz fungieren als Schlüsselmechanismen in der Suppression von Tumorformation und –progression in vitro und in vivo [54, 62, 63]. Interessanterweise scheinen die tumorprotektive Rolle von p53 als „Wächter der zellulären Integrität“ und die damit verbundenen Failsafe-Programme ihren Preis zu fordern: Mäuse mit einer aktivierenden p53-Mutation sind zwar gegen spontane [Seite 11↓]Malignome geschützt, aber zeigen – konsistent mit einer Assoziation von Seneszenz und organismischem Altern – Zeichen einer beschleunigten körperlichen Alterung [64].

p53 ist in ein komplexes Netzwerk sogenannter „Upstream“-Regulatoren und „Downstream“-Effektoren eingebunden [57]. Ein Schlüssel-Mediator onkogener Signale zu p53 stellt beispielsweise ARF dar, welches im alternativen Leseraster (alternate reading frame) neben p16INK4a (einem Inhibitor der Rb-vermittelten G1-S-Phasen-Progression) vom wichtigen Tumorsuppressor-Lokus INK4a/ARF kodiert wird [65, 66]. Der präzise Mechanismus der INK4a/ARF-Expressionsregulation ist unklar, doch onkogenes Myc, Ras oder Bcr-Abl induzieren ARF-Protein [67, 68, 69], welches Mdm2 und damit dessen Funktion als p53-ubiquitinierende E3-Ligase inhibiert [70]. Neben ARF-vermittelten onkogenen Signalen kann beispielsweise DNA-Schädigung via Proteinkinasen wie ATM, ATR, Chk1 und Chk2 zur Induktion und Aktivierung von p53 führen [71, 72]. Es ist weithin akzeptiert, dass der onkogene und der DNA-Damage-Signalweg prinzipiell parallele p53-Upstream-Kaskaden darstellen [73, 74, 75].

Die Zahl identifizierter p53-induzierbarer Gene, sogenannter „PIGs“, wächst kontinuierlich, doch ist deren funktionelle Bedeutung und klinische Signifikanz häufig noch wenig untersucht. Wie der Transkriptionsfaktor p53 als „Relais“ unterschiedliche „Upstream“-Signale – sei es von aktivierten Onkogenen oder DNA-Schädigung – überhaupt in differentielle Antwortprogramme, also in erster Linie Arrest versus Apoptose, übersetzt, ist nicht klar. Da p53 komplex über Protein-Level, subzelluläre Lokalisation und eine Phosphorylierungs-Azetylierungskaskade aktivitäts-reguliert wird [56, 76], könnte die Steuerung dieser Größen zur Aktivierung verschiedener PIG-Sets führen. Insbesondere in der Gruppe pro-apoptotischer p53-Effektoren – um neben bax mit PERP, AIP, Puma oder Noxanur einige zu nennen [77, 78, 79, 80, 81] – scheint es Redundanzen und zelltyp-spezifische Kooperationen der Targetgene zu geben, die p53-mediiert Apoptose einleiten [82]. Unstrittig ist, dass „downstream“ der direkten pro-apoptotischen p53-Targets ein als „Apoptosom“ beschriebener ternärer Komplex unter Einschluß von Apaf-1 und Caspase 9 den wesentlichen Exekutor von p53-initiierter Apoptose darstellt [83, 84]. Als p53-Effektoren mit zellzyklus-arretierender Funktion sind im Gegensatz zur großen Gruppe der pro-apoptotischen PIGs nur wenige Gene identifiziert worden, unter ihnen der CDK-Inhibitor p21 als G1- und 14-3-3 σ als G2/M-Arrest-Vermittler [85, 86], wobei die genauen molekularen Mechanismen von lediglich temporärem gegenüber einem Langzeit-Zellzyklus-Block nicht hinreichend verstanden sind.

1.4 Genetische Defekte in Failsafe-Programmen und Post-Damage-Multi-Drug-Resistenz

1.4.1 Manifeste Malignome haben Mutationen in Failsafe-Programmen

Es ist wahrscheinlich, dass sich kein Tumor ohne Defekt in den onkogen-konternden Failsafe-Programmen manifestieren könnte [87]. Konsequenterweise tragen in vielen Entitäten und Modellsystemen p53-Mutationen zur Kanzerogenese bei [22, 88]. Konkordant mit den Beobachtungen, dass aktiviertes Myc oder die onkogene Bcr-Abl-Kinase ARF und p53 induzieren [68, 69], werden in entsprechenden manifesten Malignomen gehäuft Mutationen in diesen Tumorsuppressor-Genen nachgewiesen. Burkitt-Lymphome, die nahezu immer eine translokationsbedingte Myc-Aktivierung aufweisen, sind in etwa 30-60% der Fälle mit p53-Mutationen assoziiert [89, 90, 91]. In ähnlicher Weise finden sich in der Blastenkrise der typischerweise Bcr-Abl-positiven chronisch-myeloischen Leukämie p53-Mutationen und insbesondere INK4a/ARF-Deletionen [92, 93]. Da die meisten aktivierten Onkogene via ARF p53 und somit Failsafe-Programme induzieren, ist es nicht erstaunlich, dass p53- und INK4a/ARF-Alterationen die beiden am häufigsten detektierten Gendefekte in humanen Tumorentitäten darstellen [Seite 12↓][65, 94]. Besonders eindrucksvoll ist der Mutationsdruck, der offensichtlich auf der p16INK4a/Rb-Achse in Ras-getriebenen Malignomen lastet: Pankreaskarzinome, in denen sehr häufig aktivierende K-ras-Mutationen vorliegen, weisen in nahezu 100% der Fälle sich zumeist gegenseitig ausschließende Rb- und CDK4-Mutationen sowie vor allem p16INK4a-Defekte auf, wobei durch Promoter-Hypermethylierung in diesem Kontext gezielt die INK4a-Expression und nicht das alternative Leseraster-Produkt ARF inaktiviert wird [95].

1.4.2 Failsafe-Inaktivierung durch „extragene“ Mutationen

Die Notwendigkeit, Failsafe-Mechanismen im Zuge der Tumoretablierung zu inaktivieren, erklärt nicht zwangsläufig, warum gerade p53 und ferner INK4a/ARF so häufig Mutationsziel sind. In der Tat sind sogenannte „extragene“ Läsionen im p53-Signalweg, d.h. „upstream“, beispielsweise auf der Ebene von ARF oder Mdm2, oder „downstream“ bevorzugt in pro-apoptotischen Signalmediatoren wie Bax oder Apaf-1 beschrieben [96, 97, 98, 99, 100, 101]. Solche extragenen Defekte treten dann oft, aber keineswegs immer, nach dem Gesetz der „mutual exclusivity“ im Kontext von Wildtyp-p53 auf [99, 102]. Ferner kann die Ko-Aktivierung einer „Pro-Survival-Aktivität“ wie Bcl2 oder Bcl-xl Myc-initiierte Tumorigenese dramatisch erleichtern [15, 103, 104]. Trotz der hohen Frequenz von p53-Mutationen deutet die Präsenz dieser „extragenen“ Defekte im p53-Pathway darauf hin, dass nicht etwa alle p53-kontrollierten Effektorfunktionen gleichermaßen bedeutsame Tumorsuppressor-Aufgaben wahrnehmen.

1.4.3 Failsafe-Defekte interferieren mit Chemosensitivität

Es ist seit mehr als 25 Jahren bekannt, dass zytostatika-induzierte Tumorregression mit dem Auftreten apoptotischer Zellen vergesellschaftet ist [105], wobei der Aspekt von Apoptose als einer genetisch kodierten Signalkaskade damals noch nicht hinreichend bekannt war. Im Einklang mit der Hypothese, dass Zytostatika nicht durch massive Zellschädigung per se, sondern als apoptotische Trigger anti-neoplastisch wirken, sollten genetische Defekte in der Apoptose-Maschinerie Chemosensitivität kompromittieren. Besonders interessant ist hierbei, dass Mutationen in pro-apoptotischen Tumorsuppressor-Programmen möglicherweise simultan zu einer „Post-Damage-Resistenz“ (siehe oben) beitragen. Die gemeinsam genutzte Apoptose-Endstrecke des onkongenen und des DNA-Damage-Pathways könnte so erklären, warum Tumoren mit bestimmten Apoptosedefekten bereits a priori (d.h. vor zytostatischer Ersttherapie) „multi-drug-resistent“ sind. In der Tat wurde in präklinischen Modellen ein Zusammenhang zwischen p53-Inaktivierung und Therapieresistenz gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika gefunden [16, 106, 107, 108, 109, 110]. Auch komplexe Screening-Untersuchungen von Tumorzellinien demonstrierten eine signifikante Abhängigkeit der Chemosensitivität von funktionellem p53 [111, 112, 113]. p53-Wildtyp-Gentransfer konnte dabei in p53-defizienten Tumorzellen Chemosensitivität restaurieren [114, 115]. Obwohl klinische Studien zu weit weniger einheitlichen Ergebnissen kamen, konnte in einigen Entitäten die prognostische Relevanz des p53-Status gesichert werden [116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123]. Auch Überexpression von anti-apoptotischen Aktivitäten wie Bcl2 oder Bcl-xl reduzierte akute chemotherapeutische Zytotoxizität in vitro [124, 125], doch der klinische Einfluß dieser Faktoren auf das Langzeit-Überleben der Patienten wird kontrovers beurteilt [126, 127, 128, 129].

Apoptose ist nicht der alleinige Mechanismus, mittels dessen Zytostatika Tumorzellen eliminieren [130]. Andere letale Antwortprogramme wie Nekrose, „apoptoide“ Formen des programmierten Zelltods im Kontext spezifischer Apoptosedefekte [11] oder mitotische Katastrophe, bei der Zellen nach subletaler Schädigung noch einige Male endoreduplizieren oder nach Kurzzeit-Arrest wieder in den Zellzyklus eintreten, bevor sie als multinukleäre Zellen apoptose-ähnlich absterben [131, 132, 133] können durch Chemotherapie ausgelöst werden. Trotz der reziproken Beziehung von zytostatika-[Seite 13↓]induzierbarer Apoptose und resistenz-vermittelnden Apoptosedefekten ist daher nicht klar, inwieweit Apoptose zum klinischen „Outcome“ nach Chemotherapie beiträgt [134]. Zu dieser Unsicherheit kommt hinzu, dass Zytostatika anhaltenden Zellzyklus-Arrest auszulösen vermögen [135, 136]. DNA-Schädigung kann in vitro Seneszenz-Marker induzieren, doch fehlten bislang Untersuchungen über Auftreten und Relevanz von zytostatika-induzierter Seneszenz in vivo[43]. Tumorentwicklungsbedingte Defekte in Failsafe-Programmen wie Apoptose und Seneszenz kausal für Therapieversagen und schlechtes Patientenüberleben anzuschuldigen, ist daher eine attraktive, aber unbelegte Hypothese.

1.5 Restriktionen konventioneller Testsysteme

Da die meisten Zytostatika nicht als „targeted Therapeutics“ im Sinne eines Schlüssel-Schloß-Prinzips gegen tumorexklusive Läsionen, sondern auf dem Boden empirischer Daten entwickelt wurden, sind die molekularen Grundlagen ihres Wirkmechanismus und damit des Chemoresistenz-Problems nur unzureichend verstanden. Experimentelle Systeme zur Untersuchung genetischer Einflußfaktoren von Chemoresistenz bedienen sich in erster Linie gut charakterisierter und daher oft jahrelang passagierter, hochgradig kultur-adaptierter Tumorzellinien. Darüberhinaus werden Therapiestudien zumeist „in petri“ durchgeführt, lassen also wesentliche Aspekte des Tumor-Mikromilieus in vivo außer acht, oder basieren auf Xenotransplantaten humaner Tumorproben in Nacktmäusen, wo neben der Spezies-Barriere, dem hierbei notwendigen Immundefekt der Mäuse und der typischerweise ektopen Implantation wiederum häufig Multi-Passagen-Tumorzellinien zum Einsatz kommen.

Dennoch wurden grundlegende und wegweisende Erkenntnisse über den Zusammenhang von genetischen Defekten und Therapie-Ansprechen in Zellkultur-Systemen gewonnen. Insbesondere der systematische Ansatz, den akut wachstums-inhibierenden Effekt von über 60.000 potentiell antineoplastischer Substanzen gegenüber 60 standardisierten Tumorzellinien des National Institute of Cancer (NCI) zu testen, konnte darlegen, dass die meisten Wirkstoffe in p53-intakten Zellinien potenter wirkten [111, 112]. Aus den mittels Mikroarray-Technik erhobenen Genexpressionsdaten dieser 60 NCI-Zellinien ergeben sich nun neuartige bioinformatische Ansätze, auch komplexe Signalnetzwerke mit Zytostatika-Sensitivitätsprofilen mehrdimensional zu korrelieren [113, 137, 138]. Neben der problematischen Auswahl „gut charakterisierter“ Tumorzellinien (siehe oben) erscheint es fraglich, inwieweit das Wachstumsverhalten der Zellen evaluiert binnen weniger Stunden nach Wirkstoffzusatz als valider Surrogat-Marker für den Therapieverlauf entsprechender Tumorentitäten in vivo fungieren kann.

Als Gold-Standard zur Testung chemotherapeutischer Langzeit-Effekte in vitro gelten daher klonogene Überlebensassays. Hierzu werden Zellen nach Präinkubation mit Zytostatika in niedriger Dichte im Kulturmedium ausgesät und nach Tagen bis Wochen nachweisbare Proliferationsinseln ausgezählt. Die klonogene Entstehung dieser Zellkolonien ist dabei nicht nur vom Überleben, sondern auch von der verbliebenen Teilungsfähigkeit nach Zytostatikabehandlung abhängig, da nicht-apoptotische, aber langzeit-arretierte Zellen keine signifikanten Kolonien bilden können. Insbesondere tragen klonogene Assays – im Gegensatz zu Kurzzeit-Zytotoxizitätsassays – der Annahme Rechnung, dass Apoptose zwar ein relevanter Akut-Mechanismus nach Chemotherapie sei und damit die initiale Absterberate einer Tumorzell-Population, nicht aber deren Gesamt-Überleben beeinflusse, da apoptosedefekte Tumorzellen möglicherweise lediglich verzögert untergingen [139]. Tatsächlich gelang es in zahlreichen Arbeiten nicht, mittels einfacher klonogener Überlebensassays einen Beitrag apoptose-regulierender Gene wie p53 oder bcl2 zur Langzeit-Therapieempfindlichkeit von Tumorzellen zu belegen [132, 140, 141, 142, 143]. Dies führte zu der interessanten Überlegung, dass [Seite 14↓]Apoptosedefekte keinen differentiellen Therapie-Beitrag leisten könnten, weil sie ohnehin immanenter Aspekt eines jeden manifesten Malignoms seien [139].

Diese Sichtweise – durchaus im Widerspruch zu Daten klinischer Untersuchungen (siehe oben) – wurde durch modifizierte klonogene Überlebensassays in frage gestellt, in denen spezifische Aspekte des Tumor-Mikromilieus berücksichtigt wurden und die nun in der Lage waren, die Abhängigkeit des Langzeit-Therapieeffekts von anti-apoptotischen Aktivitäten zu demonstrieren [144, 145]. Durch Zusatz von Mikromilieu-Faktoren, Ko-Kultivierung mit Stromazellen oder die Erzeugung komplexer, genetisch chimärer Umgebungsbedingungen wurde dabei deutlich, dass isolierte Tumorzellen in artefiziellen Testsystemen die Biologie und Chemosensitivität natürlich wachsender Tumoren nur sehr bedingt rekapitulieren können [146, 147, 148].

Konsequenterweise sollte man erwarten, dass die Untersuchung von primärem Tumormaterial für die Beurteilung potentiell resistenz-vermittelnder Gendefekte geradezu ideal sein müsse. Allerdings stellen selbst Proben einer nosologisch eng gefaßten Entität ein genetisch sehr heterogenes und dabei uncharakterisiertes Untersuchungsgut dar. Insbesondere die Rolle nicht erfaßter „extragener“ Läsionen (siehe oben) ist für die Stratifikation des Materials problematisch, da sie einen Signalweg kompromittieren können, ohne dass Mutationen im eigentlichen Kandidatengen zum Nachweis kommen. Hierin liegt vermutlich ein wesentlicher Grund, warum es in vielen klinischen Studien nicht gelang, den p53-Status – dabei oft nur angenähert mittels Immunhistochemie und nicht via Gensequenzierung bestimmt – mit Therapieerfolg positiv zu korrelieren. Darüberhinaus ist die bioptische Gewinnung einer relevanten Anzahl (und hinreichenden Menge) an Tumorproben mit zumindest klinisch und histopathologisch vergleichbaren Erkrankungsparametern praktisch kaum zu erzielen.

1.6 Fragestellung

Nicht nur einige klinische Studien, sondern in vitro-Experimente, in denen kultur-naïve, primäre Zellen mit definierten genetischen Läsionen – d.h. embryonale Fibroblasten beispielsweise von p53-Knockout-Mäusen – durch Transduktion mit aktivierenden Onkogenen akut transformiert wurden, deuteten auf eine zentrale Bedeutung der p53-Achse für die Sensitivität gegenüber Chemotherapie hin (siehe oben). Allerdings ist keiner der bisher diskutierten experimentellen Ansätze in der Lage, die Rolle von Kandidatengenen in spontan entstehenden Primärtumoren im Kontext ihres physiologischen Mikromilieus systematisch zu untersuchen. In der Tat kann bis dato keine einzige Arbeit belegen, dass etablierte Tumorzellinien die Therapiesensitivität der Patienten, aus denen sie hervorgegangen sind, widerzuspiegeln vermögen. Es ist daher die Fragestellung dieser Habilitationsschrift, in einem Modellsystem primärer Tumoren mit genetisch definierten Läsionen die Kurz- und Langzeiteffekte klassischer Chemotherapie zu untersuchen und dabei insbesondere die überlappende Rolle zellulärer Kontrollprogramme unter Tumorentstehung und Tumortherapie näher zu beleuchten.


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21.04.2005