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2  Hauptteil – Eigene Arbeiten

2.1 Die Eµ-myc-transgene Lymphom-Maus als physiologisches und versatiles Chemotherapie-Modell

Um genetische Grundlagen der Tumorentstehung und Mechanismen der Chemoresistenz in einem wirklichkeitsnahen Modell untersuchen zu können, wurde ein transplantables, onkogen-getriebenes Lymphom-Modell auf dem Boden der Eµ-myc-transgenen Maus etabliert [151, 152]. Eµ-myc-transgene Mäuse entwickeln binnen weniger Monate spontan klonale B-Zell-Lymphome mit Begleitleukämie. Das Eµ-myc-Transgen entspricht der t(8;14)-Translokation, wie sie häufig in humanen Lymphomen mit dereguliertem myc vorliegt, und wird infolge Immunglobulin-Schwerketten-Promotor-Kontrolle B-Zell-restringiert exprimiert. Darüberhinaus ähneln Spontanapoptose-Index, „Sternenhimmel-Histologie“ und Leukämie der murinen Erkrankung sehr dem Bild des humanen Burkitt-Lymphoms mit akuter lymphatischer Leukämie im Sinne einer L3-B-ALL. Das Spektrum einer größeren Zahl individueller primärer myc-Lymphome reflektiert dabei eine Varianz, wie sie auch durch Tumoren verschiedener Patienten, aber derselben Entität, gegeben ist. Durch Palpation der zervikalen, axillären und subskapularen Lymphknoten sowie periphere Blutausstriche kann der Verlauf der Erkrankung in den Mäusen zuverlässig und effizient überwacht werden. Behandlung mit γ-Bestrahlung oder Zytostatika wie Cyclphosphamid oder Adriamyzin führt akut zur p53-Induktion und Apoptose der Lymphomzellen in vivo und hat typischerweise anhaltende Remissionen zur Folge. Regelmäßige Überwachung der behandelten Tiere mittels Lymphknoten-Palpation oder Monitoring des peripheren Bluts (Leukozytenzählung, Ausstrich) erlaubt die Bestimmung der Remissionszeit, also ob und wann nach behandlungsinduzierter Remission ein Relapse auftritt. Repetitive Behandlung rekurrenter Lymphome führt über progressiv verkürzte Remissionszeiten schließlich zur Therapieresistenz und rekapituliert somit klinische Verläufe von Lymphom-Patienten unter Chemotherapie. Isolierte Lymphomzellen können kultiviert werden oder systemisch, d.h. über intravenöse Injektion, in nicht-transgene, syngene Mäuse transplantiert werden, wobei die entstehenden disseminierten Neoplasien von den Malignomen in primär-transgenen Mäusen histopathologisch ununterscheidbar sind. Der Einsatz transplantierter Mäuse ist für die akkurate Bestimmung von Remissionszeiten wichtig, um in behandelten Mäusen einen Relapse von einem transgen-induzierten Sekundär-Lymphom zu unterscheiden und erlaubt die Behandlung maligner Zellen im Umfeld normaler, nicht-transgener Lymphozyten, also in einem Kontext, wie er im Patienten mit klonaler Tumorerkrankung vorliegt. Des weiteren ermöglicht serielle Transplantation auch die „Vervielfältigung“ desselben Lymphoms in zahlreichen Empfängermäusen. Damit kann ein indivuelles Lymphom mit und ohne Therapie verglichen werden, es können zu verschiedenen Zeiten nach Therapie Tumorproben gewonnen werden oder verschiedene Therapieverfahren gegenüber demselben Tumor getestet werden. Es ist technisch unmöglich, derartige Daten im Zuge der klinischen Behandlung von Lymphompatienten zu gewinnen.

Eine weitere Stärke des Modells liegt in seiner genetischen Versatilität, d.h. der Möglichkeit, Tumoren mit genetisch definierten Defekten zu erzeugen. So kann nach Kreuzung mit „Knockout“-Mäusen, d.h. Mäusen mit Keimbahn-Deletionen bestimmter Gen-Loki, in der F1-Generation der potentielle Einfluß dieser Läsion auf die Lymphom-Manifestationszeit und Tumorbiologie erfaßt werden. Prinzipiell wird hierbei ein Target-[Seite 16↓]Lokus nur heterozygot inaktiviert, so dass bei Kandidatengenen mit mutmaßlicher Tumorsuppressor-Funktion, die selten defekt-dominant oder haploinsuffizient ist, kein genereller Phänotyp auftritt. Allerdings entspricht ein heterozygoter Gendefekt bereits dem ersten „Hit“ der klassischen „Two-Hit-Hypothese“ zur Inaktivierung eines Tumorsuppressor-Lokus [153]. Damit erzeugt eine heterozygote Läsion einen Locus minoris resistentiae, gegen den im onkogen-aktivierten Zielgewebe erleichtert selektiert werden kann. Gerade in der Maus erfolgt die vollständige Inaktivierung des Lokus bevorzugt über allele Deletion des verbliebenen Wildtyp-Allels (als sog. Loss-of-Heterozygosity, LOH). Die so auf das Tumorgewebe begrenzte „Null“-Situation kann daher in den meisten Fällen durch einfache allel-spezifische PCR aus genomischer Tumor-DNA nachgewiesen werden. Neben der Beschleunigung der Lymphomentstehung ist LOH des Kandidatenlokus ein weiterer starker Hinweis für die funktionelle Bedeutung eines Genes in der Tumorigenese oder – später – auch in der Therapieantwort. Die Einkreuzung lediglich heterozygoter Läsionen hat darüberhinaus den Vorteil, dass die Akutizität eines LOH-Ereignisses die Mutationsdynamik spontaner Tumorentwicklung rekapituliert. Gerade bei Gen-Familien mit partiell redundanter Funktion, z.B. die p53/p63/p73- oder die Rb/p107/p130-Familien, wäre es vorstellbar, dass ein homozygoter Defekt embryonal kompensiert wird und so keinen Phänotyp zeigt, obwohl der akute Verlust eines dieser Gene funktionell durchaus relevant ist.

Auch retroviral lassen sich genetisch definierte Läsionen im Eµ-myc-System erzeugen: Kandidatengene oder dominant-negative Aktivitäten können durch Infektion mittels entsprechender retroviraler Konstrukte stabil und effizient in isolierte und kurzzeit-kultivierte Lymphomzellen eingebracht werden. Als Derivat des ekotropen MMLV (mouse moloney leukemia virus)-Retrovirus wurde durch wiederholte Zellpassage und weitere Modifikationen das murine MSCV (murine stem cell virus) Retrovirus gewonnen, welches (im Gegensatz zur MMLV) auch in murinen B-Zellen und hämatopoietischen Stammzellen über Monate exprimiert wird. In den hier vorgestellten Arbeiten wurde grundsätzlich eine bizistronische MSCV-Vektorkassette verwendet, bei der Kandidaten-cDNAs vor die „internal ribosomal entry site“ (IRES) kloniert werden können, woraufhin die eGFP-cDNA für grün fluoreszeierendes Protein als zweite kodierende Sequenz folgt. Daher exprimieren nach retroviraler Infektion prinzipiell alle GFP-positiven Zellen auch das Kandidatengen. Die GFP-Koexpression dient somit nicht nur zur Abschätzung der Infektionseffizienz, sondern kann auch für einfache Durchfluß-Zellsortung und zur Zellüberwachung in vivo eingesetzt werden. Das Infektionsprotokoll erlaubt, binnen maximal vier Tagen frisch isolierte Lymphomzellen hochtitrig mit nicht-replizierenden Retroviren mit guter Infektionseffizienz (d.h. > 70%) stabil zu transduzieren. „Leervektor-“ bzw. MSCV-IRES-GFP-infizierte Zellen exprimieren GFP, wobei infizierte Zellen nach Transplantation in Empfängermäusen zu GFP-positiven Lymphomen und Leukämien führen, die ihrerseits fluoreszenzmikroskopisch im Ausstrich oder durchflußzytometrisch nach erneuter Lymphomzell-Isolation erfaßt werden können. Im Gegensatz zu genetischen Läsionen, die über Verpaarung genetisch veränderter Mäuse eingeschleust wurden, erlauben retrovirale Infektionen mit Kontroll- und Kandidatengen-Vektoren identischer Aliquots desselben Ausgangslymphoms die Erzeugung von Lymphom-Populationen, die beide GFP-positiv sind, sich ansonsten aber nur im Status des Testgens unterscheiden. Somit können Serien derartiger Paare aus primären Lymphomen erzeugt und deren biologisches Verhalten in Abhängigkeit des Testgens untersucht werden, ohne dass etwaige Begleitmutationen bekannt sein müssen.

2.2  p53- und INK4a/ARF-Mutationen akzelerieren die Lymphomgenese und tragen zu Chemoresistenz bei

Durch Verpaarung Eµ-myc-transgener mit p53+/- Mäusen werden in der F1-Generation unter anderem myc-transgene Nachkommen erzeugt, die entweder für p53 heterozygot sind oder aber keinen definierten Defekt in diesem Lokus aufweisen. Beide Genotypen entwickeln myc-abhängig Lymphome, jedoch mit unterschiedlicher Latenz. Während nach 70 Tagen Kontroll-Lymphome – das sind myc-Lymphome ohne definierte genetische Läsion – in weniger als 25% der Tiere nachweisbar waren, fand sich in der p53+/- Gruppe zu diesem Zeitpunkt kein einziges lymphom-freies Tier mehr. Entsprechend wiesen die in p53+/- Mäusen entstehenden Lymphome in nahezu allen Fällen eine allele Deletion des verbliebenen Wildtyp-Allels auf, sind also de facto p53null.

In ähnlicher Weise führte auch die Einkreuzung eines heterozygoten INK4a/ARF-Defekts – präzise der Deletion von Exon 2 und eines Teils von Exon 3, wodurch beide Genprodukte, ARF und p16INK4a, von diesem Allel nicht mehr exprimiert werden können – zur einer dramatischen Lymphom-Akzeleration, deren Außmaß dem zuvor beschriebenen Effekt bei p53-Inaktivierung gleich kommt. Auch im Falle des INK4a/ARF-Lokus wurde in den meisten Lymphomen ein LOH des Wildtyp-Allels nachgewiesen, so dass diese Tumoren „Null“-Mutanten beider INK4a/ARF-Genprodukte darstellen. Um einzugrenzen, ob ARF- oder aber INK4a-Gene das primäre Selektionsziel des INK4a/ARF-LOH darstellen, wurden auch Rb-Knockout- mit myc-transgenen Mäusen verpaart. Zum Zeitpunkt dieser Studie war eine „pure“ INK4a-Knockout-Maus noch nicht verfügbar; entsprechend fungierte der Rb-Defekt als Surrogat für einen alleinigen INK4a-Defekt. Die Lymphome, die im myc x Rb+/- Hintergrund erzeugt wurden, traten nur geringfügig beschleunigt auf und blieben für den Rb-Lokus stets heterozygot, so dass hier ARF als Vermittler im onkogenen Signalweg von Myc zu p53 mutmaßlich die entscheidende tumorsuppressive Rolle zukommt. Entsprechend wurde in Lymphomen aus doppelt-heterozygotem Hintergrund, d.h. INK4a/ARF+/-p53+/-, nur das verbliebene p53-Allel, aber nie beide Allele im Sinne einer zusätzlichen Selektion gegen die INK4a-Komponente inaktiviert. Nicht nur basale, sondern auch mittels in vivo-Zytostatika-Therapie induzierte p53-Proteinlevel wurden in INK4a/ARFnull-Lymphomen im Vergleich zu Kontroll-Lymphomen deutlich reduziert gemessen, wobei neben der reduzierten Proteinlevel auch eine eingeschränkte Aktivierbarkeit beispielsweise des p53-Targetgens p21 auffiel. Auch die regelrechte Phänokopie der Tumor-Inzidenzkurven stützt die Hypothese, dass p53-vermittelte Failsafe-Mechanismen direkt von ARF-mediierten onkogenen Stimuli abhängen.

p53null- und INK4a/ARFnull-Lymphome wachsen gleichermaßen disseminierter und aggressiver als Kontroll-Lymphome, in dem sie insbesondere in viszerale Organe außerhalb des lymphatischen Kompartments infiltrieren. Dabei proliferieren alle drei Genotypen mit vergleichbarer mitotischer Aktivität; und nur p53-defiziente Lymphome zeigen offenkundig Aneuplodie. Allerdings konnte sowohl in p53null- als auch in INK4a/ARFnull-Lymphomen kompromittierte Spontan-Apoptosefähigkeit als entscheidender gemeinsamer Defekt identifiziert werden. Interessanterweise zeigten unter Therapie, d.h. nach Cyclophosphamid-Applikation in vivo, nicht nur p53null-, sondern auch INK4a/ARFnull-Lymphome einen reduzierten Therapie-Effekt: in Lymphom-Gewebsschnitten vier Stunden nach Zytostatikagabe war kaum Apoptose nachweisbar, während Kontroll-Lymphome hier in der TUNEL-Reaktion, einem Nachweis apoptose-relevanter DNA-Doppelstrangbrüche, massiv positiv reagierten. Über derartige Akut-Effekte hinaus demonstrierten Mäuse mit p53null-Lymphomen auch in der Langzeitbeobachtung einen dramatischen Chemosensitivitäts-Defekt; nach etwa 40 Tagen waren nur noch etwa 20% der Tiere in Remission. INK4a/ARFnull-Lymphom-tragende Mäuse erreichten etwas längere Remissionszeiten, zeigten jedoch ebenfalls ein signifikant schlechteres tumorfreies Überleben im Vergleich zu der Kontrollgruppe.


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2.3  Apoptosedefekte kompromittieren die Chemosensitivität von Tumoren in vivo

Um die Rolle eines strikt anti-apoptotisch wirksamen Kandidatengens auf die Chemosensitivität von myc-Lymphomen zu untersuchen, wurden identische Aliquots frisch isolierter Kontroll-Lymphome einerseits mit einem „GFP-only“-Vektor und andererseits mit einem MSCV-bcl2-IRES-GFP-Konstrukt retroviral transduziert, so dass Paare derselben Ausgangslymphome erzeugt wurden, die sich nur in der genomischen Integration von transgenem bcl2 unterschieden (sog. „matched pairs“). Die erfolgreiche Infektion wurde durchflußzytometrisch und mittels Westernblot nachgewiesen. Darüberhinaus wurde in Zellkultur demonstriert, dass Bcl2-Überxpression – erwartungsgemäß – den „Steady-State“-Anteil lebender Zellen erhöht sowie die Fraktion in Apoptose befindlicher Zellen reduziert, aber keinen Einfluß auf die Proliferationsrate hat. In Kurzzeit-Zytotoxizitätsassays waren Bcl2-überexprimierende Lymphome gegenüber verschiedenen Zytostatika deutlich chemoresistenter als ihre leervektor-transduzierten Pendants. Interessanterweise nahm dieser Unterschied allerdings bereits durch eine vierwöchige Kultur-Adaptation der Lymphom-Populationen erheblich ab, was sich durch eine zunehmende Resistenzgewinnung insbesondere der zuvor sehr sensitiven Kontroll-Gruppe erklärte. In klonogenen Überlebensassays nach Zytostatika-Präinkubation fand sich hingegen kein Überlebensvorteil für die Bcl2-überexprimierende Gruppe. Erst nach Zugabe von Interleukin-7 (IL-7), einem B-Zell-stimulierenden Zytokin, das natürlicherweise im Lymphknoten-Milieu angeboten wird, konnte ein tendenzieller Vorteil der Bcl2-Gruppe festgestellt werden. Die ausgesprochen schlechte Plattierungseffizienz primärer Lymphomzellen bei der für diesen Test erforderlichen sehr niedrigen Zelldichte in semi-solidem Medium ließ sich dabei sowohl durch IL-7-Zugabe, als auch mittels vorausgegangener Kultur-Adaptation der Zellen verbessern, wobei insbesondere Kontroll-Lymphomzellen profitierten. Die Sequenzierung manifester Kolonien am Ende der Beobachtungszeit hinsichtlich des p53-Status zeigte, dass Kontroll-Lymphome in der Mehrzahl der Fälle p53-Mutationen akquiriert hatten, also faktisch in vielen Fällen die Langzeit-Chemosensitivität von Bcl2-überexprimierenden mit der von p53-defekten Tumorzellen verglichen wurde. Während die Effekte nach Supplementierung von IL-7 verdeutlichen, dass die lokale Tumorumgebung Einfluß auf die Therapieantwort hat und diese Faktoren „in petri“ ungewürdigt bleiben, gilt generell für klonogene Überlebensassays, dass die initial notwendige niedrige Ausgangszelldichte und die artefiziellen Kulturbedingungen Konditionen schaffen, wie sie in keiner sich entwickelnden Tumorerkrankung in vivo vorkommen. Konsequenterweise wird daher in Kultur für Mutationen selektiert, die Wachstum unter diesen Bedingungen ermöglichen und Resistenz gegenüber Chemotherapie in vitro vermitteln. Darüberhinaus versagen die Assays in der Diskriminierung von Zelltod gegenüber Langzeit-Arrest, da nur sich aktiv teilende, d.h. „klonogene“ Zellinseln gemessen werden. Somit stellen die erhobenen Daten die Validität klonogener Überlebensassays für die Beurteilung von Langzeiteffekten nach Chemotherapie, insbesondere der Vorhersage von Therapieantworten der korrespondierenden Tumoren in ihrem natürlichen Habitat in vivo in frage.


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Wurden jedoch dieselben Lymphomzellen – als Primärlymphom in der ursprünglichen myc-transgenen Maus, als nicht-transduziertes, aber transplantiertes Lymphom, als leervektor-transduziertes und transplantiertes Lymphom oder schließlich als transplantiertes, Bcl2-überexprimierendes Lymphom – in situ miteinander verglichen, unterschieden sich die drei erstgenannten Gruppen in ihren Wachstumscharakteristika und insbesondere ihrer spontanene Apoptoseneigung nicht, so dass sich kein Anhalt für eine Beeinflussung der Tumorbiologie durch entweder Transplantation oder Transduktion per se ergab, während Bcl2-überexprimierende Lymphome nahezu keine Spontanapoptose zeigten und – interessanterweise – zu deutlich ausgeprägterer Invasion nicht-lymphatischer Organe neigten. Auch wenige Stunden nach systemischer Cyclophosphamid-Applikation verhielten sich nicht-transduzierte und leervektor-infizierte Kontroll-Lymphome im Sinne massiver Apoptose gleich, wohingegen in der Bcl2-Gruppe selbst nach Behandlung kaum apoptotische Zellen zum Nachweis kamen. Mischpopulationen aus Bcl2-überexprimierenden und nicht-transduzierten Zellen desselben Ausgangslymphoms selektierten dabei unter Behandlung für eine deutliche Zunahme der GFP-positiven, d.h. bcl2-transduzierten Population. Obwohl in klonogenen Überlebensassays unerkannt, führte Bcl2-Überexpression auch in der Post-Therapie-Langzeitbeobachtung einer Mauskolonie mit entsprechend retroviral infizierten Lymphomen nachhaltig zu Chemoresistenz: nach weniger als 25 Tagen war keine Maus der Bcl2-Gruppe mehr tumorfrei, während in der Kontroll-Gruppe, ähnlich wie bei nicht-transduzierten Kontroll-Lymphomen [154], Langzeit-Remissionen von über 60% beobachtet wurden. Im direkten Vergleich von 15 individuellen „matched pairs“ fand sich stets eine mindestens gleichermaßen kurze, wenn nicht deutlich reduzierte Remissionszeit für das Bcl2-überexprimierende Lymphom gegenüber dem leervektor-transduzierten Aliquot desselben Ausgangslymphoms.

2.4 Apoptose ist die einzige p53-Effektorfunktion zur Suppression myc-initiierter Lymphome

p53 ist das am häufigsten mutiert vorgefundene Tumorsuppressorgen in humanen Tumorentitäten. Da p53 eine Vielzahl zellulärer Effektorfunktionen – unter anderem Apoptose, Zellzyklus-Checkpoints, Arrest, Seneszenz und genomische Integrität – kontrolliert, bleibt in p53-defekten Tumoren unklar, welche dieser Funktionen anti-onkogenen Failsafe-Mechanismen entsprechen und daher Ziel kompromittierender Mutationen sind, und welche Funktionen lediglich als „Nebenprodukt“ der p53-Inaktivierung verloren werden, ohne eigentlich zum malignen Phänotyp beizutragen. Untersuchung von p53-mutiertem Tumormaterial kann diese Frage problem-immanent nicht klären, und die Suche nach relevanten p53-Tumorsuppressorfunktionen in Tumorproben mit Defekten spezifischer Effektorfunktionen hat allenfalls korrelativen Charakter. Es wurden daher in einem auf Einzelzellebene kompetitiven in vivo-Ansatz Eµ-myc-transgene hämatopoietische Stammzellen mit heterozygotem p53-Status mit anti-apoptotischen Aktivitäten konfrontiert, d.h. retroviral transduziert. Diese Aktivitäten – bcl2 und eine dominant-negative Caspase 9 (C9DN) – wurden zuvor in Kurzzeit-Zytotoxizitätsassays und in einer Lymphom-Expansionsstudie in vivo nach retroviralem Transfer in Kontroll- und p53null-Lymphome getestet. Hierbei reduzierten beide Aktivitäten sowohl spontane als auch therapie-induzierte Apoptose erheblich, wohingegen dieser Effekt in den ohnehin therapie-insensitiven p53null-Lymphomen nahezu fehlte. Auf etwa 10% GFP-positive Zellen eingestellte Mischpopulationen (analog zur oben beschriebenen Arbeit [155]) von Kontroll-Lymphomen, nicht aber von p53null-Lymphomen, reicherten während der Tumorexpansion in Empfängermäusen zuverlässig [Seite 20↓]für die anti-apoptotischen Aktivitäten an. Im Einvernehmen mit Bcl2 als auch partial p53-unabhängiger anti-apoptotischer Aktivität erreichten im p53null-Kontext lediglich bcl2-transduzierte Zellen einen mäßigen Selektionsvorteil.

Die retrovirale Transduktion von hämatopoietischen Stammzellen aus myc-transgenen, fetalen Lebern erlaubt nun die Einschleusung von Genen vor der eigentlichen Lymphomgenese, so dass in letal bestrahlten, stammzell-rekonstituierten Empfängermäusen Lymphome dann in Abhängigkeit dieser Läsionen entstehen, wenn sie zugleich GFP exprimieren. Myc-Lymphome, die sich im p53+/- Kontext entwickelt haben, sind, wie oben berichtet, nahezu ausnahmslos durch LOH des Tumors p53-defizient [154]. Durch Transfer anti-apoptotischer Aktivitäten in p53+/- hämatopoietische Stammzellen kann nun getestet werden, ob bcl2 oder C9DN effektiv vor Verlust des p53-Wildtypallels schützen, da die retroviral eingebrachten Aktivitäten exprimiert werden, bevor das erst in der B-Zell-Entwicklung angeschaltete (Eµ-)myc-Transgen gegen p53 selektieren kann. Im Gegensatz zu Lymphomen, die aus Leervektor-transduzierten myc-transgenen p53+/+ Stammzellen mit erwartet verzögerter Inzidenz hervorgehen, entwickeln sich alle aus p53+/- Stammzellen hervorgehenden Lymphome konstrukt-unabhängig gleichermaßen dramatisch rasch. Während hier Leervektor-Kontrollen nur sporadisch und bcl2-Infektanten immer GFP-positiv sind, exprimiert nur ein Teil der aus C9DN-transduzierten Fetalleberzellen hervorgegangenen Lymphome trotz identischer Onset-Kurven GFP. Die C9DN-Lymphome, die GFP-positiv sind, zeigen jedoch ebenso wie die Bcl2-abhängig entstandenen Lymphome keinen Verlust des verbliebenen p53-Wildtyp-Allels, während die GFP-negativen und damit nicht C9DN-exprimierenden Lymphome genauso wie Leervektor-Kontrollen stets p53 homozygot inaktvieren. Blockade p53-mediierter Apoptose ist daher hinreichend, um im Kontext myc-initiierter Onkogenese vor Selektion gegen p53 zu schützen.

Histologie und Fluoreszenz-Aufnahmen lebender Mäuse mit GFP-markierten Tumoren dokumentieren, dass Kontroll-Lymphome prinzipiell die Grenzen des lympho-hämatopoietischen Systems respektieren. Ein Apoptosedefekt, ob durch p53-Verlust oder aber durch Expression einer anti-apoptotischen Aktivität in p53-profizienten Zellen, ist dabei hinreichend, um Lymphomzellen aggressiv im Sinne einer destruierenden Invasion in nicht-lymphatische Kompartimente (wie beispielsweise dem Lungenparenchym) oder disseminiert im Sinne einer diffusen Tumoraussaat expandieren zu lassen. In der Tat ließ sich in bcl2- oder C9DN-transduzierten p53+/- Lymphomzellen kompromittierte Apoptose als der einzige p53-Effektordefekt sichern: Lymphome mit heterozygotem p53-Status infolge bcl2- oder C9DN-Einschleusung in die entsprechenden Stammzellen konservieren einen intakten DNA-Schaden-sensiblen G1- und G2- sowie Spindel-Kontrollpunkt und induzieren p21 erwartungsgemäß infolge Bestrahlung. Ebenfalls im Gegesatz zu p53-defizienten Lymphomen bleiben sie zumeist pseudo-diploid und behalten reguläre Chromosomenzahlen. Damit ist Apoptose die einzige p53-Effektorfunktion, gegen die im Zuge myc-getriebener Lymphomgenese selektiert wird und die daher natürlicherweise Tumorentstehung supprimiert. Demgegenüber werden Defekte in Zellzyklus-Kontrollpunkten oder Aneuploidie häufig in p53-defizienten Tumoren vorgefunden, tragen aber zum malignen Phänotyp nicht bei.

2.5 Seneszenz ist ein prognostisch relevantes p53- und p16INK4a-kontrolliertes Therapie-Erfolgsprogramm

Vorarbeiten mit p53null- gegenüber Bcl2-überexprimierenden Lymphomen haben [Seite 21↓]gezeigt, dass ungeachtet minimaler Langzeitremissionsraten in beiden Gruppen das initiale Ansprechen auf Cyclophosphamid (CTX) sehr unterschiedlich ist [154, 155]. Während in der Tumorigenese myc-initiierter Lymphome Apoptose als die einzige tumorsuppressive p53-Effektorfunktion identifiziert werden konnte und Bcl2-überexprimierende Lymphome daher trotz intaktem p53 die Aggressivität von p53null-Lymphomen phänokopieren können [159], stellte sich nun die Frage, inwieweit Apoptose gleichsam die entscheidende oder gar alleinig relevante p53-Funktion im Kontext DNA-schädigender Therapie sein würde.

Dynamische Ganzkörper-Fluoreszenz-Aufnahmen lebender Mäuse mit GFP-markierten Lymphomen der genannten Genotypen veranschaulichen, dass leervektor-infizierte Kontroll-Lymphome nach Therapie rasch und dauerhaft in Remission gehen, während dies für p53null-Lymphome nur verzögert der Fall ist und es frühzeitig zum Relapse kommt. Dagegen sprechen Bcl2-überexprimierende Lymphome initial gar nicht an, behalten dann aber über längere Zeit eine relativ konstante Tumorbelastung. Auch die Überlebenskurven im Kaplan-Meier-Format spiegeln dies wieder: sowohl die strikt anti-apoptotische Bcl2-Läsion, als auch p53-Verlust verhindern lang-anhaltende Remissionen. Allerdings leben Mäuse mit Bcl2-überexprimierenden Kontroll-Tumoren nach CTX-Therapie trotz fehlender Remissionen wesentlich länger als Mäuse mit p53null-Lymphomen, wobei die erstgenannte Gruppe das hervorragende Gesamtüberleben der Kontroll-MSCV-Gruppe nicht erreicht. Das Initialansprechen auf CTX reflektiert also nicht zwangsläufig den Langzeit-Verlauf, wobei das diesbezüglich unterschiedliche Verhalten von Bcl2-überexprimierenden gegenüber p53-defizienten Lymphomen auf eine therapie-relevante, nicht-apoptotische p53-Funktion hinweist. Diese Funktion verlängert – zusätzlich zu therapie-induzierter p53-abhängiger Apoptose – das Langzeitüberleben unter Chemotherapie.

Um nicht-apoptotische Therapie-Effekte überhaupt messen zu können, wurden myc-transgene Lymphome aus bcl2-transduzierten hämatopoietischen Stammzellen generiert. Diese Lymphome weisen, wie gezeigt [159], keinen Selektionsdruck gegen die p53-Achse auf und sind darüberhinaus vor zytostatika-induzierter Apoptose geschützt [155]. Paare dieser Lymphome transplantiert in Empfängermäuse können nun direkt miteinander verglichen werden – einmal als unbehandeltes, einmal als behandeltes Lymphom sieben Tage nach CTX-Applikation. Tatsächlich induziert CTX ein komplettes Sistieren der Teilungsaktivität und anhaltend hohe p53-Proteinlevel. p53null-Lymphome, unabhängig von ihrem Bcl2-Status, zeigen dagegen keinen zytostatika-mediierten Arrest, sondern proliferieren unter CTX. Werden p53+/-;bcl2-Lymphome [159] wiederholt mit CTX behandelt, so wird nun gegen das p53-Wildtyp-Allel in vivo selektiert. p53 kontrolliert daher ein CTX-induzierbares Langzeit-Arrest-Programm.

Wie in Vorarbeiten berichtet, beschleunigen INK4a/ARFnull-Defekte myc-initiierte Lymphomgenese in vergleichbarem Ausmaß wie p53-Inaktivierung [154]. Dies gilt in ähnlicher Weise auch für Lymphome, die lediglich auf dem Boden eines heterozygoten ARF-Defekts entstehen, bei denen also die INK4a-Komponente dieses komplexen Lokus intakt ist. Alle so erzeugten Lymphome exprimieren kein ARF-Protein mehr und sind daher „ARFnull”. Während ein Teil der Lymphome hierzu im INK4a/ARF-Lokus ARF-exklusive Gensequenzen deletiert, finden sich in anderen ARFnull-Lymphomen Deletionen, die auch die INK4a-Sequenz betreffen und daher simultan zu einer Heterozygotie für INK4a führen. Überraschenderweise zeigte sich, dass ARFnull-Lymphome nicht etwa wie INK4a/ARFnull-Lymphome sehr schlecht, sondern ähnlich gut wie Kontroll-Lymphome auf Behandlung ansprechen. Auch hinsichtlich des Überlebens nach CTX-Therapie verhalten sich ARFnull-Lymphome viel besser als INK4a/ARFnull-Lymphome, während Bcl2-Überexpression die Verläufe beider Gruppen drastisch verkürzt. Das INK4a-Gen kontrolliert daher, unabhängig von der anti-apoptotischen Bcl2-Funktion, eine weitere Komponente der Chemosensitivität.


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Kontroll-Lymphome, die bereits vor Therapie – wie viele humane Tumoren auch – homozygote Spontandeletionen im INK4a/ARF-Lokus aufweisen und daher weder ARF noch p16INK4a exprimieren, sprechen genauso schlecht auf CTX an, wie dies in der INK4a/ARFnull-Gruppe beobachtet wurde. Interessanterweise gilt dies ebenso für die ARFnull-Subgruppe, die einen heterozygoten INK4a-Defekt akquiriert hatte. In Rezidiv-Tumoren dieser letztgenannten Gruppe kann in den meisten Fällen kein intaktes INK4a-Gen mehr nachgewiesen werden; das zunächst verbliebene INK4a-Allel wird also unter Therapie deletiert. Wie im Falle von p53+/- Progenitorzellen [159] vermag bcl2-Gentransfer auch bei INK4a/ARF+/- Stammzellen vor Verlust des Wildtyp-Allels in den entstehenden Lymphomen zu schützen, doch werden auch diese Lymphome unter CTX zu Null-Mutanten. Noch spezifischer kann mittels Einschleusung von p16INK4a-Antisense-Konstrukten in ARFnull-Lymphome demonstriert werden, dass CTX-Therapie gegen die INK4a-Komponente des INK4a/ARF-Lokus in vivo selektiert.

Nicht nur p53, sondern auch p16INK4a-Protein wird Tage nach Chemotherapie in apoptosedefekten Lymphomen hochreguliert vorgefunden, wobei p53-defiziente Lymphome offenbar enorm hohe p16INK4a-Level tolerieren. ARFnull-Lymphome exprimieren von intaktem INK4a weiterhin p16INK4a, wenn nicht durch wiederholte Behandlungszyklen gegen INK4a-Gene selektiert wurde. Werden ARF- oder p16INK4a-cDNAs in p53null- oder INK4a/ARFnull-Lymphomzellen in vitro überexprimiert, so akzeptieren p53-defiziente Lymphome erwartungsgemäß eine Überexpression des p53-Upstream-Regulators ARF, aber tolerieren auch in diesem Testsystem hohe p16INK4a-Level. Umgekehrt wird in INK4a/ARFnull-Lymphomen nicht nur gegen das primär tumorsuppressive ARF-Produkt, sondern auch gegen p16INK4a selektiert – analog zu der Selektion gegen INK4a-Gene nach zytostatika-vermittelter p16INK4a-Induktion. Die therapie-induzierte Selektion richtet sich dabei entweder gegen p53- oder INK4a-Gene, aber nicht – wie es im Falle zweier autonomer Signalwege zu erwarten wäre – simultan gegen beide Aktivitäten im selben Lymphom. INK4a/ARFnull-Lymphome zeigten nach in vivo-Therapie in keinem Fall p53-Mutationen, noch fand sich in p53null;INK4a/ARF+/- Lymphomen ein LOH der verbliebenen INK4a/ARF-Komponente nach wiederholten CTX-Gaben.

Der Proliferationsstopp nach CTX-Behandlung erfüllt formal Kriterien zellulärer Seneszenz: insbesondere exprimieren die apoptosedefekten Lymphome Tage nach CTX-Gabe in saurem pH massiv β-Galaktosidase (die sogenannte seneszenz-assoziierte „SA-β-Gal”-Aktivität), während unbehandelte Proben derselben Kontroll-Lymphome für diese Reaktion negativ bleiben. p53null-Lymphome, die unter CTX nicht arretierten, sind konsequenterweise auch hier SA-β-Gal-negativ. Interessanterweise fehlt INK4a/ARFnull-Lymphomen die Fähigkeit zum SA-β-Gal-positiven Zellzyklus-Arrest, während (p16INK4a-exprimierende) ARFnull-Lymphome Tage nach CTX-Gabe SA-β-Gal-positiv reagieren. Therapie-induzierte Seneszenz ist daher ein INK4a- und p53-kontrolliertes Programm, welches zusätzlich zu Apoptose zum Langzeitverlauf nach Zytostatika-Therapie beiträgt.


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21.04.2005