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3  Diskussion und Kritische Wertung

3.1 The Hallmarks of Cancer

Tumorigenese, die onkogene Transformation regelrechter Zellen zu einer autonom und invasiv-destruierend wachsenden Geschwulst, ist ein – je nach Betrachtungsweise – überaus komplexer pathoanatomischer, molekulargenetischer und biochemischer Prozess, der eine Kaskade zellulärer Insulte voraussetzt, um schlußendlich im malignen Phänotyp zu münden. Die zur Tumormanifestation notwendige Zahl und Sequenz der akquirierten Defekte sind dabei nicht nur von der Art der initialen Läsionen, beispielsweise einer genetischen Translokation gegenüber einem chronischen Entzündungsreiz, sondern auch dem Zelltyp – epithelial versus mesenchymal, um nur beispielhaft Klassen zu nennen – und einer Vielzahl weiterer Faktoren abhängig. Trotzdem gibt es Spielregeln, die über die individuellen Aspekte einzelner Tumorentitäten hinaus von grundsätzlicher Bedeutung für die Tumorentstehung sind. In ihrer seminalen Übersichtsarbeit haben Hanahan und Weinberg die Insensitivität gegenüber apoptotischem Zelltod, ein unbegrenztes Zellteilungs-Potential, die Autonomie der Wachstumsstimulation, die Entkopplung von externer Wachstumskontrolle und eine hinreichende Gefäßversorgung als die fundamentalen Grundqualitäten des malignen Phänotyps, der „Hallmarks of Cancer“, zusammengefaßt und deren molekularen Zusammenhänge in einer „Netzwerk-Karte“ visualisiert [161, 162]. Währen die meisten Tumorentitäten auf diesen Säulen aufbauen, so kann deren Reihenfolge und Zeitpunkt sowie deren spezifischer Beitrag auf den „Malignisierungsprozess“ individuell sehr verschieden sein. Da sich jedoch die meisten der genannten Qualitäten in fortgeschrittenen Erkrankungen finden, hat sich aus der „Hallmark-Doktrin“ die weit verbreitete implizite Vorstellung abgeleitet, es handele sich dabei um notwendige Defekte für die Tumorentstehung, die darüberhinaus auch für den Tumorerhalt essentiell sein könnten.

3.2 The Lifelines of Cancer

Die typischerweise im Laufe der Tumorigenese erworbenen Defekte und Fähigkeiten (die sogenannten „Cancer acquired Capabilities“) setzen sich aus zwei Komponenten zusammen: der modifizierten Interaktion mit der Tumorumgebung einerseits und der Abschaltung zell-autonomer Kontrollmechanismen andererseits. Während die Entkopplung vom umgebenden Milieu durch Produktion eigener Wachstumsfaktoren, Desensibilisierung gegenüber inhibitorischen Signalen und Stoffwechseladaptation an eine insuffiziente Ver- und Entsorgungslage Qualitäten sind, die autonomes Wachstum erleichtern, so ist die Inaktivierung intrinsischer zellulärer Kontroll-Programme, d.h. der Failsafe-Programme Apoptose oder Seneszenz, ultimativ notwendig, um die Manifestation eines malignen Klons zuzulassen (daher sogenannte „Cancer required Capabilities“). Inwieweit dabei aktivierte Onkogene für Defekte in Failsafe-Mechanismen selektieren, kann von den Milieu-Bedingungen beeinflußt werden. Überlebensfördernde Wachstumsfaktoren beispielsweise mögen dazu beitragen, dass bereits weniger deletäre Apoptosedefekte zur Initiation klonalen Wachstums ausreichen. Umgekehrt können besonders wachstumshemmende Umgebungsbedingungen wie unzureichende Gefäßversorgung und daraus resultierende Hypoxie trotz manifester Failsafe-Defekte zusätzliche Mutationen mit noch stärkerem Phänotyp provozieren. Dabei moduliert das Milieu die Mutationsempfänglichkeit des Tumors; die vitalen, tumorigenen Defekte liegen jedoch in der Inaktivierung tumor-autonomer Failsafe-Mechanismen und konstituieren damit die „Lifelines of Cancer“.

Es ist mittlerweile klar, dass Failsafe-Programme nicht nur eine wichtige Barriere gegenüber potentieller Tumormanifestation darstellen, sondern aufgrund ihrer Beteiligung an Zytostatika-Effektormechanismen zum Erfolg von DNA-schädigender Tumortherapie [Seite 24↓]beitragen (vgl. 1.4). Hierdurch entsteht ein formal logisches Dilemma medikamentöser antineoplastischer Behandlung: Tumoren, die notwendigerweise auf Defekten in Failsafe-Programmen beruhen, werden mit Substanzen behandelt, deren Wirksamkeit von der Intaktheit eben dieser Programme abhängt. Ironischerweise könnten die dann ineffektiven, aber intrinsisch mutagenen DNA-schädigende Pharmaka den malignen Phänotyp sogar noch verschärfen, wenn Failsafe-Mechanismen wie DNA-Reparatur nicht mehr adäquat funktionieren.

Dass konventionelle Chemotherapie dennoch ihren Stellenwert in der Tumorbehandlung hat, erklärt sich aus mehreren Aspekten. Mitogene Onkogene provozieren nicht nur eine zelluläre Gegenreaktion im Sinne der genannten Failsafe-Mechanismen, sondern sensibilisieren die Apoptose-Maschinerie auf verschiedenen Ebenen, beispielsweise durch direkte Aktivierung von Caspasen auch unterhalb von p53 [163, 164], und erklären so die höhere Chemosensititvität neoplastischer Zellen im Vergleich zum Normalgewebe. Außerdem führen die meisten Läsionen in Apoptose-Programmen nicht zu einer kategorischen „Apoptose-Resistenz“, sondern erhöhen durch Verlegung bestimmter Effektor-Pathways im Apoptose-Netzwerk die Schwelle für pro-apoptotische Signale, jenseits der Zelltod exekutiert wird. Dieser Effekt wird klinisch wirkungsvoll durch sogenannte Hochdosis-Therapien ausgenutzt. Darüberhinaus können Zytostatika neben Apoptose mit Seneszenz ein alternatives Failsafe-Programm als weiteren prognose-relevanten Effektormechansimen rekrutieren. Dieser Aspekt ist besonders dort von Bedeutung, wo onkogene Aktivität gegen ein bestmmtes Failsafe-Programm selektiert hat, jedoch ein anderes, therapeutisch nutzbares Programm weiterhin intakt verfügbar ist.

Die zentrale Bedeutung ultimativ zellzyklus-terminierender Programme wie Apoptose und Seneszenz und die demzufolge vitale Abhängigkeit etablierter Tumoren von Defekten in diesen Programmen machen die „Lifelines of Cancer“ sehr viel zwangsläufiger und direkter als die milieu-gesteuerten Prinzipien der „Hallmarks of Cancer“ zu potentiellen Therapiezielen. Tatsächlich haben in präklinischen und frühen klinischen Prüfungen Angiogenese-Inhibitoren oder Hemmstoffe von Matrix-Metalloproteinasen eher enttäuschende Effekte gezeigt. Trotz möglicherweise erheblicher Antiangiogense oder Reduktion der Gewebsinvasivität hängt der tumorlytische Erfolg deratiger Therapieprinzipien letztendlich von intakten endogenen Eradikationsmechanismen ab, die aber mutationsbedingt häufig nicht mehr verfügbar sind. Die Identifikation expliziter inaktivierender Mutationen in Failsafe-Programmen eröffnet allerdings die Möglichkeit, mittels läsionsspezifischer „kleiner Moleküle“ Apoptose oder Seneszenz im Sinne einer „targeted Therapy“ zu restaurieren und damit die Zellen für klassische Chemotherapie oder andere, indirekte Therapieformen zu re-sensibilisieren.

3.3 Stellenwert prämaturer Seneszenz in Tumortherapie und Prognose

In eigenen Arbeiten konnte erstmalig akut induzierbare, prämature Seneszenz als ein p53- und p16INK4a-kontrolliertes, prognostisch relevantes neues Effektorprogramm unter Chemotherapie identifiziert und die biologischen und klinischen Konsequenzen inaktivierender Mutationen demonstriert werden. p53 und p16INK4a kooperieren als zytostatika-responsive Mediatoren in zunächst parallelen Signalwegen, die als gemeinsame Endstrecke in der Exekution von Seneszenz münden. Die biochemischen und zell-strukturellen Grundlagen des „Senescence Switch” zu einem teilungsunfähigen, aber metabolisch aktiven Status sind nicht hinreichend bekannt. Es ist vorstellbar, dass p16INK4a und p53 unterschiedliche Funktionen in Initiation und Erhaltung des seneszenten Zustands wahrnehmen. Ob auch ARF – welches in erster Linie onkogen-vermittelt Failsafe-Programme (d.h. myc-induzierte Apoptose und ras-induzierte Seneszenz) aktiviert – eine Bedeutung für therapie-bedingte Seneszenz hat, ist derzeit unklar. [Seite 25↓]Offenkundig kann der alleinige Verlust von ARF myc-initiierte Tumorigenese dramatisch forcieren, ohne dabei therapie-induzierbare Seneszenz zu kompromittieren.

Therapie-induzierbare Seneszenz ist nach heutigem Wissen biochemisch und morphologisch nicht von anderen Formen der prämaturen Seneszenz zu unterscheiden [20, 43]. Der beschriebene CTX-induzierte SA-β-Gal-positive Zellzyklus-Arrest geht mit der Induktion der gut dokumentierten „Seneszenz-Marker” p53, p16INK4a und PML einher. Inwieweit prämature Seneszenz dabei wie die telomer-gesteuerte replikative Seneszenz tatsächlich irreversibel ist, wird in zukünftigen Untersuchungen zu klären sein. Dass, wie in der Originalarbeit gezeigt, apoptose-defiziente (bcl2-transduzierte) Lymphome nach langer Latenz wieder progredient werden, mag auf präformierte Mutationen vor Therapie zurückzuführen sein, die nun unter CTX-induzierter Seneszenz selektiert wurden. Außerdem ist nicht auszuschließen, dass einzelne Tumorzellen, möglicherweise durch lokale Zytostatika-Verteilungsinhomogenitäten, niemals seneszent geworden waren. Ob prämature Seneszenz formal einen terminalen Ruhezustand darstellt, wird kontrovers diskutiert. Durch akute (Cre-Rekombinase-vermittelte) Inaktivierung des indirekten p16INK4a-Targets Rb kann experimentell Proliferation aus Seneszenz heraus erzwungen werden (T. Jacks, AACR-Präsentation 2002), doch bleibt offen, ob ein derartiger mutagener „Escape”-Mechanismus aktiv in seneszenten Tumorzellen überhaupt stattfinden könnte. Seneszenz als irreversibles therapie-induzierbares Arrest-Programm wäre qualitativ therapie-induzierter Apoptose äquivalent, da beide Programme Tumorzellen endgültig aus dem replikativen Zellzyklus ausschleusen. Möglicherweise wird Seneszenz vor allem sequentiell als „Rückversicherungs-Mechanismus” rekrutiert, wenn Apoptose bereits kompromittiert ist. Selbst wenn der Aspekt der Irreversibilität prämaturer Seneszenz noch nicht abschließend geklärt ist, so konnten eigene Daten demonstrieren, dass therapie-induzierte Seneszenz neben Apoptose entscheidend zum Therapie-Outcome beiträgt.

3.4 Nebenprodukte werden zur Hauptsache

Die dieser Habilitationsschrift zugrunde liegenden Arbeiten sollen zum Verständnis des komplexen Verhältnisses zwischen Tumorgenen und Tumortherapie beitragen. Die Ergebnisse machen deutlich, dass in manifesten Malignomen Failsafe-Programme, d.h. „genetische Abwehrkonzepte”, inaktiviert werden müssen und daher ganze Signalkaskaden potentielle Mutationstargets darstellen. Interessanterweise kreuzen Therapie-Effektorprogramme die Tumorsuppressor-Pathways auf verschiedenen Ebenen, so dass manche Tumorsuppressor-Defekte bereits vor Therapiebeginn Chemoresistenz determinieren. Die Kreuzung des onkogenen und des DNA-Schädigungs-getriggerten Signalwegs auf Höhe des zentralen „Relais” p53 verschaltet dabei nicht nur Tumorsuppression mit Therapie-Exekution, sondern stellt auch die gemeinsame Kontrollebene von Apoptose und Seneszenz dar. Trotz vieler weiterer p53-gesteuerter Funktionen wird im Kontext von aktiviertem myc gegen p53 nur selektiert, um p53-abhängige Apoptose auszuschalten [159]. Als „Nebenprodukt” wird dabei p53-kontrollierte Seneszenz ko-inaktiviert, obwohl myc-initiierte Lymphome keines Seneszenz-Defekts bedürfen [160]; dieser Nebeneffekt wird erst unter Therapie relevant und unterstreicht, dass tumor-etablierende Mutationen bereits vor der ersten Zytostatika-Exposition Chemoresistenz begründen können. Der Verlust von therapie-induzierbarer Apoptose und Seneszenz erklärt den limitierten Therapieerfolg und daher die dramatisch schlechte Prognose p53-defizienter Lymphome. Wird hingegen ARF als onkogener Signalvermittler zu p53 inaktiviert (wodurch – “mutually exlcusive” – Schutz vor p53-Mutationen entsteht), formieren sich Lymphome ebenso rasant, doch bleibt zumindest Seneszenz als Zytostatika-Effektor verfügbar – und der klinische Therapie-Effekt ist entsprechend gut. Erst die konsekutive Abschaltung des Seneszenz-Programms durch INK4a-Verlust, wenn [Seite 26↓]die bereits manifesten Tumoren einem neuartigen zellulären Stress, d.h. DNA-schädigender Chemotherapie, ausgesetzt werden, kompromittiert die Prognose. Selektion gegen die INK4a-Komponente unter Chemotherapie ist von humanen hämatologischen Neoplasien bekannt, ohne dass jedoch Seneszenz als der zugrunde liegende Mechanismus identifiziert werden konnte [165, 166, 167]. Auch Apoptose-Inaktivierung durch Bcl2 kooperiert mit myc-mediierter Tumorigenese, ohne mit Seneszenz zu interferieren. Folglich haben diese Lymphome eine intermediäre, aber gegenüber p53-defizienten Tumoren deutlich bessere Prognose nach Therapie. Dies reflektieren sehr gut klinische Verläufe von Patienten mit Bcl2-überexprimierendem follikulären Lymphom, bei denen typischerweise eine chemotherapeutische Langzeit-Kontrolle des Tumorleidens, aber keine Heilung erzielt werden kann. In Analogie zu Verläufen im präsentierten Mausmodell finden sich in den Tumoren dieser Patienten häufig p53- oder INK4a/ARF-Mutationen, wenn es schließlich zur terminalen Tumorprogression kommt [168, 169].

3.5 Von Mäusen zu Menschen

Trotz der erläuterten Stärken des hier eingesetzten Mausmodells – allem voran vergleichende chemotherapeutische Studien an Lymphomen mit definierten genetischen Läsionen in vivo durchführen zu können, welche in dieser Art an Patienten aus ethischen oder technischen Gründen unmöglich wären – gilt die Interpretation der beobachteten Effekte nich zwangsläufig über Spezies-Grenzen hinweg. Auch kann ein myc-transgenes Lymphommodell bevorzugt karzinom-relevante Signalwege oder Effekte funktionell andersartiger Onkogene (beispielsweise onkogenes ras) nicht gleichermaßen widerspiegeln. Dennoch sind nicht nur die generellen „Spielregeln” der Onkogenese und der dagegen gerichteten tumorsuppressiven Mechanismen in humanen und murinen Systemen offenbar sehr ähnlich, sondern liegen auch hohe Interspezies-Homologien der hier untersuchten Schlüsselgene, d.h. des p53- und des INK4a/ARF-Lokus, bezüglich Sequenz und genomischer Architektur vor. In vielen humanen Tumorentitäten konnte p53-Inaktivierung nicht nur als relevanter Aspekt der Tumorigenese, sondern auch als Therapie-Prognostikator identifiziert werden [118, 120, 170], wobei insbesondere in soliden Tumoren die akkurate Einschätzung des p53-Status technisch schwierig ist [171] und die biologische Konsequenz individueller p53-Mutationen uneinheitlich ist [56]. Weiterhin gibt es erste Daten, die auf die Existenz von therapie-induzierbarer Seneszenz in humanen epithelialen Tumorzellen in vitro [172] und in vivo [173] hinweisen. Korrelative Untersuchungen bestätigen zudem die Bedeutung von p53 und p16INK4a als Regulatoren zytostatika-induzierter Seneszenz auch im Humansystem in vivo [173]. Auch stellt die Erzeugung heterozygoter Compound-Genotypen durch Knockout-Verpaarung mit nachfolgendem potentiellen „Loss of heterozygosity” (LOH) eine brauchbare Annäherung an die klassische Zwei-Schritt-Hypothese der genetischen Inaktivierung von Tumorsuppressor-Genen dar [153]. Tatsächlich finden sich in humanen Tumorproben komplexe Inaktivierungsmuster beider INK4a/ARF-kodierten Gene durch Deletionen, Punktmutationen oder Promotor-Hypermethylierung, wobei Defekt-Konstellationen analog der im Mausmodell untersuchten ARF-INK4a-Inaktivierungssequenz in Patientenmaterial beschrieben sind [65, 174]. Darüberhinaus stellt – wie in murinen ARFnull-Lymphomen mit allelem INK4a-Verlust – INK4a-Hemizygotie in humanen hämatologischen Neoplasien einen ungünstigen Prognosefaktor dar [167]. Die Eµ-myc-transgene Maus als genetisch gezielt zu manipulierendes und klinisch, histopatholgisch und molekularbiologisch gut zu evaluierendes Testsystem liefert daher Daten zu Tumorentstehung und Therapiesensitivität, die offenkundig von hohem Aussagewert für humane Tumorerkrankungen, insbesondere hämatologische Neoplasien, sind.


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3.6  „Mining the Genome“: Gene, Proteine und ihre Funktionen

Die mit der Sequenzierung des humanen Genoms eingeleitete „post-genomische“ Ära steht für die enorme wissenschaftliche Herausforderung, die generierte Rohdatenmenge in sinnvolle genetische und ultimativ medizinisch brauchbare Information zu übersetzen. Große Bedeutung haben hier „genom-weite“ Expressionsanalysen mittels Mikroarrays erlangt, auf denen Transkripte gegenüber mehreren zehntausend cDNAs und exprimierten „Sequence-Tags“ in einer einzigen Hybridisierungsreaktion quantifiziert werden können. Die bis dato begrenzte Akkuranz der Methodik verlangt jedoch erhebliche Folgearbeiten, um die Reliabilität der relativen Expressionsintensitäten zu überprüfen. Die Identifikation biologisch signifikanter Resultate ist schwierig, basiert häufig auf einer subjektiven Auswahl eingehend zu charakterisienden Kandidatensequenzen und erfordert oft immensen Post-Array-Klonierungs- und Validierungsauwand. Eine interessante Alternative liegt in der Nutzung von Mikroarrays zur rein deskriptiven Erstellung molekularer „Fingerabdrücke“ von Tumorentitäten. Durch Cluster-Bildung aus den Expressionsprofilen zahlreicher individueller Tumorproben lassen sich so gegebenfalls innerhalb einer – nach konventionellen Klassifikationskriterien – einzelnen nosologischen Entität neue Subgruppen identifizieren. Die Stratifizierung nach Expressionssignaturen und deren Korrelation mit klinischen Verlaufsdaten kann dann helfen, wichtige prognostische bzw. therapie-relevante Unterschiede innerhalb einer vormals einheitlichen Entität aufzudecken, ohne dass hierfür auch nur eine einzige der array-untersuchten cDNA-Sequenzen näher bekannt sein müsste [175, 176] [177, 178, 179]. Die derartige Nutzung von Mikroarrays als kostengünstiges „High-Throughput“-Verfahren wird wahrscheinlich sehr bald zum diagnostischen Standard in der genetischen Charakterisierung von Tumormaterial werden. Auch das myc-transgene Mausmodell stellt eine ideale Plattform für phänotyp-gesteuerte „Forward Genetics“-Expressionsuntersuchungen mittels Array-Technik dar, da in einer beliebigen Zahl primärer Lymphomerkrankungen zwei definierte Zustandsformen desselben Ausgangslymphoms – beispielsweise behandelt versus unbehandelt oder chemosensibel versus chemoresistent – miteinander verglichen werden können.

Neben Phänotyp-zu-Gen-Strategien wird es in der post-genomischen Ära zunehmend wichtiger, funktionelle Genomik in aussagefähigen Gen-zu-Phänotyp-Modellen betreiben zu können. Eine besondere Stärke des Eµ-myc-transgenen Mausmodells liegt darin, Kandidatengene funktionell im Sinne von „Reverse Genetics“ in einem relevanten Kontext, d.h. exprimiert in spontan entstandenen Tumoren in natürlicher Umgebung zu studieren. Beispielsweise können ganze Serien manipulierter Genaktivitäten retroviral rasch und ökonomisch in hämatopoietische Stammzellen eingeschleust werden, woraufhin sich phänotypische Konsequenzen in den nach Stammzelltransplantation entstehenden Neoplasien unmittelbar untersuchen lassen. Neben der tumorbiologischen und molekulargenetischen Analyse der so erzeugten Lymphome kann im myc-transgenen Mausmodell in einzigartiger Weise Pharmakogenomik betrieben werden: basierend auf Tumoren mit definierten genetischen Defekten und möglicherweise bekannter funktioneller Charakteristika können – wie in klinischen Studien – verschiedene Behandlungsarme systematisch in vivo getestet werden. Pharmakogenomische Untersuchungen haben in diesem Modell die deletäre Bedeutung von p53- oder INK4a/ARF-Defekten für das tumorfreie Überleben nach konventioneller Chemotherapie demonstriert und konnten darüberhinaus therapie-induzierbare Seneszenz als prognostisch relevantes Effektorprogramm neben Apoptose identifizieren. Es ist naheliegend, dass die Rückführung kompromittierter Behandlungserfolge auf explizite Mutationen oder Inaktivierungen bestimmter Signalwege die Basis für neuartige biologische Therapieformen liefern wird.


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21.04.2005