Schön, Michael R. : Transplantation von Lebern Nicht-Herzschlagender Spender im Schweineleber-Transplantationsmodell

Aus der
Klinik für Abdominal- und Transplantationschirurgie
Humboldt-Universität zu Berlin
Charité, Campus Virchow-Klinikum
Direktor: Prof. Dr. med. P. Neuhaus


Transplantation von Lebern
Nicht-Herzschlagender Spender im
Schweineleber-Transplantationsmodell
Habilitationsschrift

Zur Erlangung der Venia Legendi

für das Fach Chirurgie

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dr. med. Michael R. Schön,
Berlin 1999

Gutachter:
Prof. Dr. med. K. Schwemmle
Prof. Dr. med. Dr. vet. C. Hammer

Diese Untersuchungen wurden mit Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn und der Sonnenfeld-Stiftung, Berlin durchgeführt

Zusammenfassung

Es wurde untersucht ob die normotherme extrakorporale Leberperfusion (NELP) als Methode geeignet ist, Lebern vor Transplantation zu konservieren, und ob sie warm ischämische Zellschäden beheben kann. Zum ersten Mal konnte experimentell gezeigt werden, daß eine erfolgreiche Transplantation nach 4 Stunden mit NELP möglich ist und sogar so zuverlässig, wie die Kaltkonservierung in der University of Wisconsin Lösung. Die NELP erhält die Leberfunktion und ermöglicht eine Regeneration warm ischämischer Schäden in Nicht-herzschlagenden Spendern.

36 Schweine der Deutschen Landrasse wurden in sechs Gruppen transplantiert. In der Gruppe 1 wurde direkt nach Organentnahme transplantiert, in Gruppe 2 nach 4 Stunden Kaltkonservierung in der University of Wisconsin Lösung und in Gruppe 3 nach 4 Stunden NELP. In Gruppe 4 wurden die Lebern nach 60 Minuten warmer Ischämie direkt transplantiert, in Gruppe 5 nach 60 Minuten warmer Ischämie und 4 Stunden Kaltkonservierung und in Gruppe 6 nach 60 Minuten warmer Ischämie und 4 Stunden NELP. Alle Tiere deren Lebern vor Transplantation normotherm extrakorporal perfundiert wurden (Gruppen 3 und 6) überlebten mit guter Organfunktion. Im Unterschied hierzu führte die Abfolge von 60 Minuten warmer Ischämie und 4 Stunden Kaltkonservierung unweigerlich zur primären Organ-Nichtfunktion innerhalb der ersten 24 Stunden nach Lebertransplantation. Die Methode der NELP bietet die Chance eine Leber außerhalb des Körpers für Zeiträume von möglicherweise länger als 4 Stunden völlig funktionsfähig zu halten. Die NELP kann zur Organkonservierung vor Transplantation eingesetzt werden, aber auch dazu, Lebern von Nicht-Herzschlagenden Spendern zu nutzen.

Abstract

Normothermic extracorporeal liver perfusion (NELP) was studied as a means to preserve livers for transplantation and to reverse warm ischemic injury. For the first time we provide experimental evidence that successful transplantation after 4h of normothermic extracorporeal liver perfusion is possible and as reliable as 4h of cold preservation in University of Wisconsin solution. NELP preserves liver function completely and is capable of reversing 60 min of warm ischemic injury in non heart beating donors.

36 German Landrace pigs were transplanted in six groups. Group 1 animals were transplanted directly, group 2 animals after 4h of cold preservation with University of Wisconsin solution and group 3 animals following 4h of normothermic extracorporeal liver perfusion. Group 4 animals sustained 1h of warm ischemia before transplantation of the liver. In group 5 animals were transplanted following 1h of warm ischemia and 4h of cold preservation, and in group 6 after 1h of warm ischemia and 4h of normothermic extracorporeal liver perfusion. All animals receiving livers treated by normothermic extracorporeal liver perfusion survived without liver failure (group 3 and 6). In contrast, all animals in group 5 developed primary graft non-function within 24 h after transplantation. The technique of NELP holds the potential to keep a mammalian liver outside the body completely functional, possibly for longer than 4h. NELP can be used for liver preservation prior to transplantation or to utilise organs from non-heart-beating donors.

Schlagwörter:
Lebertransplantation, Organkonservierung, Normotherme extrakorporale Leberperfusion, Nicht-herzschlagende Organspender

Keywords:
Liver transplantation, organ preservation, normothermic extracorporeal liver perfusion, non-heart-beating-donors


Seiten: [4] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [121] [122] [123] [124] [125] [126] [127] [128] [129] [130] [131]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteTransplantation von Lebern Nicht-Herzschlagender Spender im Schweineleber-Transplantationsmodell
Widmung
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der Abkürzungen
1 Einleitung
1.1Mangel an Spenderorganen
1.2Ansatzpunkte der Problemlösung
1.3Fragestellungen und Zielsetzungen
1.3Kalte Ischämie zur Organkonservierung
1.4Nicht-herzschlagende Organspender
1.5Normotherme extrakorporale Leberperfusion (NELP)
1.6Normotherme extrakorporale Leberperfusion als Methode zur Organkonservierung
1.7Normotherme extrakorporale Leberperfusion als Methode zur Organkonservierung von Lebern aus nicht-herzschlagenden Spendern
2 Material und Methoden
2.1Evaluierung der Perfusatdialyse während NELP
2.1.1Spenderorgane
2.1.2Perfusionskreislauf
2.1.2.1.1Perfusat
2.1.2.1.2Dialysekreislauf
2.1.2.1.3Dialysat
2.1.3Einteilung der Versuchsgruppen
2.1.4Untersuchungsprogramm
2.1.4.1Probennahme und Bestimmungen
2.1.4.2Darstellung und Auswertung der Versuchsergebnisse
2.2Lebertransplantation nach vorausgegangener NELP
2.2.1Versuchstiere
2.2.2Einteilung der Versuchsgruppen
2.2.2.1Gruppe 1: sofortige Lebertransplantation
2.2.2.2Gruppe 2: 4h Kaltkonservierung in UW vor Lebertransplantation
2.2.2.3Gruppe 3: 4h NELP vor Lebertransplantation
2.2.2.4Gruppe 4: 1h warme Ischämie und anschließend Lebertransplantation
2.2.2.5Gruppe 5: 1h warme Ischämie, 4h kalte Ischämie in UW und anschließend Lebertransplantation
2.2.2.6Gruppe 6: 1h warme Ischämie, 4h NELP und anschließend Lebertransplantation
2.2.3Narkose
2.2.4Lebertransplantation
2.2.4.1Spendertiere
2.2.4.2Empfängertiere
2.2.4.3Postoperative Nachsorge
2.2.5Untersuchungsprogramm
2.2.5.1Probennahmen
2.2.5.1Prä- und postoperative Blutentnahmen
2.2.5.2Viabilitätsparameter
2.2.5.2Postoperative Bestimmungen im Serum
2.2.5.3Galleproduktion
2.2.5.4Darstellung und Auswertung der Versuchsergebnisse
2.2.6NELP der Gruppen 3 und 6
2.2.6.1Neuentwicklung des Leberperfusionssystems mit integrierter Dialyse
2.2.6.2Überwachung der Druck- und Flußregulation
2.2.6.3Perfusionskammer und Druckoszillation
2.2.6.4Dialysekreislauf und Oxygenierung
2.2.6.5Perfusat, Dialysat und Perfusion
2.2.6.6Bestimmung in Perfusat und Dialysat
2.2.7Licht- und Elektronenmikroskopische Untersuchungen
2.2.7.1Entnahme der Biopsien/Biopsieprotokoll
2.2.7.2Fixierung der Biopsien
2.2.7.3Präparationsmethoden für die Lichtmikroskopie
2.2.7.3Fixierung, Einbettung und Färbung
2.2.7.4Dokumentation der Lichtmikroskopie
2.2.7.5Präparationsmethoden für die Elektronenmikroskopie
2.2.7.5Fixierung, Kontrastierung und Nachfixierung
2.2.7.6Einbettung
2.2.7.7Herstellung der Semidünnschnitte
2.2.7.8Herstellung der Ultradünnschnitte und Nachkontrastierung
2.2.7.9Dokumentation der Transmissionselektronenmikroskopie
2.2.7.10Selektion der Biopsien für die Transmissionselektronenmikroskopie
3 Ergebnisse
3.1Evaluierung der Perfusatdialyse während NELP
3.1.1Makroskopischer Aspekt der Lebern nach Perfusion
3.1.2Elektrolytkonzentrationen und pH-Werte im Vergleich
3.1.2.1Natrium
3.1.2.2Kalium
3.1.2.3pH-Werte
3.1.3Die Enzymaktivitäten im Vergleich
3.1.3.1GOT (AST)
3.1.3.2GPT (ALT)
3.1.3.3LDH
3.1.4Sauerstoffverbrauch, Galle- und Harnstoffproduktion
3.1.4.1Sauerstoffverbrauch
3.1.4.2Galleproduktion
3.1.4.3Harnstoffproduktion
3.2Lebertransplantation nach vorausgegangener NELP
3.2.1Chirurgisches Modell
3.2.2Primäre Organ-Nicht-Funktion nach Lebertransplantation
3.2.3Überleben
3.2.4Biochemische Parameter nach Lebertransplantation
3.2.4.1alpha-GST
3.2.4.2GOT
3.2.4.3GPT
3.2.4.4LDH
3.2.4.5gammaGT und Bilirubin
3.2.4.6Hyaluronsäure
3.2.4.7Gesamtprotein und Albumin
3.2.4.8Thromboplastinzeit (TPZ, Quick)
3.2.4.9Kreatinin
3.2.5Parameter während der vierstündigen NELP in Gruppe 3 und 6
3.2.5.1Natrium
3.2.5.2Kalium
3.2.5.3alpha-GST
3.2.5.4GOT
3.2.5.5GPT
3.2.5.6LDH
3.2.5.7Vergleich von alpha-GST, GOT, GPT und LDH untereinander
3.2.5.8Galleproduktion
3.2.5.9Gesamtprotein und Albumin
3.2.5.10Hyaluronsäure
3.2.5.11Harnstoff
3.2.5.12Ammoniak
3.2.5.13Leukozyten
3.2.5.14Thrombozyten
3.2.6Morphologische Ergebnisse nach licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen
4 Diskussion
4.1Zur Wahl des Schweins als Versuchstier
4.2Verbesserung der NELP
4.3Lebertransplantation nach NELP
4.4Überlebensdaten nach Lebertransplantation
4.5Rückschlüsse für die Klinik
4.6Einsatzmöglichkeiten der NELP als Konservierungsmethode
4.7Einsatzmöglichkeiten der NELP zur Einsparung von Tierversuchen
4.8Transaminasenfreisetzung nach hepatozellulären Schäden bei Ischämie
4.9alpha-GST-Freisetzung infolge hepatozellulärer Schäden
4.10Schlußfolgerung für die klinische Anwendung
4.11Beurteilung der Perfusionsergebnisse in den Gruppen 3 und 6
5 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Zusammensetzung der HPF 3-Lösung
Tabelle 2: Zusammensetzung des Dialysats
Tabelle 3: Ausgangswerte (n=26) im Perfusat nach Zugabe von HPF3.
Tabelle 4: Gemessene Ausgangswerte der Versuchstiere im Serum sowie die Referenzbereiche aus der Literatur
Tabelle 5: Ausgangswerte im Perfusat
Tabelle 6: Ausgangswerte des Dialysats
Tabelle 7: Biopsien der Gruppen 1-4
Tabelle 8: Biopsien der Gruppe 5 und 6
Tabelle 9: Zusammenfassung der morphologischen Ergebnisse nach Lebertransplantation in den Gruppen 1 bis 6 (Biopsie 3). Keine Veränderungen: 0, geringe Veränderungen: -, mittlere Veränderungen: - -, ausgeprägte Veränderungen: - - -, n.d.: nicht differenzierbar

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schema des Perfusionssystems
Abbildung 2: Gleichzeitige Operation von Spender und Empfänger in Gruppen 1 und 4.
Abbildung 3: Plazierung der mit Spiralen versehenen Perfusionsschläuche in V. portae und infrahepatischer V. cava inf. sowie in Ductus choledochus und A. hepatica
Abbildung 4: Plazierung der Schläuche in der Durchtrittsplatte für die Perfusionskammer
Abbildung 5: Blick durch den Deckel der Perfusionskammer auf die perfundierte Leber fünf Minuten nach Reperfusion. Der sterile Kunststoffbeutel isoliert die Leber vom temperierten Wasser der Perfusionskammer. Die Leber schwimmt ohne Kontakt zu den Plexiglaswänden in der Perfusionskammer. Gut sichtbar ist der Silikonschlauch der Pfortader und rechts davon der Silikonschlauch der V. cava. In Bildmitte befindet sich das Gallenblasenbett nach Cholecystektomie.
Abbildung 6: Übersicht der Versuchsgruppen
Abbildung 7: Dargestellt ist das Monitorbild vor Beginn der Perfusion. Blau korrespondiert mit dem venösen Perfusat, rot mit dem arterialisierten Perfusat. Die Farbe Gelb weist darauf hin, daß das in die V. portae gepumpte Perfusat gemischtvenös war. Die Kästchen zeigen online die Flüsse in ml/min, Drücke in mmHg und den berechneten Widerstand in p/V an.
Abbildung 8: Neu entwickelte Leberperfusionsmaschine auf einer rollbaren Konsole mit integriertem Akku. Von links nach rechts: Perfusionskammer, Gasflußmeßgerät, Flügelzellenpumpe für den Perfusionskammerdruck, Notebook und Bedienpanel.
Abbildung 9: Die Detailaufnahme der Perfusionsmaschine zeigt von links nach rechts Wasser und Dialysatbehälter, Wärmetauscher, Dialysator und den Membranoxygenator
Abbildung 10: Schema des Perfusionssystems
Abbildung 11: Darstellung des Zeitstrahls am Beispiel der Gruppe 6. Von allen ausgewerteten Biopsien wird nur die Biopsie 3 in alle 6 Gruppen und die Biopsie 2 zusätzlich in den Gruppen 3 und 6 dargestellt.
Abbildung 12: Die Natriumkonzentrationen im Perfusat der Gruppen 1 und 2 unterschieden sich nicht signifikant während der dreistündigen Perfusion. Die Natriumkonzentration im Dialysat von Gruppe 2 erhöhte sich leicht von 140 auf 142 mmol/l.
Abbildung 13: Es wurde ein Konzentrationsanstieg für Kalium im Perfusat der Gruppe 1 und eine Konzentrationsabnahme für Gruppe 2 (p=0,004 für t=30 min und p<0,0001 für t>30 min) gemessen. Im Dialysat von Gruppe 2 erhöhte sich die Kaliumkonzentration während der dreistündigen Perfusionszeit von 3 auf 4mmol/l.
Abbildung 14: Die Kaliumfreisetzung während der Perfusion lag in Gruppe 1 zwischen Beginn und der 90sten Minute und zwischen der 90sten bis 180sten Minute über der von Gruppe 2. In der Gesamtbilanz wurde in Gruppe 1 signifikant mehr Kalium freigesetzt als in Gruppe 2.
Abbildung 15: Der pH-Wert der Gruppe 1 fiel kontinuierlich mit dem Perfusionsbeginn während in Gruppe 2 nur in den ersten 30 Minuten ein pH Abfall gemessen wurde. Eine statistische Signifikanz von p<0,05 wurde für den Meßzeitpunkt 30 min und von p<0,0001 für die Meßzeitpunkte 60, 90, 120, 150 und 180 min nach Perfusionsbeginn berechnet.
Abbildung 16: Die höchste Zunahme der GOT-Aktivität fand sich in den ersten 3 min nach Reperfusion. Die weitere Zunahme der GOT-Aktivität beider Gruppen verlief weitgehend parallel. Eine statistische Signifikanz von p<0,05 wurde für die Meßpunkte 30, 60 und 90 min berechnet.
Abbildung 17: Zunahme der GPT-Aktivität beider Gruppen während der dreistündigen Perfusion. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wurde zu keinem Zeitpunkt berechnet
Abbildung 18: Zunahme der GPT-Aktivität beider Gruppen während der dreistündigen Perfusion. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wurde zu keinem Zeitpunkt berechnet
Abbildung 19: Sauerstoffverbrauch in beiden Gruppen während der dreistündigen Perfusion mit statistisch signifikantem Unterschied nach 3 h Perfusion.
Abbildung 20: Die Gallegesamtproduktion nach 3 h Perfusion lag in Gruppe 2 signifikant über der Galleproduktion in Gruppe 1.
Abbildung 21: Die Harnstoffkonzentration beider Gruppen während der dreistündigen Perfusion zeigt zu allen Meßpunkten einen statistisch signifikanten (p<0,05) Unterschied zwischen den Gruppen 1 und 2.
Abbildung 22: Die Harnstoffproduktion während der Perfusion war in Gruppe 2 zu allen Zeitpunkten höher als in Gruppe 1, erreicht aber keine statistische Signifikanz.
Abbildung 23: Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der alpha-GST.
Abbildung 24: Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der GOT.
Abbildung 25: Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der GPT.
Abbildung 26: Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der LDH.
Abbildung 27: Die Hyaluronsäurekonzentration steigt während der anhepatischen Phase an. Nach Reperfusion sinken die Hyaluronsäurespiegel innerhalb der ersten 6h unter die anhepatischen Werte für die Gruppe 1, 3, 4 und 6 ab. Wurde die Leber kalter Ischämie ausgesetzt (Gruppen 2 und 6) lagen die Hyaluronsäurekonzentrationen bis zum ersten postoperativen Tag über denen der anderen Gruppen. Die Gruppen 2 zeigte einen vergleichsweise verzögerten Abbau der Hyaluronsäure in den Stunden nach Reperfusion.
Abbildung 28: Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der Proteine.
Abbildung 29: Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der TPZ nach ReperfusionHarnstoff
Abbildung 30: Prä- und postoperative Serumkonzentrationen von Harnstoff
Abbildung 31: Prä- und postoperative Serumkonzentrationen von Kreatinin
Abbildung 32: Natriumkonzentration in Perfusat und Dialysat der Gruppen 3 und 6 während der vier stündigen NELP.
Abbildung 33: Kaliumkonzentration in Perfusat und Dialysat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 34: alpha-GST im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 35: GOT im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 36: GPT im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 37: LDH im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 38: Die Gesamtproduktion der Galle in Gruppe 3 nach 4 Stunden NELP lag signifikant über der Gallegesamtproduktion in Gruppe 6 (p<0,00081).
Abbildung 39: Proteine im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 40: Hyaluronsäurekonzentration im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 41: Harnstoff in Perfusat und Dialysat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 42: Ammoniak in Perfusat und Dialysat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 43: Leukozyten im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 44: Thrombozyten im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 45: Lichtmikroskopie Gruppe 1
Abbildung 46: Elektronenmikroskopie Gruppe 1
Abbildung 47: Lichtmikroskopie Gruppe 2
Abbildung 48: Elektronenmikroskopie Gruppe 2
Abbildung 49: Lichtmikroskopie Gruppe 3, Biopsie2
Abbildung 50: Elektronenmikroskopie Gruppe 3, Biopsie 2
Abbildung 51: Lichtmikroskopie Gruppe 3, Biopsie 3
Abbildung 52: Elektronenmikroskopie Gruppe 3, Biopsie 3
Abbildung 53: Lichtmikroskopie Gruppe 4
Abbildung 54: Elektronenmikroskopie Gruppe 4
Abbildung 55: Lichtmikroskopie Gruppe 5
Abbildung 56: Elektronenmikroskopie Gruppe 5
Abbildung 57: Lichtmikroskopie Gruppe 6, Biopsie 2
Abbildung 58: Elektronenmikroskopie Gruppe 6, Biopsie 2
Abbildung 59: Lichtmikroskopie Gruppe 6, Biopsie 3
Abbildung 60: Elektronenmikroskopie Gruppe 6, Biopsie 3

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Thu Aug 15 18:39:25 2002