Schön, Michael R. : Transplantation von Lebern Nicht-Herzschlagender Spender im Schweineleber-Transplantationsmodell

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Kapitel 2. Material und Methoden

Die vorliegende Arbeit setzt sich aus zwei aufeinander aufbauenden Projekten zusammen:

  1. Evaluierung eines Dialysekreislaufs während NELP
  2. Lebertransplantation nach vorausgegangener NELP

Im folgenden werden die unterschiedlichen Versuchsaufbauten und Abläufe für die beiden Projekte separat beschrieben.

2.1 Evaluierung der Perfusatdialyse während NELP

2.1.1 Spenderorgane

Die Lebern stammten von zwei Berliner Schlachthöfen, dem Großschlachthof an der Beusselstraße und dem Schlachthof an der Amendestraße. Bei den Schweinen handelte es sich um Masttiere der Deutschen Landrasse. Die Schweine wurden durch CO2-Narkose bzw. Elektroschock betäubt und mittels Ausbluten getötet. In einem sterilen Behälter wurde jeweils ein Liter des Schweinevollbluts aufgefangen. Zur Antikoagulation wurden 500 IE Heparin (Liquemin®, Roche, Grenzach-Wyhlen) zugegeben. Nach Ausbluten und Reinigen des Tiers erfolgte eine mediane Thorakotomie und Laparotomie. Das Herz, die Lungen und die gesamten viszeralen Organe wurden en bloc entnommen und abseits des eigentlichen Schlachtvorganges präpariert.

Die suprahepatische Vena cava inferior wurde am Eintritt ins Zwerchfell durchtrennt. Von links beginnend erfolgte die Präparation entlang der kleinen Magenkurvatur unter Durchtrennung und Ligatur der Arteria gastrica sinistra sowie des lymphatischen Gewebes. Anschließend wurden im Leberhilus die Arteria hepatica communis und der Ductus choledochus, die Vena portae und die infrahepatische Vena cava inferior aufgesucht und mit ausreichendem Abstand zum Eintritt in die Leber durchtrennt. Die Organpräparation dauerte im Mittel 10 min. Die isolierte Leber wurde in einem sterilen Kunststoffbeutel verpackt und in einem 37°C warmen Wasserbad in das Labor transportiert.

Im Labor wurden Kanülen zum Anschluß an die Perfusionsapparatur in die A. hepatica communis und V. portae gelegt und ligiert. Um die Galleproduktion beurteilen zu können und keine Verletzung des Gallenblasenbetts zu riskieren, wurde auf eine Cholecystektomie verzichtet und dafür der Ductus cysticus unterbunden. Zur Ableitung der Galle wurde ein Kunststoffschlauch (Heidelberger Verlängerung, Braun/Melsungen) in den Ductus choledochus eingelegt und ligiert.


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2.1.2 Perfusionskreislauf

Die Perfusionsapparatur bestand aus:

Die Temperierung erfolgte über einen Wärmetauscher (Stöckert/München) und die Druckmessung mittels eines Druckaufnehmers vor der Leberarterie. Dieser Perfusionskreislauf entsprach weitgehend dem, der in einem vorhergehende Projekt benutzt worden war.

Nach einer Ischämiezeit von 90 min wurde die Leber in das mit 37°C warmer Perfusionslösung gefüllte Auffanggefäß gelegt. Die V. portae und die A. hepatica wurden nun an den Perfusionskreislauf angeschlossen und die Perfusion begonnen. Die A. hepatica wurde über die noch offene A. gastroduodenalis entlüftet und anschließend ligiert. Die Entlüftung der V. portae erfolgte durch Füllen der Kanüle vor Konnektion an das Schlauchsystem.

Aus dem mit Perfusat gefüllten Reservoir des Membranoxygenators wurde die V. portae passiv durch Schwerkraft perfundiert. Der so erzielte Druck entsprach, in Abhängigkeit vom Leberwiderstand, einer Wassersäule von 10-20 cm. Die Perfusion der A. hepatica erfolgte druckkontrolliert mittels einer Rollerpumpe aus dem Flüssigkeitsreservoir. Der mittlere Druck lag zwischen 60-80 mmHg. Bezogen auf das Lebergewicht wurde ein Gesamtfluß von etwa 1-2 ml/g min erreicht. Der portalvenöse Fluß betrug ca. 2/3 und der arterielle Fluß etwa 1/3 der Gesamtflußmenge.

Der Abfluß aus der Leber erfolgte über die Venae hepaticae und die Vena cava inf. in das Auffanggefäß. Die zweite Rollerpumpe förderte Perfusat vom Auffanggefäß durch den Oxygenator in das Reservoir. Der Oxygenator wurde mit Carbogen (95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid) durchströmt. Für die Regelung der Perfusattemperatur auf 37±0,25°C wurde die IST-Perfusattemperatur im Schlauchsystem vor Eintritt des Perfusats in die Leber gemessen.

Das Flußschema des Kreislaufs ist in Abbildung 1 wiedergegeben.


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Abbildung 1: Schema des Perfusionssystems

2.1.2.1.1 Perfusat

Das verwendete Perfusat basierte auf einer in seiner Zusammensetzung dem Plasma ähnlichen Lösung. Bezeichnet wird diese Lösung als HPF 3. Sie besteht aus einem kristallinen Anteil und einem kolloidalen Lösungsmittel, dem Gelatine-Polypeptid (Hämaccel 35, Behring Werke, Marburg) 62 , 63 . 3 Liter HPF 3 wurden zu 1 Liter Vollblut gegeben. Daraus resultierte ein Hämoglobinwert von etwa 5 g/dl mit einem Hämatokrit von ca. 18%. Tabelle 1 gibt die Zusammensetzung von HPF 3 wieder. Vor Beginn der Perfusion wurden zur Bakteriostase einmalig 20 mg Tobramycin (Lilly, Gießen) zugegeben.


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Tabelle 1: Zusammensetzung der HPF 3-Lösung

Komponente

Konzentration

Na+

141 mmol/l

K+

3,3 mmol/l

Ca2+

1,6 mmol/l

Mg2+

0,5 mmol/l

Cl-

116 mmol/l

(HCO3)-

25 mmol/l

(SO4)2-

0,5 mmol/l

(HPO4)2-

0,6 mmol/l

(H2PO4)-

0,4 mmol/l

Glucose

5 mmol/l

Fructose

5 mmol/l

Linolsäure

1 mmol/l

Gelatine-Polypeptid

17,5 g/l

pH-Wert

7,4

Osmolalität

310 mosm/kg

2.1.2.1.2 Dialysekreislauf

Der Perfusionsaufbau wurde in Gruppe 2 um einen Dialysekreislauf erweitert. Der Dialysekreislauf wurde im Bypass angeschlossen (Abb.1). 1/5 des Perfusatflusses wurden hinter dem Auffanggefäß in den Dialysekreislauf und vor dem Oxygenator zurück in den Perfusionskreislauf gepumpt.

Der Dialysekreislauf bestand aus zwei Rollerpumpen (Stöckert, München), einem Dialysator (Gambro ALWALL GFS 12 Fiber Dialyzer, Gambro, Hechingen) und einem offenen 10l-Vorratsgefäß, welches das Dialysat enthielt.

Eine Rollerpumpe förderte das Perfusat durch das Kapillarsystem des Dialysators und zurück in den Perfusionskreislauf. Die zweite Rollerpumpe förderte das Dialysat im Gegenstrom. Jeweils vor dem Dialysator wurden die Drücke auf Perfusat- und Dialysatseite gemessen. Die transmembranöse Druckdifferenz wurde so gewählt, daß es zu keinem Flüssigkeitsübertritt von einem in das andere Kompartment kam. Somit konnten Volumenverschiebungen zwischen dem Perfusat und dem Dialysat vermieden werden. Die Volumenregulation auf Perfusat- und Dialysatseite erfolgte bei Druckgleichheit auf beiden Seiten der Kapillaren über die Flußeinstellung.


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2.1.2.1.3 Dialysat

Das Gesamtvolumen des eingesetzten Dialysats betrug 10l. Es wurde während der Perfusion nicht ausgewechselt. Die Zusammensetzung des Dialysats (Gambro, Hechingen) ist in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2: Zusammensetzung des Dialysats

Komponente

Konzentration

Na+

140 mmol/l

K+

3,0 mmol/l

Ca2+

0,8 mmol/l

Mg2+

0,375 mmol/l

Cl-

113 mmol/l

(CH3COO)-

2,5 mmol/l

(HCO3)-

37 mmol/l

Glucose

5 mmol/l

pH-Wert

7,5

Osmolalität

296 mosm/kg

2.1.3 Einteilung der Versuchsgruppen

Insgesamt wurden 33 Lebern entnommen. In 7 Versuchen, 3 in Gruppe 1 und 4 in Gruppe 2, mußte auf eine Auswertung wegen technischer Defekte, die unabhängig von den zu untersuchenden Parametern waren, verzichtet werden. Hierzu zählten 1x Luftembolie über die Gefäße, 2x geplatzte Schläuche, 1x Gerinnung des Perfusats im Transportbehälter, 2x Überschreiten der 90 min warmer Ischämie sowie 1x Stromausfall.

Um einen systematischen Fehler durch Trainingseffekt auszuschließen, wurden die Versuche abwechselnd durchgeführt. Die Modifikation der Perfusionsapparatur bestand im Abklemmen des Dialysekreislaufs.

Alle Lebern (n=26) wurden einer warmen Ischämiezeit von 90±2 min bei 37°C ausgesetzt. Anschließend wurden die ischämisch geschädigten Lebern über einen Zeitraum von 180 min isoliert extrakorporal perfundiert. Der einzige Unterschied zwischen beiden Gruppen war der Anschluß des Dialysekreislaufs während der Perfusion in Gruppe 2. Das Leberfeuchtgewicht in Gruppe 1 betrug 758±122 g in Gruppe 2 750± 89 g.


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2.1.4 Untersuchungsprogramm

2.1.4.1 Probennahme und Bestimmungen

Dem zirkulierenden Perfusat beider Gruppen wurden für die laborchemische Untersuchung Proben vor Anschluß der Leber an den Kreislauf, nach 30, 60, 90, 120, 150 und 180 min Perfusion entnommen. In Gruppe 2 wurden darüber hinaus die gleichen Meßgrößen auch im Dialysat bestimmt. Die erste Entnahme erfolgte vor Anschluß der Leber an den Kreislauf, nach 90 und 180 min Dialyse.

Die Analyten Natrium, Kalium, GOT, GPT, LDH und Harnstoff wurden im Zentrallabor der Klinik auf den Multianalysengeräten Bayer Dax 72 (Bayer Diagnostik/München) sowie Hitachi 911 (Boehringer/Mannheim) nach den optimierten Standardmethoden der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie bestimmt.

Blutgasanalysen wurden zu den Zeitpunkten der Probennahmen für die laborchemischen Untersuchung durchgeführt. Zur Berechnung des Sauerstoffverbrauches erfolgten die Messungen nach Anschluß der Lebern jeweils vor (arteriell) und nach (venös) Leberpassage. In der Gruppe 2 wurden aus dem Dialysat ebenfalls Proben gewonnen. Die untersuchten Analyten waren für das Perfusat: pH, O2- und CO2-Partialdruck, Standard-Bikarbonat und O2-Sättigung, im Dialysat nur der pH. Die Bestimmungen erfolgten an einem ABL 501 Blutgasanalysengerät (Radiometer, Kopenhagen, DK).

Der Sauerstoffverbrauch VO2 ergibt sich nach dem Fickschen Prinzip aus der Durchblutungsgröße Q und der Differenz der O2-Konzentrationen avDO2 aus dem zufließenden arteriellen und abfließenden venösen Blut entsprechend der Gleichung: VO2 = avDO2 x Q. Die Differenz der O2-Konzentrationen avDO2 berechnete sich hierbei als die Differenz des Gehaltes an chemisch gebundenem Sauerstoff im arteriellen und venösen Blut:

avDO2 = [O2]art. - [O2 ]ven . Der Gehalt an chemisch gebundenem Sauerstoff berechnet sich unter Berücksichtigung der Hüfner-Zahl (1,34 für Blut) aus der Hämoglobinkonzentration [Hb] und der Sauerstoffsättigung SO2 und wird als Sauerstoffkonzentration [O2] angegeben:

[O2] = 1,34 x [Hb] x SO2 x 10-5 .

Die Galle wurde über einen in den Ductus choledochus eingebundenen Schlauch in ein separates Röhrchen mit Millilitereinteilung abgeleitet und stündlich abgelesen. Somit konnte kontinuierlich die Galleproduktion gemessen werden.

Nach Reperfusion wurden die Lebern makroskopisch beurteilt. Kriterien waren die gleichmäßige rosige Färbung, das Auftreten von dunklen Arealen als Zeichen einer inhomogenen Perfusion mit mangelperfundierten Arealen sowie die Konsistenz der Lebern.


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2.1.4.2 Darstellung und Auswertung der Versuchsergebnisse

Die Darstellung der Versuchsergebnisse erfolgte als Mittelwert ± SEM der in den jeweiligen Gruppen erhobenen Werte. Aus den vor Anschluß des Perfusionskreislaufs gewonnenen Proben (n=26) wurden die Ausgangswerte für Natrium, Kalium, GOT, GPT, LDH und Harnstoff ermittelt (Tabelle 3) und mit den in der Literatur angegebenen Referenzbereichen verglichen (Tabelle 4). GOT, GPT, LDH und Harnstoff wurden zur besseren Vergleichbarkeit der Versuche auf ein Lebergewicht von 100g bezogen.

Die Nettobilanzen drücken aus, ob ein Stoff von seiner Anfangskonzentration oder -Aktivität im Perfusat während der Perfusion in seiner Konzentration oder Aktivität zunimmt, somit von den Zellen in das Perfusat freigesetzt wird, oder abnimmt, somit von den Zellen aus dem Perfusat aufgenommen wird. Neben der Gesamtbilanz für einen Stoff während der dreistündigen Perfusion bezogen auf den Ausgangswert im Perfusat wurden zudem Bilanzen für die ersten 90 min bezogen auf den Ausgangswert und für die folgenden 90 min bezogen auf den 90 min Wert berechnet. Somit konnte beurteilt werden, in welcher Phase der Perfusion der entsprechende Stoff in das Perfusat freigesetzt oder aus dem Perfusat aufgenommen wird. Da das Verteilungsvolumen durch die parallele Dialyse in der Gruppe 2 für dialysierbare Substanzen um 10l größer war als in Gruppe 1, wurde in beiden Gruppen die Gesamtkonzentration umgerechnet in die absolute Menge eines Stoffes im Perfusat und dem Dialysat.

Signifikante Unterschiede bei Anschluß des Dialysekreislaufs wurden durch einen Vergleich der jeweiligen Parameter beider Gruppen mit dem parametrischen t-Test bzw. dem verteilungsfreien Mann-Whitney Ranksummentest untersucht. Das Signifikanzniveau wurde mit p<0,05 definiert.

Tabelle 3: Ausgangswerte (n=26) im Perfusat nach Zugabe von HPF3.

Komponente

Konzentration

Natrium

145

±

1,0

mmol/l

Kalium

5,0

±

0,4

mmol/l

GOT

5,4

±

1,4

U/l pro 100g

GPT

1,4

±

0,2

U/l pro 100g

LDH

20

±

2,0

U/l pro 100g

Harnstoff

1,3

±

0,2

mg/dl pro 100g

pH-Wert

7,4

±

0,01

 


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2.2 Lebertransplantation nach vorausgegangener NELP

2.2.1 Versuchstiere

Als Versuchstiere fanden weibliche Hausschweine der Deutschen Landrasse im Alter von zweieinhalb bis vier Monaten mit einem Gewicht von 24±6 kg Verwendung. Die Schweine wurden in der Woche vor dem Experiment vom Züchter (Sommerfeld, Brandenburg) angeliefert. Die Unterbringung erfolgte im Forschungshaus der Charité, Campus Virchow-Klinikum. Die Tiere wurde vom Veterinär untersucht, gewogen und zunächst gemeinsam in einem Auslauf mit freiem Zugang zum Wasser untergebracht. Sie wurden zweimal am Tag mit standardisierter und pelletierter Nahrung gefüttert (Mpig-H, Sniff Spezialitäten GmbH, Soest) und bei einer Umgebungstemperatur zwischen 20-22°C und einer Luftfeuchtigkeit von 50-70% gehalten.

Am Tag vor der Transplantation wurden drei Schweine von der Gruppe isoliert und einzeln in Käfigen untergebracht: Ein Schwein als Spender, eins als Empfänger und eins als Ersatztier. Als Spender-Empfänger-Paar wurden Tiere mit ähnlichem Gewicht ausgewählt. 24 Stunden vor dem Versuch erhielten die Tiere nur Wasser und wurden nüchtern belassen.

Die Versuche waren zuvor von der Senatsverwaltung für Gesundheit und Soziales, Berlin, genehmigt worden und wurden vom Tierschutzbeauftragten ständig überwacht.

2.2.2 Einteilung der Versuchsgruppen

Es wurden sechs Versuchsgruppen gebildet. Die Versuchsgruppen unterschieden sich nur in der Behandlung der Spenderlebern. Die Technik der Spenderoperation ist im Detail in Kapitel 2.2.4 erläutert. Es wurden sechs Versuche pro Versuchsgruppe durchgeführt. Die Abfolge der Versuche wurde randomisiert, um den Einfluß eines möglichen Trainingseffekts zu minimieren.

2.2.2.1 Gruppe 1: sofortige Lebertransplantation

In Gruppe 1 wurden das Spender- und Empfängertier mit zwei Operationsteams simultan operiert, um im Anschluß an die Hepatektomie sofort transplantieren zu können. Die Transplantation der Spenderleber erfolgte sofort nach Entnahme ohne Konservierung oder Perfusion. Die operationstechnisch bedingte warme Ischämie bis zur Reperfusion im Empfänger betrug dabei 36±3 min.


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Abbildung 2: Gleichzeitige Operation von Spender und Empfänger in Gruppen 1 und 4.

2.2.2.2 Gruppe 2: 4h Kaltkonservierung in UW vor Lebertransplantation

In Gruppe 2 wurden nach Präparation der Leber Perfusionskanülen in die Vena portae und Aorta gelegt. Zur Organkonservierung wurden 1l 4°C kalter UW-Lösung portal und 500 ml aortal infundiert. Anschließend wurde die Spenderleber steril in einem mit UW-Lösung gefüllten Kunststoffbeutel eingepackt und in einer Kühlbox mit Eiswasser über 4h bei 0°C konserviert. Eine Stunde vor Ende der Kaltkonservierung wurde das Empfängertier vorbereitet und hepatektomiert, so daß nach 4h ohne Verzögerung mit der Transplantation begonnen werden konnte. Die Aufwärmzeit zwischen Entnahme aus der kalten Konservierungslösung und Reperfusion im Empfänger nach Lebertransplantation betrug 35±5 min.

2.2.2.3 Gruppe 3: 4h NELP vor Lebertransplantation

In Gruppe 3 wurden die infrahepatische Vena cava inferior der Spenderleber, der Truncus coeliacus, Vena portae und der Ductus choledochus mit Nirosta-Spiralen tragenden Perfusionsschläuchen kanüliert (Abb. 3). Diese Schläuche wurden durch die


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halbmondförmige Durchtrittsplatte der Perfusionskammer gezogen (Abb.4). Die suprahepatische Vena cava inferior wurde abgeklemmt und ligiert. Anschließend wurde die Leber entnommen und in einen sterilen Perfusionsbeutel gelegt und in den Perfusionsraum transportiert. Es erfolgte der Anschluß der Leber an den vorbereiteten Perfusionskreislauf. Mit Reperfusion in der NELP-Maschine wurden ca. 250 ml Perfusat verworfen, bevor der rezirkulierende Kreislauf hergestellt wurde. Für die Entnahme, die Plazierung der Kanülen und den Anschluß der Leber wurden 15±3 min benötigt. Die Leber wurde in der Perfusionskammer für 4h normotherm bei 37°C perfundiert. Eine Stunde vor Perfusionsende wurde mit der Empfängeroperation begonnen. Nach Entnahme der Spenderleber aus der NELP-Maschine dauerte es 35±5 min Minuten bis zur Perfusion im Empfänger.

Abbildung 3: Plazierung der mit Spiralen versehenen Perfusionsschläuche in V. portae und infrahepatischer V. cava inf. sowie in Ductus choledochus und A. hepatica


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Abbildung 4: Plazierung der Schläuche in der Durchtrittsplatte für die Perfusionskammer


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Gruppen 4, 5 und 6: 1h warme Ischämie vor Lebertransplantation

In den Gruppen 4, 5 und 6 wurde die Spenderleber für eine rasche Entnahme vorbereitet. Nach Laparotomie wurde die Leber freipräpariert, das Lig. hepatoduodenale durchtrennt und ligiert, die zu- und abführenden Gefäße der Leber blieben dabei intakt. Anschließend wurden 10.000 IE Heparin injiziert. Unter Narkose wurde durch Entblutung der Herzstillstand beim Spendertier herbeigeführt. Anschließend wurden die Bauchdecken aneinander gelegt und mit Bauchtuchklemmen verschlossen, um eine Abkühlung der intraabdominellen Organe zu vermeiden. Da das Spendertier weiterhin auf der Wärmeplatte lag, sank die Temperatur des Abdomens, die jeweils am Ende des 60 minütigen Ischämieintervalls gemessen wurde, wie auch die weiterhin online bestimmte Körperkerntemperatur nicht unter 34°C. Exakt nach 60 min wurden die Bauchtuchklemmen gelöst, die V. portae, die Aorta, der Ductus choledochus sowie die supra- und infrahepatische V. cava inferior durchtrennt.

2.2.2.4 Gruppe 4: 1h warme Ischämie und anschließend Lebertransplantation

Anschließend erfolgte in Gruppe 4 analog zur Gruppe 1 die sofortige Transplantation in den vorbereiteten Spender. Nach Explantation aus dem nicht herzschlagenden Spender bis zur Reperfusion im Empfänger vergingen 43±4 min. Die Lebern der Gruppe 4 waren somit für einen mittleren Zeitraum von 103±4 min ischämisch.

2.2.2.5 Gruppe 5: 1h warme Ischämie, 4h kalte Ischämie in UW und anschließend Lebertransplantation

In Gruppe 5 wurde die Infusion von 1l 4°C kalter UW-Lösung portal und 0,5l arteriell auf dem Backtable analog zu Gruppe 2 durchgeführt. Die Konservierungszeit betrug 4h. Von der Entnahme aus dem 0°C kalten Konservierungsbeutel bis zur Reperfusion im Empfängertier vergingen 35±5 min.

2.2.2.6 Gruppe 6: 1h warme Ischämie, 4h NELP und anschließend Lebertransplantation

In Gruppe 6 wurde analog zu Gruppe 3 vorgegangen. Hierzu wurden die Perfusionskänülen mit Nirosta-Spiralen in die entsprechenden Gefäße plaziert, die Leber im Perfusionsbeutel zur Leberperfusionsmaschine transportiert und angeschlossen (Abb. 5). Für die Entnahme, die Plazierung der Kanülen und den Anschluß der Leber wurden 16±3 min benötigt. Der Perfusionszeitraum betrug 4 Stunden. Bis zur Reperfusion im Empfängertier vergingen nach der Beendigung der NELP 37±6 min.

Das auf der über nächsten Seite folgende Schema der Abbildung 6 verdeutlicht den Aufbau des Versuchsprotokolls.


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Abbildung 5: Blick durch den Deckel der Perfusionskammer auf die perfundierte Leber fünf Minuten nach Reperfusion. Der sterile Kunststoffbeutel isoliert die Leber vom temperierten Wasser der Perfusionskammer. Die Leber schwimmt ohne Kontakt zu den Plexiglaswänden in der Perfusionskammer. Gut sichtbar ist der Silikonschlauch der Pfortader und rechts davon der Silikonschlauch der V. cava. In Bildmitte befindet sich das Gallenblasenbett nach Cholecystektomie.


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Abbildung 6: Übersicht der Versuchsgruppen


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2.2.3 Narkose

Die Prämedikation der Schweine erfolgte mit einer intramuskulären Injektion von 4 mg/kg Körpergewicht Azoperon (Stresnil®, Janssen-Cilag, Neuss) und 0,5 mg Atropinsulfat (Braun, Melsungen) in die Nackenmuskulatur. Eine ausreichende Sedierung war 15 bis 20 min nach Prämedikation erreicht. Das sedierte Schwein wurde auf einem Operationstisch mit unterliegender Wärmeplatte gelagert und in den Narkoseeinleitungsraum gebracht. Es wurden zwei Braunülen in die Ohrvenen jeder Seite gelegt. Die Narkose wurde mit Metomidatehydrochlorid (Hypnodil®, Janssen-Cilag, Neuss) in einer Dosierung von 4 mg/kg Körpergewicht und 0,1 bis 0,2 mg Fentanyl (Fentanyl®, Janssen-Cilag, Neuss) als Bolusinjektion eingeleitet. Anschließend wurde endotracheal intubiert und mit 4 mg Pancuroniumbromid (Pancuronium Curamed®, Schwabe-Curamed, Karlsruhe) relaxiert. Als Beatmungssystem diente ein Siemens 900 Respirator. Es wurde eine volumenkontrollierte CMV-Beatmung mit einem inspiratorischen Gasgemisch aus 40% O2 und 60% CO2 durchgeführt. Es wurde Normokapnie (CO2-Partialdruck im arteriellen Blut: 36 bis 40 mmHg) angestrebt und durch regelmäßige Kontrollen der arteriellen Blutgase (ABL Autoanalyzer, Radiometer, Kopenhagen, DK) sichergestellt. Die Atemfrequenz lag zwischen 8 und 10 min-1 und das Atemminutenvolumen je nach Körpergewicht des Schweins und den Ergebnissen der Blutgasanalysen zwischen 3,2 und 4 l/min. Mit der Blutgasanalyse wurden in regelmäßigen Abständen außer pO2 und pCO2 auch der Basenüberschuß, O2-Sättigung, pH, Hämoglobin, Hämatokrit, Natrium und Kalium bestimmt.

Die Füße der Schweine wurden am Operationstisch fixiert, Bauch und Hals rasiert und abgewaschen. Am Thorax wurden drei Elektroden zur EKG-Ableitung befestigt. Beim Empfängertier wurde ein Blasenkatheter mit einer Temperatursonde bei steriler Vorgehensweise gelegt. Anschließend wurde die linke Arteria carotis communis perkutan unter sterilen Kautelen punktiert und ein Katheter für die kontinuierliche invasive Blutdruckmessung und für Blutentnahmen eingeführt. In die linke Vena jugularis externa wurde eine Schleuse gelegt, über die beim Spendertier ein zentraler Venenkatheter in die Vena cava superior geschoben wurde. Beim Empfängertier wurde unter EKG-Kontrolle und kontinuierlicher invasiver Druckmessung ein Swan-Ganz-Katheter in die Pulmonalarterie eingeschwemmt. Das vorbereitete Schwein wurde anschließend in den Operationssaal gebracht und an den entsprechenden Monitor und den Siemens 900 Respirator angeschlossen.

Die Narkose wurde durch kontinuierliche Infusion von Metomidatehydrochlorid (Hexal, Holzkirchen) und Fentanyl aufrechterhalten. Über zwei Perfusoren wurde Metomidatehydrochlorid in einer Dosierung von 0,1 mg/kg min sowie Fentanyl in einer Dosierung von 0,15 µg/kg min kontinuierlich intravenös über die Ohrvenen infundiert. Zur Relaxation wurden bei Bedarf Repetitionsgaben von 1 - 4 mg Pancuroniumbromid verabreicht. Intraoperativ wurden Atemfrequenz, Atemzugvolumen, Atemminutenvolumen, Atemspitzendruck, inspiratorische Sauerstoffkonzentration, endexspiratorischer Kohlendioxidpartialdruck, PEEP, Herzfrequenz, arterieller, pulmonalarterieller und zentraler


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Blutdruck, Herzminutenvolumen, Körperkerntemperatur und Urinausscheidung kontinuierlich überwacht.

Die Normovolämie wurde durch intravenöse Infusion von 38°C warmem Jonosteril (Fresenius, Bad Homburg) und 10% HAES (Fresenius, Bad Homburg) aufrechterhalten. Der Flüssigkeitsersatz erfolgte in Abhängigkeit vom zentralvenösen und systemischen arteriellen Druck, die möglichst konstant gehalten wurden. Das Spenderschwein erhielt 1l 10% HAES- und 2-4l Jonosterilinfusionen. Das Empfängerschwein erhielt 1l 10% HAES, 0,5-1l Jonosteril und 0,5-3,5l Vollblut vom Spendertier, wenn der Hb-Wert unter 5 g/dl abfiel. Bei einer Herzfrequenz >160 min-1 wurde Pindolol (Visken®, Novartis Pharma, Nürnberg) abhängig vom Effekt auf den systemischen Blutdruck fraktioniert verabreicht.

Beim Empfängertier wurde vor dem Abklemmen der Gefäße zur Hepatektomie und dem passiven extrakorporalen Bypassanschluß mit 500 IE Heparin (Liquemin®, Roche, Grenzach-Wyhlen) pro kg Körpergewicht intravenös antikoaguliert.

Bei geöffnetem Bypass sollte der arterielle Blutdruck nicht mehr als 10-15% sinken und der ZVD bei 12 mmHg bleiben. Es wurde je nach Bedarf fraktioniertes, auf 1:100.000 verdünntes Noradrenalin (Arterenol®, Hoechst, Bad Soden am Ts.) injiziert. Vor Reperfusion der Vena portae erhielt der Empfänger 50-100 ml 8,4% Natriumbikarbonat nach vorheriger Blutgasanalyse, 500-1000 mg Methylprednisolon (Urbason® solubile forte 1000, Hoechst, Frankfurt), 100 mg Ranitidin (Sostril®, Glaxo Wellcome-Cascan, Hamburg), 2 g Cefotiam (Spizef®, Takeda, Aachen), 500 mg Metronidazol (Clont®, Bayer Vital, Leverkusen) und je nach Bedarf Lidocain (Steigerwald, Darmstadt) oder Forusemid (Lasix®, Hoechst, Bad Soden am Ts.).

Die Narkose wurde mit dem Wechsel der CMV-Beatmung zur CPAP-Beatmung während der Anastomose des Ductus choledochus beendet. Nach Beendigung der Bauchnaht und einer Kontrollphase von 30 min erfolgte bei einer inspiratorischen Sauerstoffkonzentration von 20% und beim Vorliegen von Spontanatmung die Extubation der Empfängertiere. Zur Antagonisierung der Fentanylwirkung wurden Naloxon (Schwabe-Curamed, Karlsruhe) und Physiostigmin (Anticholium®, Köhler, Alsbach-Hähnlein) appliziert.

2.2.4 Lebertransplantation

Die Explantation der Leber beim Spender und die Implantation beim Empfänger wurde, mit einigen weiter unten beschriebenen Modifikationen, nach der von Sir Roy Calne 1968 entwickelten Technik zur orthotopen Lebertransplantation beim Schwein durchgeführt. Der Operationsablauf bei der Schweinelebertransplantation entspricht in Hinblick auf die personellen Anforderungen, das Instrumentarium und die sterilen Kautelen im wesentlichen der Vorgehensweise bei der humanen Transplantationschirurgie. Alle Transplantationen wurden vom gleichen Chirurg durchgeführt. Zum Opera


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tionsteam zählten ein japanischer Gastchirurg, ein Assistent der Klinik, zwei Doktoranden und eine Operationsschwester zur Instrumentation.

2.2.4.1 Spendertiere

Es erfolgte eine mediane Oberbauchlaparotomie vom Processus xyphoideus bis caudal in Höhe der Harnblase. Der Situs wurde mit Hilfe eines großen Operationsrahmens eingestellt. Das Ligamentum falciforme, triangulare sinistrum und die retroperitoneale Vena Cava-Membran wurden durchtrennt. Nach Spaltung des Omentum minus wurden die supra und infrahepatische Vena cava mit einem Mersilenebändchen angeschlungen. Es folgte die Präparation des Leberhilus. Die Arteria hepatica wurde bis zum Truncus coeliacus und seinem Ursprung aus der Aorta freipräpariert. Dabei wurden die Aa. gastrica sinistra und dextra abgesetzt und ligiert. Die Pfortader wurde von der Leberpforte bis hin zum Venenkonfluenz unterhalb des Pankreas dargestellt, um eine ausreichende Länge für die spätere Anastomose zu gewinnen. Um ebenfalls ein ausreichend langes Segment der suprahepatischen V. cava zu erhalten, wurde das Zwerchfell zirkulär mit einem 2 cm breiten Saum durchtrennt und das Gefäß bis zu seinem Eintritt in den rechten Vorhof dargestellt. Die Zwerchfellvenen wurden mit Durchstichligaturen verschlossen. Anschließend erfolgte die Unterbindung und Durchtrennung der A. cystica und des Ductus cysticus mit darauf folgender Cholecystektomie.

Durch Entblutung über die Katheter in der Arteria carotis communis und in der Vena jugularis externa wurde ein Herzstillstand bei dem Spender unter Fortführung der Narkose herbeigeführt. Das Blut wurde steril aufbewahrt, um es gegebenenfalls dem Empfängertier transfundieren zu können. Nach Hepatektomie wurde die Spenderleber gewogen und entsprechend den Gruppen weiter behandelt.

2.2.4.2 Empfängertiere

Das chirurgische Vorgehen beim Empfängertier war für alle 6 Gruppen gleich. Die Empfängerleber wurde ähnlich wie beim Spendertier mobilisiert. Simultan wurde ein passiver veno-venöser Bypass vorbereitet. Der Bypass bestand aus drei sterilen Kathetern der Größe 20 bis 24 Ch. und einem Y-Stück. Zuerst wurde der Katheter am geraden Y-Stück in die zuvor freigelegte linke V. jugularis interna, ein weiterer Katheter in die Vena portae und zuletzt in die infrahepatische Vena cava inferior eingesetzt, abgeklemmt und entlüftet. Die suprahepatische Vena cava inferior wurde mit zwei Satinskyklemmen abgeklemmt. Vor Freigabe des Bypasses wurden dem Empfängertier 500 IE Heparin (Liquemin®) pro kg Körpergewicht appliziert. Anschließend erfolgte die Hepatektomie, hierbei wurden die Gefäße sowie der Ductus choledochus, anders als bei der Spenderoperation, dicht an der Leber durchtrennt.

Um die ischämische Phase des Transplantats zu minimieren, wurde nach Anastomose der suprahepatischen V. cava inferior die V. portae genäht, der Bypass abgeklemmt und die Perfusion freigegeben. Die ersten 150 bis 200 ml wurden bei geschlossener


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Satinskyklemme über die infrahepatische V. cava inferior abgelassen und verworfen. Anschließend wurde die infrahepatische Vena cava inferior wieder abgeklemmt und die suprahepatische Vena cava inferior freigegeben. Es folgten die Anastomosen der infrahepatischen Vena cava inferior und anschließend der Arteria hepatica. Abweichend von Calnes Beschreibung, wurde die Anastomose nicht mit einem Carrell Patch auf die Aorta genäht, sondern End-zu-Seit mit 7.0 Prolene auf die Gabel der empfängerseitigen A. gastroduodenalis und A. hepatica communis. Hieraus leiten sich zwei entscheidende Vorteile ab: Es besteht nicht die Gefahr einer Verletzung des Ductus thoracicus, der beim Schwein ¾ der Zirkumferenz der Aorta einnimmt. Zweitens ist es nicht nötig, die Aorta mit den damit verbundenen hämodynamischen und ischämischen Konsequenzen für die Niere abzuklemmen. Nach der Anastomosierung der Arteria hepatica erfolgte die Gabe von 1 mg Protaminsulfat (Protamin®, ICN, Frankfurt am Main) pro 100 IE applizierten Heparins zur Antagonisierung der antikoagulativen Wirkung.

Zuletzt wurde der Ductus choledochus anastomosiert. Auf Grund seiner Größe beim Schwein bewährt sich eine End-zu-End-Anastomose. Bei der humanen Transplantation gibt es hingegen weniger Komplikationen bei einer Seit-zu-Seit-Anastomosetechnik 65 . Die Transplantation war mit der Bauchnaht abgeschlossen. Um die Tiere keinem unnötigen Streß bei den täglichen postoperativen Blutentnahmen auszusetzen, wurden intraoperativ Katheter in die Vena jugularis interna und Arteria carotis communis plaziert, die postoperativ mühelose Blutentnahmen erlaubten.

2.2.4.3 Postoperative Nachsorge

Nach Extubation wurden die Tiere in einem Käfig unter Infrarotstrahlern gehalten. Während der ersten 12 postoperativen Stunden wurde das jeweilige Tier kontinuierlich vom Operateur oder einem Assistenten intensivmedizinisch überwacht. Das intensivmedizinische Monitoring bestand in Online-Messungen des arteriellen und zentralvenösen Blutdrucks, Überwachung und Bilanzierung der Ausscheidung, stündlicher Durchführung von Blutgas- und Hb-Analysen sowie einer tierschutzgerechten Analgisierung. Ferner wurden Blutproben zur Serumanalytik nach 3, 6 und 12h entnommen. In Abhängigkeit von den Analysewerten wurde intravenös Jonosteril®, Vollblut, Kalium, Calcium und ggf. auch Furosemid verabreicht.

Die Tiere hatten vom ersten postoperativen Tag an freien Zugang zum Wasser. Futter erhielten sie ab dem zweiten postoperativen Tag. In den ersten drei postoperativen Tagen erfolgte eine Infektionsprophylaxe durch zweimal tägliche Infusionen von 2 g Cefotiam (Spizef®, Takeda Pharma, Aachen) und 500 mg Metronidazol (Clont®, Braun, Melsungen). Bei Verdacht auf eine Infektion (Körpertemperatur >39,5°C und Leukozytose) wurde die antibiotische Therapie nach dem dritten Tag fortgeführt. Die Gabe von 40 mg Omeprazol (Antra 20®, Astra, Wedel) zur Ulkusprophylaxe erfolgte täglich. Ab dem zweiten postoperativen Tag wurden die Tiere mit der intramuskulären Gabe von 2,5 mg Ciclosporin A (Sandimmun®, Sandoz SA, Basel, Schweiz) pro kg Körpergewicht immunsupprimiert. Die Tiere wurden durch intravenöse Applikation von Kali


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umchlorid und Thiopental (Trapanal®, Byk Gulden, Konstanz) getötet. Anschließend erfolgte die Obduktion aller Tiere.

2.2.5 Untersuchungsprogramm

2.2.5.1 Probennahmen

2.2.5.1 Prä- und postoperative Blutentnahmen

Präoperativ erfolgte eine Blutentnahmen jeweils beim Spender- und Empfängertier über die Ohrvene. Intraoperativ und in den ersten Stunden nach Transplantation wurden kurz vor der portalvenösen Reperfusion, 15 min, 1h, 3h, 6h und 12h nach der portalvenösen Reperfusion beim Empfänger Proben entnommen. Die Blutentnahmen wurden über die intraoperativ plazierten Katheter in der Vena jugularis interna und der Arteria carotis communis durchgeführt. An den postoperativen Tagen erfolgten die Blutentnahmen täglich. Das Blut wurde in Monovetten abgenommen und im Zentrallabor untersucht. Für Spezialbestimmungen wurde das Blut einer weiteren Monovette mit 3000 min-1 zentrifugiert, das Plasma abpipettiert und in zehn Eppendorf-Gefäßen pro Entnahme bis zur Bestimmung bei -80°C aufbewahrt.

Probennahmen während der extrakorporalen Leberperfusion

Während der extrakorporalen, normothermen Perfusion der Spenderleber wurden Proben simultan aus dem Perfusions- und Dialysekreislauf entnommen. Die Entnahmen aus dem Perfusionskreislauf erfolgten über einen 3-Wege-Hahn aus dem von der Vena cava inferior wegführenden Schlauch und aus dem Dialysekreislauf über einen 3-Wege-Hahn vor dem Reservoir. Die erste Perfusatprobe wurde vor dem Start der Dialyse genommen. Die nächste Probennahme folgte simultan aus Perfusat und Dialysat 15 min nach Anschluß der Dialyse, aber vor Leberanschluß. Nach Leberanschluß wurden Entnahmen nach 5, 15, 30, 60, 120, 180 und 240 min Leberperfusion durchgeführt. Das Perfusat wurde zentrifugiert und das Plasma abpipettiert. Bis zur Bestimmung wurden die Perfusat- und Dialysatproben bei -80°C gelagert.

2.2.5.2 Viabilitätsparameter

2.2.5.2 Postoperative Bestimmungen im Serum

Aus den präoperativ von Spender- und Empfängertieren entnommenen Blut wurden die Ausgangswerte ermittelt. Die Werte wurden als Mittelwerte ± SEM angegeben. Die Bestimmungen der biochemischen Routineparameter wie Bilirubin, Gesamtprotein, Albumin, TPZ, PTT, Fibrinogen, Ammoniak, Harnstoff, Kreatinin, GOT, GPT, LDH und


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alkalische Phosphatase erfolgten am gleichen Tag im Technicon DAX-System (Technicon Instruments Corporation, Tarrvtown, New York, USA) im Zentrallabor der Charité, Campus Virchow-Klinikum.

Die Konzentration der alpha-Glutathion-S-Transferase (alpha-GST) wurde mit einem schweinespezifischen alpha-GST-ELISA-Testkit (Biotrin HepkitTM, Biotrin International, Dublin, Irland) bestimmt. Die Kreuzreaktivität zwischen humaner und porciner alpha-GST bei diesem quantitativen Enzymimmunoassay liegt unterhalb der Nachweisgrenze von 0,69 µg/l. Der Test basiert auf einer Reaktion der alpha-GST mit biotinyliertem Antikörper
(Anti-Schweine-alpha-GST-IgG-Antikörper), Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat (HRP: horseradish peroxidase) und Anti-Schweine-alpha-GST-IgG-Antikörper. Die Extinktion der angesetzten Proben wurde an einem Photometer (Dynatech MR 5000, DPC Biermann GmbH, Bad Neuheim) bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.

Die Hyaluronsäure wurde mit einem Radioimmunoassay bestimmt (Pharmacia HA Test, Uppsala, Schweden), der auf einem spezifisch Hyaluronsäure bindenden, mit 125I-markierten Protein basiert. Das ungebundene 125I-HABP wird abgetrennt und die Radioaktivität in einem gamma-Counter gemessen. Die Meßwerte verhalten sich dabei umgekehrt proportional zu den Konzentrationen [µg/l] in den Proben.

2.2.5.3 Galleproduktion

Der Gallefluß ist ein empfindlicher und hoch signifikanter Parameter zur Beurteilung der Leberfunktion 57 , 58 . Die Galleproduktion wurde während der extrakorporalen Perfusion der Gruppe 3 und 6 bestimmt. Hierzu wurde eine Heidelberger Verlängerung in den Ductus choledochus eingelegt und aus der Perfusionskammer heraus in ein separates Röhrchen mit Millilitereinteilung abgeleitet. Dadurch konnte die Galleproduktion kontinuierlich gemessen werden. Wegen der Abhängigkeit von der Leberzellmasse wurde die Galleproduktion zur besseren Vergleichbarkeit der Versuchsgruppen auf 100 g Lebergewicht bezogen. Auf die Einlage einer T-Drainage nach Lebertransplantation zur Bestimmung der Galleproduktion wurde verzichtet. Durch die Aktivität der Schweine wurde das Risiko einer Dislokation oder Infektion mit den dadurch verbunden Komplikationen als zu groß eingestuft.

2.2.5.4 Darstellung und Auswertung der Versuchsergebnisse

Alle gemessenen Werte werden in Form von Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Für die statistischen Tests wurde ein Signifikanzniveau von p<0,05 definiert. Aus dem präoperativ vom Spender und Empfänger (n=36) entnommenen Blut wurden Ausgangswerte ermittelt. Postoperative Abweichungen wurden mit dem gepaartem t-Test bzw. Wilcoxon-Test untersucht. Für den Vergleich wiederholter Messungen für mehrere Wertegruppen gleichzeitig wurde eine Varianzanalyse mit paarweisem Vergleich von Mittelwerten (repeated measurement ANOVA) durchgeführt. Die Versuchsgruppen


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1-6 untereinander wurden mit dem t-Test oder mit dem Mann-Whitney Ranksummentest verglichen. Für den Vergleich mehrerer Gruppen gleichzeitig für einen bestimmten Meßzeitpunkt wurde die Varianzanalyse (ANOVA) herangezogen.

Wenn eine Varianzanalyse einen signifikanten p-Wert ergab, wurden für die einzelnen Gruppen multiple Vergleiche gegen eine gewählte Kontrollgruppe (Gruppe 2) durchgeführt. Bei Vorliegen einer Normalverteilung waren dies der Bonferroni t-Test oder Dunnett‘s Test. Der Dunnett‘s Test und Dunn‘s Test sind die entsprechenden verteilungsfreien Verfahren. Die statistische Auswertung erfolgte in Kooperation mit dem Statistischen Institut der Freien Universität Berlin.

Tabelle 4: Gemessene Ausgangswerte der Versuchstiere im Serum sowie die Referenzbereiche aus der Literatur

Komponente

Ausgangswerte

Referenzbereich

Natrium

137,8

± 0,6

143

± 3,9

mmol/l

 

Kalium

3,7

± 0,1

5,3

± 0,7

mmol/l

 

alpha-GST

8,5

± 0,7

*

 

µg/l

 

GOT

26

± 1

14

- 50

U/l

 

GPT

23

± 1

19

- 65

U/l

 

LDH

610

± 18

480

- 740

U/l

 

gamma-GT

22

± 1

11

- 38

U/l

 

Alkalische Phosphatase

137

± 4

90

- 145

U/l

 

Gesamtbilirubin

0,40

± 0,03

0,3

± 0,1

mg/dl

 

Kreatinin

1,3

± 0,3

0,85

± 0,16

mg/dl

 

Hyaluronsäure

232

± 18

90

- 190

µg/l

 

Protein

5,0

± 0,1

6,4

± 0,5

g/dl

 

Albumin

2,60

± 0,06

3,8

± 0,4

g/dl

 

partielle Thromboplastinzeit (PTT)

30

± 1

33,8

± 0,4

s

 

Ammoniak

33

± 1

30,5

± 5

µmol/l

 

Harnstoff

19,0

± 0,6

10,3

± 3,2

mg/dl

 

* Literatur über den Referenzbereich der alpha-GST liegt für das Schwein bisher nicht vor, da wir erstmals die alpha-GST für das Schwein evaluiert haben.


37

2.2.6 NELP der Gruppen 3 und 6

2.2.6.1 Neuentwicklung des Leberperfusionssystems mit integrierter Dialyse

Während für die Perfusion von Schlachthoflebern nur auf keimreduzierte Bedingungen geachtet wurde, stellt die Transplantation einer extrakorporal perfundierten Leber höchste Anforderungen an die Sterilität. Des weiteren sollte, auf den in Teil I gewonnenen Erkenntnissen aufbauend, der Kreislauf um eine Dialyseeinheit erweitert werden. Aus diesen Gründen war es notwendig, eine neues Leberperfusionssystem zu entwickeln.

Das neue Perfusionssystem nutzt die Doppelkopfrollerpumpen und Apparatekonsole, wie auch das Bedienungspanel aus der Geräteserie S3 der Firma Stöckert, München. Diese Komponenten finden Verwendung für Herz-Lungen-Maschinen und erfüllen somit höchste Sicherheitsanforderungen. Die Rollerkopfpumpen wurden in langjähriger Entwicklungsarbeit für eine minimale Schädigung der korpuskulären Blutbestandteile optimiert, um einer Hämolyse entgegen zu wirken. Erstmals wurde in dieses System ein CAN-Bus (controller area network) eingearbeitet, der die einzelnen Komponenten auf digitalem Wege integriert und ein Online-Monitoring aller Pumpen inklusive der Drücke und Flüsse im Perfusionssystem ermöglicht. Für das Monitoring war es nötig, eine Software zu programmieren, deren Grundlage das Schalt- und Flußdiagramm des Perfusionskreislaufs war. Abbildung 7 zeigt hierzu ein Monitorbild, welches während der Perfusion auf einem Notebook angezeigt wurde. Es lassen sich somit die arteriellen und portalvenösen Widerstände ermitteln, auf einem Monitor anzeigen und über eine Änderung der Pumpgeschwindigkeiten die Flüsse direkt regeln.

2.2.6.2 Überwachung der Druck- und Flußregulation

Während der Perfusion sollte ein möglichst konstanter Fluß durch die Leber aufrecht erhalten werden 68 . Die Flußmessung erfolgte jeweils an den Rollerpumpen. Insgesamt wurden sechs Rollerpumpen verwendet:

arterieller Zufluß über die A. hepatica (Pumpe 3A)

arterieller ( Pumpe 2B) und venöser (Pumpe 2A) Zufluß über die Vena portae

Fluß des Perfusats durch den Dialysator (Pumpe 3B)

für das Dialysat (Dialysatpumpe)

im Wasserkreislauf (Wasserpumpe)

Die Drücke der drei Blutgefäße wurden mit Druckaufnehmern in Hilushöhe kurz vor dem Durchtritt der Schläuche durch die halbmondförmige Durchtrittsplatte kontinuierlich gemessen. Die Blutflüsse wurden über die Drücke reguliert. Mittels übergeordneter Steuerung wurden leberspezifische Grenzdrücke für die Rollerpumpen so vorgegeben,


38

daß sich ein Blutfluß von 1 ml/min und g, bestehend aus dem arteriellen und portalvenösen Perfusat, ergab. Beim Überschreiten des Grenzdruckes während der Perfusion in Vena portae oder A. hepatica wurde die versorgende Pumpe (2A, 2B oder 3A) jeweils automatisch abgeschaltet, sofern der Grenzdruck nicht entsprechend verändert wurde.

Die Pumpen 2A und 2B arbeiteten voneinander abhängig im Master-and-Slave-Betrieb. Die den arteriellen Anteil fördernde Pumpe 2B war druckreguliert. Die den venösen Anteil fördernde Pumpe 2A war volumenreguliert und folgte mit der gleichen Perfusatmenge den Vorgaben der Pumpe 2B.

Abbildung 7: Dargestellt ist das Monitorbild vor Beginn der Perfusion. Blau korrespondiert mit dem venösen Perfusat, rot mit dem arterialisierten Perfusat. Die Farbe Gelb weist darauf hin, daß das in die V. portae gepumpte Perfusat gemischtvenös war. Die Kästchen zeigen online die Flüsse in ml/min, Drücke in mmHg und den berechneten Widerstand in p/V an.

An der Regulation war des weiteren das Reservoir 1 mit kapazitivem Niveauregler beteiligt. Durch den Niveauregler wurde der Pegel im Reservoir 1 konstant gehalten. Das Unterschreiten der vorgegebenen Füllmenge von 1400 ml Perfusat in Reservoir 1 wurde am Monitor angezeigt. Bei vollständiger Entleerung der Reservoire wurde Pumpe 3B am abführenden Schenkel automatisch abgeschaltet, um ein Ansaugen von Luft in


39

die Leber zu verhindern. Eine Höhenverstellung der Reservoire führt zu gleichsinnigen Änderungen der Ausflußdrucke der zuführenden Schläuche aus der Vena cava inferior und des Abflusses aus dem Membranoxygenator.

Abbildung 8: Neu entwickelte Leberperfusionsmaschine auf einer rollbaren Konsole mit integriertem Akku. Von links nach rechts: Perfusionskammer, Gasflußmeßgerät, Flügelzellenpumpe für den Perfusionskammerdruck, Notebook und Bedienpanel.


40

Abbildung 9: Die Detailaufnahme der Perfusionsmaschine zeigt von links nach rechts Wasser und Dialysatbehälter, Wärmetauscher, Dialysator und den Membranoxygenator

2.2.6.3 Perfusionskammer und Druckoszillation

Als ein wesentlicher Bestandteil wurde die von Neuhaus entwickelte flüssigkeitsgefüllte, geschlossene Perfusionskammer übernommen. Vor dem Einlegen der Leber, geschützt durch einen Kunststoffbeutel, wurde die Perfusionskammer über ein PVC-Schlauchsystem mit 4 Ventilen und einer Rollerpumpe aus zwei 10l-Kanistern zur Hälfte mit Wasser aufgefüllt. Je nach Ventilstellung kann Wasser in die Perfusionskammer hinein- oder abgepumpt werden. Das Gewicht der Kanister wurde kontinuierlich gemessen. Zu Beginn jeder Perfusion wurde die Kammer mit 15l 37°C warmem Wasser nahezu vollständig gefüllt. In diesen Kreislauf war ein Wärmeaustauscher (720 Helios, Dideco, Mirandola, Italien) integriert. Es war keine Sterilität des Wasserkreislaufs erforderlich, da kein direkter Kontakt zu Perfusat und Leber bestand.

Auf dem Kammerdeckel befand sich eine weitere Kammer (5x10x10 cm), die während der Perfusion zur Hälfte mit Luft gefüllt blieb. Über eine Flügelzellenpumpe (Luftpumpe, Firma Brey, Memmingen) wurde die Luft zur Erzeugung der Kammerdrucke angesaugt und wieder abgeführt. Die sinusförmigen Druckwellen hatten eine Amplitude von 15 mmHg und eine Schwingungsfrequenz von 6 min-1, sie oszillierten um einen Mittel


41

druck von 9 mmHg. Diese Druckoszillationen ahmen die Atemexkursionen und die damit im Abdomen verbundenen Druckschwankungen nach.

Damit das Volumen des Kammerinhalts auch bei Änderungen des Lebervolumens konstant blieb, wurde der Pegelstand in der Kammer mit Hilfe eines optischen Weggebers ständig kontrolliert und bei einem An- oder Absteigen eine entsprechende Wassermenge ab- beziehungsweise hinzu gepumpt. Dadurch konnten die Drücke in der Kammer und die Druckoszillationen konstant gehalten werden. Am Ende der Perfusion wurde das Wasser vor Öffnung der Kammer und Entnahme der Leber abgepumpt.

Wie nachgewiesen werden konnte, wird mit dieser Perfusionskammer ein verbessertes Perfusionsergebnis erzielt, insbesondere in der Läppchenperipherie. Die portalvenösen Lumina folgen den künstlichen intraabdominellen Druckschwankungen. Durch die schwimmende Aufhängung der Leber wird die Ausbildung von Druckstellen und hypoperfundierten Leberarealen, wie sie durch das Eigengewicht der Leber unweigerlich entstehen, vermieden.

2.2.6.4 Dialysekreislauf und Oxygenierung

In einem separaten, von den im Leberperfusionssystem vorherrschenden Drücken und Flüssen unabhängigen Kreislauf wurde ein Dialysator integriert. Dieser Faser Dialysator NT 1375 (Spiraflo, Sorin Biomedica, Saluggia, Italien) verfügt über eine effektive Oberfläche von 1,35 m2. Mit je einer Rollerpumpe wurden 300 ml Dialysat pro Minute über einen Wärmeaustauscher (720 Helios, Dideco, Mirandola, Italien), der es auf 37°C anwärmte, und Perfusat in Abhängigkeit vom Gesamtblut durch den Dialysator gepumpt.

Um möglichen Volumenverschiebungen zwischen Dialysat und Perfusat vorzubeugen, wurde das Dialyse-Reservoir auf einer Waage während der Perfusion gewogen. Durch Regulierung der Dialysatflüsse wurde einem Flüssigkeitsübertritt zwischen beiden Kreisläufen entgegen gewirkt, so daß die Gesamtbilanz zwischen Perfusat und Dialysatvolumen ausgeglichen blieb. Ein Austausch des Dialysats wurde nicht vorgenommen. Das dialysierte Perfusat wurde zum Membranoxygenator (Module 1500, Stöckert, München) gepumpt. Die Oxygenierung erfolgte dort mit einem Gemisch aus 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid (Carbogen, 400 ml/min). Das oxygenierte Perfusat wurde anschließend in ein weiteres Reservoir geleitet (Venomidicard 752, Dideco, Mirandola, Italien). Aus diesem 1400 ml fassenden Reservoir 2 wurde, entsprechend dem Zufluß, das Perfusat je zur Hälfte über jeweils eine Rollerpumpe in die Vena portae und die Leberarterie gepumpt. Folglich wurde die Leber über die Arterie mit oxygeniertem Perfusat und über die Vena portae mit Mischblut bestehend aus zwei Dritteln venösem und einem Drittel arteriellem Blut versorgt. Die O2-Sättigung der Vena portae betrug 70-80%. Die Perfusionsschläuche bestanden aus Silikon mit einem Innendurchmesser von 1,4 Zoll. Das komplette Perfusionsset wurde nach den für die Herzchirurgie bestehenden Anforderungen vorgefertigt und sterilisiert.


42

Abbildung 10: Schema des Perfusionssystems

2.2.6.5 Perfusat, Dialysat und Perfusion

Für alle Perfusionen wurde Perfusat auf der Basis von Vollblut benutzt. Das Vollblut stammte aus dem Penrose Schlachthof in Eberswalde, Brandenburg, und wurde frühmorgens am Versuchstag geholt. Nach Betäubung durch Elektroschock und Ankoppeln des Schweins an die Transportschiene wurde die Halsregion abgespritzt und sterilisiert. Die Halsgefäße wurden durchtrennt und das Blut über einen sterilen Trichter in einem sterilen 5l-Kanister aufgefangen. Zur Antikoagulation wurden pro Liter 500 IE Heparin zugegeben. Anschließend erfolgte der Transport ins Forschungshaus der Charité, Campus Virchow-Klinikum.

2,5l Blut wurden durch Zugabe von 1,5 l Jonosteril auf eine Hämoglobinkonzentration von 10-11 g/dl eingestellt. Das Gesamtvolumen des Perfusats betrug 4l.

Die Ausgangswerte der untersuchten Parameter sind als Mittelwerte ± Standardfehler angegeben und wurden aus dem für die Perfusion der Gruppen 3 und 6 verwendeten Vollblut ermittelt.


43

Tabelle 5: Ausgangswerte im Perfusat

Komponente

Ausgangswerte

Natrium

141

± 2

mmol/l

Kalium

6,3

± 0,4

mmol/l

alpha-GST

15

± 12

µg/l

GOT

26

± 4

U/l

GPT

18

± 2

U/l

LDH

681

± 125

U/l

gamma-GT

24

± 4

U/l

AP

103

± 12

U/l

Gesamtbilirubin

0,23

± 0,04

mg/dl

Harnstoff

26

± 3

mg/dl

Kreatinin

1,4

± 0,1

mg/dl

Protein

5,1

± 0,4

g/dl

Albumin

2,9

± 0,2

g/dl

Hyaluronsäure

105

± 16

µg/l

Ammoniak

211

± 32

µmol/l

Osmolalität

292

± 4

mosm/kg

Leukozyten

13

± 1

/nl

Thrombozyten

246

± 28

/nl

Hb

9,6

± 0,7

g/dl

Hkt

31

± 2%

 

Zur Dialyse wurde ein Dialysat auf Basis eines Natriumbikarbonatpuffers verwendet (Schiwa Combi-Pac) bestehend aus 9000 ml Basislösung zur Bikarbonat-Hämofiltration (SH 44-HEP) und 320 ml Natriumhydrogenkarbonat-Lösung 8,4%.

Tabelle 6: Ausgangswerte des Dialysats

Komponente

SH 44-HEP

8,4%-NaHCO3

Gesamtdialysat

Na+

109,50 mmol/l

1000 mmol/l

140,1 mmol/l

K+

2,08 mmol/l

 

2,0 mmol/l

Ca2+

1,81 mmol/l

 

1,7 mmol/l

Mg2+

0,52 mmol/l

 

0,5 mmol/l

Cl-

116,24 mmol/l

 

112,2 mmol/l

Laktat

3,00 mmol/l

 

2,9 mmol/l

Glucose

5,80 mmol/l

 

5,6 mmol/l


44

Vor Beginn der Leberperfusion wurde ein Priming des Perfusionssystems mit 3l Jonosteril, 50 ml Humanalbumin (Humanalbumin N 20%, Bayer, Leverkusen) und 25.00 IE Heparin (Liquemin®, Roche, Grenzach-Wyhlen) durchgeführt. Die 15 bis 30 min dauernde Spülung sollte eventuelle Fertigungsrückstände aus dem Schlauchsystem entfernen und ein Absetzen von Blutbestandteilen an den Schlauchinnenflächen während der Perfusion verhindern. Nach Ablassen der Priming-Lösung wurde das Reservoir 1 mit Perfusat aufgefüllt, das Perfusat oxygeniert und der Dialysekreislauf gestartet. Durch 20 minütigen Betrieb ohne Leberanschluß wurde eine Äquilibrierung zwischen Perfusat und Dialysat ermöglicht. Parallel hierzu wurde die Perfusionskammer mit 37°C warmem Wasser gefüllt, so daß die Perfusionsapparatur für den Leberanschluß bereit stand.

Die Perfusion der Leber wurde nach vier Stunden beendet. In zwei Fällen mußte aus logistischen Gründen die Perfusionsdauer auf 5 Stunden verlängert werden. Nach Pumpenhalt wurde das Wasser aus der Perfusionskammer abgelassen, der Deckel geöffnet und die Leber unter sterilen Bedingungen aus der Perfusionskammer herausgenommen. Nach Entfernen der in den Gefäßen plazierten Spiralen und Schläuche wurde die Leber in den Operationssaal transportiert und umgehend in das vorbereitete Empfängertier transplantiert.

2.2.6.6 Bestimmung in Perfusat und Dialysat

Neben alpha-GST, GOT, GPT, LDH, gamma-GT, Alkalische Phosphatase, Gesamtbilirubin, Hyaluronsäure, Proteine, Albumin, TPZ, PTT, Fibrinogen, Ammoniak, Harnstoff und Kreatinin wurden Natrium, Kalium, Hämoglobin und die Leukozytenzahl im Perfusat bestimmt. Diese Parameter wurden nach Anschluß der Dialyse, aber vor Leberperfusion sowie am Ende der Leberperfusion ebenfalls im Dialysat zur Überprüfung der Dialysierbarkeit dieser Parameter bestimmt. Zu den anderen Abnahmezeitpunkten wurden im Dialysat ausschließlich Natrium, Kalium, Kreatinin, Harnstoff und Ammoniak ermittelt.


45

2.2.7 Licht- und Elektronenmikroskopische Untersuchungen

2.2.7.1 Entnahme der Biopsien/Biopsieprotokoll

Die Biopsien wurden mit einem Skalpell durch Keilexzision gewonnen. Die Exzision erfolgte immer an einer peripheren Spitze eines der vier Leberlappen mit makroskopisch für die gesamte Leber charakteristischem Aussehen. Die Biopsiestelle wurde anschließend sorgfältig elektrokoaguliert. Da die morphologischen Untersuchungen späterer Zeitpunkte mit kumulierten Einflüssen und reaktiven Spätfolgen nicht Gegenstand dieser Untersuchung waren, wurden nur die Biopsien 0-3 entsprechend dem beschriebenen Protokoll bearbeitet. Biopsie 4 wurde im Rahmen der Obduktion lichtmikroskopisch untersucht.

Tabelle 7: Biopsien der Gruppen 1-4

Biopsie-Nummer

Abnahmezeitpunkte

0

Sofort nach Öffnung des Abdomens des Spenders

1

Nach Vorbereitung des Abdomens des Spenders

2

5min nach Reperfusion im Empfänger

3

6 min nach Reperfusion

4

Nach Exitus

Tabelle 8: Biopsien der Gruppe 5 und 6

Biopsie-Nummer

Abnahmezeitpunkte

0

Sofort nach Öffnung des Abdomens des Spenders

1

Nach Vorbereitung des Abdomens des Spenders

2a

Nach einer Stunde warmer Ischämie im Situs des Spenders

2

5min nach Reperfusion im Empfänger

3

6 min nach Reperfusion

4

Nach Exitus

Exemplarisch für alle sechs Gruppen ist das Biopsie-Schema anhand eines Zeitstrahls der Gruppe 6 in der folgenden Abbildung 11 dargestellt.


46

Abbildung 11: Darstellung des Zeitstrahls am Beispiel der Gruppe 6. Von allen ausgewerteten Biopsien wird nur die Biopsie 3 in alle 6 Gruppen und die Biopsie 2 zusätzlich in den Gruppen 3 und 6 dargestellt.

Die Biopsie 0 wurde sofort nach Öffnung des Abdomens entnommen. Nach der Leberpräparation und dem Vorbereiten des Abdomens für die Explantation wurde die Biopsie 1 entnommen. Nach Herzstillstand wurde die Leber nach einer Stunde warmer Ischämie aus dem Abdomen des Spenders entnommen und auf dem Backtable für die Perfusion vorbereitet. Der Zeitpunkt der Biopsie 2a war genau nach einer Stunde warmer Ischämie. Nach vier Stunden normothermer extrakorporaler Perfusion in der Maschine wurde die Perfusion beendet und die Leber in das vorbereitete, hepatektomierte Abdomen des Empfängers orthotop plaziert. Nach Fertigstellung der Anastomosen der suprahepatischen Vena cava inferior und der Vena portae wurde die Biopsie 2 kurz vor Reperfusion der Leber entnommen. Nach Fertigstellung der übrigen Anastomosen und erfolgter Reperfusion wurde kurz vor Bauchverschluß die Biopsie 3 entnommen. Die Schweine verbrachten die postoperative Zeit in Einzelställen. Für die Entnahme der Biopsie 4 wurde das Abdomen so schnell wie möglich nach Exitus des Tieres eröffnet und die Leber biopsiert.

2.2.7.2 Fixierung der Biopsien

Die Leberbiopsien wurden mit einer Rasierklinge in gleich große Stücke mit gerader Schnittfläche geteilt. Jeweils ein Stück wurde in Paraformaldehyd (Formalin, Herbeta, Berlin) für die Lichtmikroskopie fixiert und bis zur weiteren Verarbeitung bei 4°C aufbewahrt. Ein weiteres Stück wurde in vier kleinere Stücke mit einer Kantenlänge von ungefähr 1,5 mm geteilt und in 5%-igem Glutaraldehyd (Bioproducts, Boehringer, Heidelberg) für die Elektronenmikroskopie fixiert und bei 4°C aufbewahrt. Die Zeit zwischen Entnahme und Fixierung in Glutaraldehyd betrug weniger als eine Minute. Glutaraldehyd ist in einem relativ breiten Konzentrationsbereich für die Ultradünnschnittechnik als sicheres Fixativ gebräuchlich.


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2.2.7.3 Präparationsmethoden für die Lichtmikroskopie

2.2.7.3 Fixierung, Einbettung und Färbung

Die in Paraformaldehyd fixierten Gewebeproben wurden für die Lichtmikroskopie verwendet. Die Einbettung erfolgte in Paraffin. Zuerst wurde die Gewebeprobe mit Hilfe einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert, anschließend der Alkohol durch Behandlung mit Xylol (E.Merck, Darmstadt) und später mit einer Mischung aus weichem Paraffin und Xylol (Verhältnis 1:1) entfernt. Die Gewebeprobe wurde dann bei 56-58°C mit Paraplast (Sherwood - Medical, St.Louis, USA) durchtränkt und in Ausgußformen zum Erstarren gebracht. Mit einem Schlittenmikrotom (Leica SM2000R) wurden von diesen Blöcken Präparate mit einer Schnittdicke von 1-1,5 µm angefertigt.

Drei Färbungen wurden routinemäßig verwendet:

2.2.7.4 Dokumentation der Lichtmikroskopie

Für die Bilddokumentation der lichtmikroskopischen Befunde wurde neben den Semidünnschnittpräparaten die Masson-Goldner-Färbung ausgewählt, da diese die bindegewebige Läppchenarchitektur gut darstellt. Im Ergebnisteil wurde oben auf der Seite der Schnitt gefärbt nach Masson-Goldner und direkt darunter der Semidünnschnitt angeordnet. Auf der darauffolgenden Seite findet sich die elektronenmikroskopische Abbildung. Die Präparate wurden mit Hilfe eines Mikroskops (Leica DMRBE) photographiert. Verwendet wurde ein Kunstlicht Diafilm (Ektachrom 160T, Kodak). Die Vergrößerung auf dem Diapositiv berechnet sich nach der vom Hersteller für das oben genannte Mikroskop angegebener Formel: Objektivvergrößerung x Tubusfaktor x Einstellung des Vario-Okulars x Kamerafaktor.

Die Photoabzüge wurden formatfüllend angefertigt.

Zur Beschreibung der morphologischen Befunde wurde im Ergebnisteil wegen der leichteren morphologischen Zugänglichkeit auf das Kiernan-Läppchen-Schema Bezug genommen, während in der Diskussion wegen der besseren Bezugnahme auf pathophysiologische Vorgänge auf das Rappaport-Schema zurückgegriffen wurde.

2.2.7.5 Präparationsmethoden für die Elektronenmikroskopie

2.2.7.5 Fixierung, Kontrastierung und Nachfixierung

Die Gewebeproben für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden kurz nach Biopsieentnahme in 5%-igem Glutharaldehyd in 1/15 M Phosphatpuffer (E.Merck, Darmstadt) bei einem pH von 7,3 mindestens einen Tag bei 4°C fixiert und aufbewahrt. Für die Kontrastierung wurde eine Osmiumtetroxyd-Lösung zugefügt. Diese bedingt


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eine Anreicherung von Schwermetallen im Gewebe, was eine Zunahme der Elektronenabsorption zur Folge hat und für die Bilderzeugung im Elektronenmikroskop unerläßlich ist. Zwei Stunden wurden die Gewebestücke in 2%-igem Osmiumtetroxyd, 4%-iges Osmiumtetroxyd (Paesel und Lorei, Hanau) in 1/15 M Phosphatpuffer verdünnt, bei Raumtemperatur belassen und anschließend mit Phosphatpuffer gespült. Die vernetzende Wirkung von Glutaraldehyd auf Proteine führte in Kombination mit einer stabilisierenden Nachfixierung mit Osmiumtetroxyd zu einem akzeptablen Erhaltungszustand der Zellen .

2.2.7.6 Einbettung

Die Gewebestücke wurden in einer aufsteigenden Alkoholreihe (E.Merck, Darmstadt), jeweils zweimal 10 min in 70%-igem, 90%-igem und absolutem Alkohol, entwässert. Anschließend folgte die Entfernung des Alkohols durch das Intermedium Azeton (E.Merck, Darmstadt). Zuerst wurde das Gewebestück zweimal für 10 min in Azeton und im zweiten Schritt für 30 min in ein Azeton-Araldit-Gemisch (im Verhältnis 1:1) gelegt. Die Infiltration erfolgte mittels Araldit (Serva, Heidelberg) für mindestens zwei Stunden, bestehend aus 50% Harz, 47% Härter, 1% Weichmacher und 2% Beschleuniger. Danach wurden die Gewebestücke in BEEM-Kapseln (W.Plano, Marburg), gefüllt mit Araldit, überführt und bei 60°C mindestens 24 Stunden polymerisiert. Nach der Polymerisation wurden die BEEM-Kapseln von den Blöcken getrennt. Diese Vorgehensweise wird in der Elektronenmikroskopie üblicherweise angewendet, da sich ein hoher Wassergehalt der Gewebeproben nicht mit dem nötigen Hochvakuum des Elektronenmikroskops verträgt.

2.2.7.7 Herstellung der Semidünnschnitte

Für das Anfertigen der Semidünnschnitte wurden Glasmesser gebrochen und an der Messerkante mit Auffangtrögen (Alu-Band) versehen. Dann wurden die einzelnen Blöcke vorgetrimmt und mittels der Glasmesser mit einem Mikrotom (Leica RM 2065) von diesen Blöcken 0,5 µm dicke Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden auf Objektträger (Shandon GmbH, Frankfurt) aufgetragen, für 3-5 Sekunden auf einer Heizplatte bei 120°C gestreckt, anschließend bei 80°C auf einer Heizplatte getrocknet (ungefähr 15 Minuten) und bei 120°C auf einer Heizplatte 15 Minuten angeklebt. Danach wurden sie bei 80°C für 90 Sekunden mit Toluidinblau (Chroma 1%-ig in Natriumkarbonat 2,5-ig, Chroma-Gesellschaft, Köngen) angefärbt, abgewaschen und trocken mit einem Deckglas versehen.

2.2.7.8 Herstellung der Ultradünnschnitte und Nachkontrastierung

Nach Anspitzen der ausgewählten Blöcke wurden die Ultradünnschnitte mit einer Schnittdicke von 60-65 nm am Mikrotom (Leica Ultracut S) angefertigt. Dazu wurde ein Diamantmesser (Dilaware Diamond Knives, Wilmington, USA) verwendet. Auf Kupfer


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schlitzobjektträgern, 3 mm Durchmesser, 1x2 mm Schlitzgröße (BAL-TEC, Walluf) mit Piloform (W.Plano, Marburg) 0,5%-ig in Chloroform befilmt, wurden die Schnitte nach dem Strecken mit Xylol aufgebracht. Die Nachkontrastierung der Ultradünnschnitte diente der Verstärkung des Kontrastes und erfolgte in zwei Schritten, zuerst mit 5%-igem Uranylacetat (E.Merck, Darmstadt) in 50%-ig Ethanol für 15 min und dann mit Bleicitrat (E.Merck, Darmstadt) für 10 min nach Reynolds . Beide Stoffe verhalten sich synergistisch.

2.2.7.9 Dokumentation der Transmissionselektronenmikroskopie

Als Ergebnis der elektronenmikroskopischen Untersuchung entsteht ein Schwarzweißbild, auf dem das Präparat infolge der unterschiedlichen Durchdringung des Elektronenstrahls durch die verschieden dichten Strukturen in verschiedenen Grautönen bis Schwarztönen dargestellt wird. Je weniger die Elektronen in einer Schicht absorbiert werden, desto schwärzer wird diese abgebildet. Die Untersuchung und Dokumentation der Präparate wurde am Transmissionselektronenmikroskop (ZEISS EM 10) vorgenommen. Nach der allgemeinen Begutachtung des Präparates wurden Serienaufnahmen in für das Präparat charakteristischen Regionen angefertigt. Dabei wurde zwischen der perizentralen und der periportalen Region des Leberläppchens unterschieden.

2.2.7.10 Selektion der Biopsien für die Transmissionselektronenmikroskopie

Von allen Kunststoffblöcken für die TEM wurden Semidünnschnitte angefertigt, die Präparate begutachtet und photographiert (Leica DMRBE). Für die Dokumentation wurde ein Agfapan-Film (APX 25, AGFA) verwendet. Die Photoabzüge wurden formatfüllend angefertigt. Die Synopsis der lichtoptischen Befunde an den Paraffin- und Semidünnschnitten war Basis für die Auswahl ultrastrukturell zu bearbeitender Gewebeareale. Die Photoabzüge ermöglichten ein exaktes Anspitzen der Blöcke in Abstimmung mit der Läppchenstruktur der Leber für das Anfertigen der Ultradünnschnitte und vereinfachten die Orientierung am Präparat im Elektronenmikroskop.

Für die lichtmikroskopischen Abbildungen errechnete sich eine Vergrößerung von 100-fach für die elektronenmikroskopischen Abbildungen von 4500-fach.


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Thu Aug 15 18:39:25 2002