Schön, Michael R. : Transplantation von Lebern Nicht-Herzschlagender Spender im Schweineleber-Transplantationsmodell

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Kapitel 4. Diskussion

Der Mangel an geeigneten Spenderorganen hat im vergangenen Jahrzehnt zu einer intensiven Suche geführt, die Anzahl an transplantablen Organen zu erhöhen. Die vorliegende Arbeit soll eine Antwort darauf geben, ob die normotherme extrakorporale Leberperfusion eine geeignete Methode ist, Lebern zu konservieren und die Nutzung von NHBD zu ermöglichen. Im ersten Abschnitt wird die Optimierung der NELP durch die Integration einer simultanen Perfusatdialyse behandelt. Im zweiten Abschnitt wird untersucht ob die kalte Konservierung in UW im Vergleich zur NELP geeignet ist, Lebern von NHBD zu konservieren.

4.1 Zur Wahl des Schweins als Versuchstier

Um eine Übertragbarkeit der gewonnenen Ergebnisse auf einen möglichen klinischen Einsatz zu erlauben, kommen der Wahl des Versuchsmodells sowie des Versuchstiers besondere Bedeutung zu.

Wichtige Erkenntnisse zum Ablauf der Schadenskaskade unter ischämischen Bedingungen stammen aus der Kultur isolierter Hepatozyten und Sinusendothelzellen. Der Ausschluß von Einflußfaktoren ist es, der diese Modelle für mechanistische Untersuchungen besonders prädestiniert. Aber gleichzeitig leidet hierunter auch deren Übertragbarkeit auf eine an Einflüssen reiche Situation im gesamten Organismus bzw. bei der klinischen Anwendung. Somit scheiden Modelle auf Basis isolierter Zellen für die anfangs erwähnten Zielsetzungen aus.

Ein besonders häufig genutztes Versuchstier in der Konservierungsforschung sowohl im Leberperfusionsmodell, als auch im Transplantationsversuch, ist die Rattenleber. Neben den zahlreichen Vorteilen, wie z.B. die unproblematische Tierhaltung, die verhältnismäßig geringen Kosten, die minimalen personellen Anforderungen, die vergleichsweise einfache Operationstechnik und Narkoseführung, gibt es bezüglich der Übertragbarkeit auf die humane Situation wichtige Unterschiede. Hierzu zählt zunächst die Größendiskrepanz. Des weiteren haben Rattenlebern keine Gallenblase mit den daraus folgenden Unterschieden in der Physiologie der Gallesekretion. Bemerkenswert ist ferner, daß Rattenlebern erfolgreich transplantiert werden können, auch wenn auf die arterielle Anastomose verzichtet wird. Dies ist bisher für kein Säugetiermodell beschrieben. Nicht zuletzt scheinen Rattenlebern im Unterschied zu humanen Lebern mit 48h eine besonders lange Toleranz gegenüber kalter Ischämie aufzuweisen.

Zahlreiche Konservierungsuntersuchungen wurden an Hundelebern durchgeführt . Die präklinische Entwicklung der University of Wisconsin-Lösung basiert zum großen Teil auf Versuchen im Hundelebertransplantationsmodell. Aufgrund restriktiver tierschutzrechtlicher Vorschriften und wegen des öffentlichen Interesses an Versuchen mit Haustieren stehen nur wenige Hunde für die Forschung zur Verfügung.


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Ausschlaggebend für die Wahl des Schweins als Versuchstier war neben der physiologischen und anatomischen Ähnlichkeit zum Menschen auch die gute Verfügbarkeit. Die Immunsuppression bei der Schweinelebertransplantation ist von geringerer Bedeutung als in anderen Säugetiermodellen, da Abstoßungsreaktionen oftmals auch dann nicht auftreten, wenn die Tiere gar nicht immunsupprimiert wurden. Schweine sind als Versuchstiere in zahlreichen Leberstudien als Modell genutzt worden. Das prä- und postoperative Handling von Schweinen ist mehrfach beschrieben. Die Stabilisierung des Kreislaufs ist schwieriger als beim Hund, aber ausreichend standardisierbar.

4.2 Verbesserung der NELP

Die Größe von Schweinelebern und die daraus resultierenden Flußvolumina machen ein Perfusionssystem erforderlich, indem das Perfusat rezirkuliert. Eine 700g schwere Leber wird pro Minute mit ca. 70 ml Flüssigkeit durchspült. Daraus berechnet sich pro Stunde ein Umsatz von 42 Litern Perfusat.

Alle von der Leber abgegebenen Substanzen - sei es durch Zelluntergang oder als Metabolite im Rahmen von Stoffwechselvorgängen - akkumulieren im Perfusionsmedium. Besonders anschaulich ist dies beim Kalium: die Reperfusion einer ischämisch geschädigten Leber führt in Abhängigkeit von der Ischämiedauer und der Temperatur zu einem Austritt von Kalium aus dem intrazellulären Raum ins Perfusat. In einem rezirkulierenden System verbleibt das Kalium im Perfusat und kann Konzentrationen weit oberhalb des physiologischen Bereichs erreichen. Die Kaliumkonzentration ist für die Volumenregulation von Hepatozyten von Bedeutung. Das Zellvolumen wiederum steuert die Proteinsynthese. Um weder eine Hepatozytenschwellung noch eine Schrumpfung zu verursachen und somit möglichen Reparationsvorgängen günstige Voraussetzungen zu schaffen, sind physiologische Kaliumkonzentrationen anstrebenswert Für Rattenleberperfusionen aus einem Reservoir ist dieses Ziel leicht zu erreichen. Die gewünschte Kaliumkonzentration wird dem Perfusat, meist Krebs-Henseleit, vorgegeben.

Vor diesem Hintergrund wurde ein Dialysekreislauf in den rezirkulierenden Schweineleberperfusionskreislauf integriert. In der Literatur sind bisher keine Leberperfusionskreisläufe mit integrierter Dialyse beschrieben. Folglich fehlen bisher auch Hinweise, ob die Dialyse des Perfusats tatsächlich günstige Auswirkungen auf die Leberfunktion hat.

Abbildung 1 zeigt den für diese Untersuchungen gewählten Perfusionskreislauf. Der Dialysator wurde im Bypass angeschlossen. Ein Fünftel des durch die Leber perfundierten Flußvolumens wurden entnommen und durch den Dialysator geleitet. Das Dialysat wurde rezirkulierend aus einem 10 Liter fassenden Behälter gepumpt. Es wurde ein definiertes Dialysatvolumen gewählt, um die Bilanzierung und Volumenverschiebungen sowie die Konzentrationsberechnungen leichter durchführen zu können. Folglich führt diese Form der Dialyse zu einer Vergrößerung des Verteilungsvolumens von


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4l auf insgesamt 14l (4l Perfusat plus 10l Dialysat) für alle frei dialysierbaren Substanzen. Somit werden aus dem Perfusionskreislauf keine Komponenten entzogen sondern lediglich verdünnt.

Wie die Kaliumkonzentrationen der Gruppe 1 zeigt (Abbildung 13), kommt es 30 min nach Reperfusion zu einer Zunahme der Kaliumkonzentration von 5,0±0,1 auf 6,8±0,6 mmol/l. Nach 3 Stunden Perfusion ist eine Kaliumkonzentration von 7,9mmol/l erreicht. Im Unterschied hierzu fällt die Kaliumkonzentration in Gruppe 2 von 5,0 auf 4,1mmol/l ab. Parallel hierzu steigt sie im Dialysat an. Wie erwartet konnte der angeschlossene Dialysekreislauf die Kaliumkonzentration der Gruppe 2 im physiologischen Konzentrationsbereich halten. Die Unterschiede der Kaliumkonzentrationen beider Gruppen waren zu allen Zeitpunkten signifikant. Nach Berechnung der Kaliumfreisetzung zeigte sich, daß die Lebern in Gruppe 2 nach 3 Stunden signifikant weniger Kalium verloren hatten ( Abbildung 14 ). Dies war kein Reperfusionsphänomen, sondern offensichtlich Folge einer kontinuierlichen Kaliumfreisetzung. Die Freisetzung von Kalium während der Perfusion weist auf Zellmembrandefekte hin, welche vermutlich durch freie Sauerstoffradikale verursacht werden. Die geringere Kaliumfreisetzung kann als ein erstes Indiz für eine bessere Perfusionsqualität in Gruppe 2 gewertet werden.

Während die Konzentration für Natrium weder in Gruppe 1 noch in Gruppe 2 nennenswerten Variationen unterworfen war ( Abbildung 12 ), gab es für den pH Wert signifikante Unterschiede ( Abbildung 15 ). Unter physiologischen Bedingungen spielt die Leber, neben den Nieren, eine zentrale Rolle in der Regulation des pH-Werts. Durch die Synthese von Harnstoff aus Bikarbonat kommt es im Verlauf der extrakorporalen Leberperfusion im geschlossenen Kreislauf zu einem Absinken des pH-Werts. Zwar läßt sich der pH durch Bikarbonatgabe äquilibrieren, dies hat aber zur Folge, daß die Natrium- oder Kaliumkonzentration durch die Zugabe von Natrium- bzw. Kaliumbikarbonat nicht konstant gehalten werden können. (H)+, (OH)- und Harnstoff passieren leicht die Dialysatormembran. Somit führt die Dialyse zu einem Ausgleich des pH Wertes zwischen Perfusat und Dialysat. Zu allen Meßzeitpunkten befand sich der pH in Gruppe 2 im physiologischen Bereich um 7,4, während am Ende der Perfusion in Gruppe 1 ein Wert von 6,86 erreicht war. Dies erklärt sich durch die Pufferkapazität des Dialysats, das Bikarbonat als Puffer beinhaltet. In der Literatur gibt es Studien die zeigen, daß ein physiologischer pH für die meisten Stoffwechselvorgänge wichtig ist. Dies gilt auch für die extrakorporale Leberperfusion.

Um zu beurteilen, ob die Dialyse des Perfusats Auswirkungen auf die Qualität der Leberperfusion hat, wurde die Aktivität von GOT, GPT und LDH ermittelt, der Sauerstoffverbrauch bestimmt sowie die Gallebildung und Harnstoffproduktion gemessen.

Die Enzyme können wegen ihres Molekulargewichts die Dialysatormembran nicht passieren. Deshalb wurde bei allen Bestimmungen zu keinem Zeitpunkt im Dialysat Transaminasenaktivität nachgewiesen. Somit kann gefolgert werden, daß die höheren Enzymaktivitäten der Gruppe 1 das Resultat einer vermehrten Freisetzung sind. Bei allen Bestimmungen wurden die höheren Aktivitäten in Gruppe 1 gemessen. Zum Teil waren diese Unterschiede zwischen den beiden Gruppen signifikant (Abbildung 16-18). Hier


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aus läßt sich folgern, daß die Lebern in Gruppe 2 während des Perfusionszeitraums einen geringeren hepatozellulären Schaden aufwiesen als in Gruppe 1.

Ein Unterschied im Sauerstoffverbrauch beider Gruppen wird erst nach der 90igsten Minute deutlich und erreicht nach 180 Minuten gerade das Signifikanzniveau (p=0,044). Der höhere Sauerstoffverbrauch der Gruppe 2 kann als ein weiteres Indiz dafür gewertet werden, daß die Leberperfusion mit dialysierten Perfusat zu einer besseren Perfusion führt. In zahlreichen Leberperfusionsstudien wird der Sauerstoffverbrauch als Viabilitätskriterium gewertet.

Der zuverlässigste Parameter zur Beurteilung der Leberfunktion ist die Galleproduktion. Sie erfordert eine intakte Leberläppchen-Architektur. Zahlreiche biochemische Abläufe müssen ineinander greifen, bis Galle produziert werden kann. Die Sekretion von Galle beruht im wesentlichen auf aktiven Transportmechanismen.

Die Menge an produzierter Galle in Gruppe 1 betrug 1,1 ml pro 100g Lebergewicht. In Gruppe 2 wurden hingegen 1,9 ml von der gleichen Anzahl Hepatozyten sekretiert ( Abbildung 20 ). Der Unterschied war mit p=0,016 signifikant. Hieraus kann geschlossen werden, daß die Dialyse des Perfusats zu einer Steigerung der Gallesekretion führt, auch die Produktion von Harnstoff war in Gruppe 2 höher, wenngleich nicht signifikant ( Abbildung 22 ).

Werden alle Schädigungsparameter und Viabilitätskriterien zusammengefaßt, kann gefolgert werden, daß die Dialyse des rezirkulierenden Perfusats in Gruppe 2 zu einem geringeren hepatozellulären Schaden und einer besseren Leberfunktion führt. Somit scheint es erwiesen, daß die Integration der Dialyse in den Leberperfusionskreislauf einen erheblichen Beitrag für eine gute Leberfunktion leistet. Zu berücksichtigen bleibt, daß es sich im obigen Modell um Lebern handelte, die einer warmen Ischämie ausgesetzt waren. Sowohl die Freisetzung an Kalium, aber auch an sauren Valenzen ist unter diesen Bedingungen besonders groß. Wahrscheinlich wäre der positive Einfluß der Perfusatdialyse mit frisch entnommenen Lebern weniger stark ausgefallen oder hätte erst später eingesetzt.

Die Ursachen für die bessere Leberfunktion lassen sich anhand des obigen Modells nicht zweifelsfrei klären. Vergleichsweise unstrittig dürfte die Bedeutung einer physiologischen Kaliumkonzentration sein. Ähnliches muß man für den pH annehmen.

Weitaus spekulativer ist die Annahme, daß die Leber unter physiologischen Bedingungen z.B. über Glukuronidierung in der Lage ist Toxine, in hydrophile Substanzen umzuwandeln,,. Es ist denkbar, daß diese Toxine, die auch bei der humanen Nierendialyse erfolgreich über Jahre hinweg eliminiert werden können, im Leberperfusionskreislauf nicht mehr akkumulieren, bzw. in ihrer Konzentration reduziert werden.

Für die obigen Untersuchungen wurde die Leber in ein temperiertes Perfusatbad gelegt ( Abbildung 1 ). Diese Lagerung stellt einen Kompromiß zwischen einem einfachen Perfusionsaufbau und der Perfusionskammer, wie sie von Neuhaus entwickelt wurde, dar. Legt man die Leber auf eine harte Unterlage, sei es auch ein Netz, Tuch oder ähnliches, führt das Eigengewicht der Schweineleber dazu, daß die unteren 2-3cm des Lebergewebes komprimiert werden. Als Folge bleiben diese Areale hypoperfundiert.


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Neuhaus konnte zeigen, daß durch die Lagerung in einer geschlossenen Perfusionskammer auf die von außen oszillierende, sinusförmige Drucke gegeben werden, verhindert wird, daß es zu einer Ausbildung dieser Areale kommt. Lebern, die in einer solchen Kammer perfundiert wurden, produzieren bis zur 24 Stunden Galle als Zeichen einer guten Funktion . Das Prinzip der Perfusatdialyse wurde in einer experimentellen Perfusionsmaschine mit dem Prinzip der Kammerperfusion vereint. Wir konnten in einer Studie mit Affenlebern zeigen, daß es über einen Perfusionszeitraum von 4 Stunden zu keinem nennenswerten Anstieg der Transaminasen kam und die Lebern bis zum Schluß große Mengen Galle produzierten.

Diese experimentelle Perfusionsmaschine war jedoch nicht geeignet, Schweineleberperfusionen unter sterilen Kautelen durchzuführen. Auch das Handling in Bezug auf Volumenverschiebungen in Dialysat oder Perfusat sowie das Monitoring der Drucke und Flüsse bedurfte einer Neukonstruktion wie sie Kapitel 2.2.6 beschrieben wird. Die Abbildung 8 und Abbildung 9 zeigen die neu entwickelte Perfusionsmaschine mit integriertem Dialysekreislauf und der Neuhaus-Kammer. Das Flußdiagramm ist in Abbildung 10 skizziert. Diese Perfusionsmaschine kam im vorliegenden Projekt erstmals zum Einsatz.

4.3 Lebertransplantation nach NELP

Alle experimentellen Aussagen über die Qualität einer extrakorporalen Leberperfusion beruhen bisher auf indirekten Daten. Dies sind, wie eingangs geschildert, die Freisetzung von Enzymen, die Produktion von Harnstoff, Verbrauch von Sauerstoff und die Sekretion von Galle. Zusammengefaßt ergeben diese Daten einen guten Hinweis auf die Funktionsfähigkeit der Leber, lassen aber trotzdem einen gewissen Interpretationsspielraum zu. Der absolute Beweis, daß die extrakorporale Leberperfusion besonders physiologisch durchgeführt wurde, kann aber nur die anschließend erfolgreiche Transplantation einer zuvor extrakorporal perfundierten Leber sein. Nur dieser Versuchsaufbau läßt auch weitergehende Überlegungen zur Anwendung der NELP zu. Insbesondere muß man für die mögliche Anwendung der NELP zur Nutzung von Lebern, die von NHBD stammen fordern, daß es experimentell möglich ist, diese Lebern zu transplantieren.

In der gesamten Literatur findet sich nur eine Publikation, in welcher der Versuch unternommen wurde nach NELP zu transplantieren. Von 4 transplantierten Schweinen haben 2 Tiere einige Tage überlebt. Leider fehlen genauere Angaben, die Schlußfolgerungen zuließen. Trotz der zahlreichen Rattenleberperfusionen und auch Rattenlebertransplantationen gibt es keine Daten über die Transplantation nach vorheriger NELP. Die Ziele beim Entwurf des vorliegenden Studienprotokolls waren es, unzweideutige Schlüsse in Bezug auf die Viabilität der Leber nach NELP zuzulassen und zum anderen eine Situation zu simulieren, die eventuellen Einsätzen in der Klinik entsprechen könnte.


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Die Lebern der ersten drei Gruppen des Versuchsprotokolls wurden einem herzschlagenden Spendertier entnommen. Eine definierte warm ischämische Phase im Spender fehlte somit. Der Versuchsgruppenaufbau ist in Abbildung 6 schematisch wiedergegeben. In Gruppe 1 wurde sofort nach Entnahme der Spenderleber das vorbereitete Empfängertier transplantiert, in Gruppe 2 erst nach 4 Stunden Organkonservierung in UW. Für die klinische Organprotektion ist die Kaltkonservierung in UW- oder HTK-Lösung der Standard, gegen den neue Verfahren gemessen werden müssen. Für das Studienprotokoll wurden deshalb zwei der Vergleichsgruppen bestimmt (Gruppen 2 und 5) in denen die Lebern 4 Stunden in UW-Lösung kalt konserviert wurden. In Gruppe 3 wurden die Lebern über 4 Stunden normotherm extrakorporal perfundiert und anschließend transplantiert. Die Gruppen 4 bis 6 entsprachen nach 60 Minuten warmer Ischämie im Spendertier dem NHBD Konzept. In Gruppe 4 schloß sich an die 60 Minuten warme Ischämie die sofortige Transplantation an. Somit waren diese Lebern einer kontinuierlichen warmen Ischämie von 103 Minuten ausgesetzt. In Gruppe 5 und Gruppe 6 folgten den 60 Minuten warmer Ischämie 4 Stunden kalte Ischämie in UW bzw. 4 Stunden NELP.

Der Zeitraum von vier Stunden wurde gewählt, weil dies in etwa der kürzeste Zeitrahmen sein dürfte, der es erlaubt, die Spenderhepatektomie durchzuführen, den NELP-Kreislauf zu füllen sowie den Empfänger vorzubereiten und zu hepatektomieren. Dieses Vorgehen beruht auf einigen Prämissen, auf die am Ende der Diskussion nochmals im Einzelnen eingegangen wird.

4.4 Überlebensdaten nach Lebertransplantation

In Gruppe 1 überlebten alle Schweine die Transplantation. Ein Leberausfall trat wie zu erwarten war in keinem Fall auf. Eine operationstechnisch bedingte durchschnittliche warme Ischämie von 3 min wird von Lebern gut toleriert. Diese Gruppe diente als Referenz ohne kalte Ischämie oder NELP, dem Vergleich der biochemischen Verlaufsmeßgrößen sowie zur Auswertung der licht- und elektronenmikroskopischen Beurteilung.

4 Stunden kalte Ischämie in UW gelten als kurzes Konservierungsintervall, folglich überlebten auch in der Gruppe 2 alle Schweine die Transplantation ohne Leberausfall. Ebenfalls nach NELP kam es zu keinen Leberausfällen. Somit kann im Vergleich der Gruppen 2 und 3 erstmals gefolgert werden, daß für das Überleben der Empfänger die Konservierung über ein vierstündiges Intervall in UW im Vergleich zur NELP keine Vorteile bietet.

Die Aktivität der Enzyme ( Abbildung 23: -26) sind in Gruppe 3 etwas höher als in Gruppe 2. Dies läßt auf einen geringfügig stärkeren hepatozellulären Schaden schließen, der sich auch morphologisch überwiegend perizentral durch eine verstärkte Granulierung und eine leichte fokale Vakuolisierung andeutet ( Abbildung 49 und 51). Dies ist darauf zurückzuführen, daß vor Anschluß an die NELP diese Lebern einer kurzen warmen Ischämie von ca. 10 Minuten und nach Herausnahme aus der Perfusionsma


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schine operationstechnisch bedingt einem Intervall von weiteren 3 min warmer Ischämie ausgesetzt waren. Hingegen wurden die Lebern der Gruppe 2 keiner warmen Ischämie ausgesetzt, da sie der 4°C kalten Konservierungslösung entnommen wurden.

Der endotheliale Schaden ist gemessen am Hyaluronsäureabbau in Gruppe 3 und in Gruppe 1 niedriger ausgefallen als in Gruppe 2. Dies deckt sich mit neueren Zellkulturuntersuchungen, die belegen, daß die Kälte Schäden am Endothel verursacht und weniger die Hypoxie .

In Gruppe 4 überlebten mit einer mittleren warm ischämischen Phase von 10 min fünf von sechs transplantierten Schweinen ohne Leberversagen. Somit finden die Daten von Hickman Bestätigung, daß Schweinelebern eine warme Ischämie von über einer Stunde tolerieren können. Bei dem vorliegenden Protokoll handelte es sich um eine komplette warme Ischämie und nicht um eine eventuell nur partielle, wie sie durch ein Pringle Manöver induziert wird. Ein Leberausfall in Gruppe 4 zeigt aber auch, daß sich das warm ischämische Intervall von 103 Minuten nahe an der maximal tolerierten Grenze befindet. Alle hepatozellulären Meßgrößen fielen in Gruppe 4 ungünstiger aus als in den Gruppen 1,2,3, und 6. Auffallend war neben den sehr hohen Enzymaktivitäten, daß sich morphologisch in der LM und EM deutliche Zeichen einer hepatozellulären Schädigung fanden. Hierzu zählten eine teilweise Zerstörung der Leberzellbalken, Gruppenzellnekrosen sowie eine panlobuläre Vakuolisierung ( Abbildung 53 und 54). Erstaunlich war, daß das Endothel in der Kapazität Hyaluronsäure zu metabolisieren nicht so sehr eingeschränkt wurde wie in Gruppe 2 ( Abbildung 27 ), wenngleich die Unterschiede nicht signifikant waren. In der EM war das Endothel der Gruppe 4 stärker geschwollen als in Gruppe 1 oder 3. Warum der vergleichsweise unauffällige Aspekt des Endothels der Gruppe 2 nicht mit einem ungestörten Hyaluronsäureabbau einher geht, ist noch nicht geklärt. Nach Rücksprache mit Lemasters ist es eventuell darauf zurückzuführen, daß das elektronenmikroskopisch bewertete Anschwellen des Endothels auf seiner Fähigkeit beruht zu ballonieren. Unter Kälte verliert das Cytoskelett möglicherweise diese Eigenschaft, was ihm elektronenmikroskopisch ein normales Aussehen verleiht, aber als Schutzmechanismus nicht zur Verfügung steht. Dies deckt sich in einigen Aspekten mit den Zellkulturergebnissen von Rauen.

Alle Schweine in Gruppe 5 entwickelten nach Transplantation ein primäres Organversagen. Nach 6 min warmer Ischämie und 4h Kaltkonservierung in UW war die Reperfusionsphase durch ein ungewöhnlich inhomogenes Erscheinungsbild der Leber gekennzeichnet. Rosafarbige gut perfundierte Bereiche waren umgeben von großen lividen und hypoperfundierte Arealen. Bereits die lichtmikroskopischen Untersuchungen zeigten eine weitgehende Destruktion der Leberzellbalken, Gruppenzellnekrosen und massive Einblutungen ( Abbildung 55 ). Bemerkenswert ist ferner der Verlust der Sinusbegrenzung. Nur vereinzelt ließen sich Sinusendothelzellen darstellen ( Abbildung 56 ).

Das morphologische Erscheinungsbild spiegelt sich in den biochemischen Ergebnissen wieder. Die anfallende Hyaluronsäure wurde praktisch nicht abgebaut. Im Vergleich zu den anderen Gruppen erreichte die Hyaluronsäurekonzentration Höchstwerte. Besonders aufschlußreich ist der Verlauf der alpha-GST, weil sie eine besonders kurze Halbwertzeit hat. Es zeigt sich in Gruppe 4 bereits drei Stunden nach Transplantation


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ein deutlicher Abfall, während die Konzentrationen in Gruppe 5 kontinuierlich steigen. Diese Korrelation findet auch in einer kürzlich veröffentlichten Studie Bestätigung. Die anfänglich niedrigeren Aktivitäten der Transaminasen in Gruppe 5 erklären sich dadurch, daß - wie auch makroskopisch und mikroskopisch zu belegen - nicht alle Areale der Leber ausreichend reperfundiert waren. Somit konnte zunächst nur ein Teil der freigesetzten Enzyme die Zirkulation erreichen. Die anfänglich niedrigeren Transaminasenspiegel sind bei Lebern mit einer derart gestörten Mikrozirkulation eher trügerisch.

Alle transplantierten Schweine der Gruppe 5 verstarben innerhalb der ersten 24h nach Reperfusion. Der postoperative Verlauf war gekennzeichnet durch eine diffuse Blutungsneigung. Es war nicht möglich auf die mechanische Beatmung zu verzichten, da die Schweine keine ausreichende Spontanatmung entwickelten. Innerhalb der letzten Stunden traten hypotone Phasen auf, trotz Volumensubstitution und Gabe von Katecholaminen. Es mußte sukzessiv der FiO2 bis auf 1,0 gesteigert werden.

Aus diesen Verläufen sowie den morphologischen und biochemischen Ergebnissen muß geschlossen werden, daß eine warm ischämische Phase von 6 min der eine kalt ischämische Phase von 4 Stunden folgt, zu einem primären Transplantatversagen führt. Des weiteren wird gefolgert, daß die Kaltkonservierung bei Lebern von NHBD mit den erwähnten Zeiträumen nicht das geeignete Konservierungsverfahren darstellt.

Bei keinem der transplantierten Tiere in Gruppe 6 kam es zu einem Leberausfall. Intraoperativ war die Reperfusion ähnlich homogen und ungestört wie auch in den anderen Gruppen 1,2,3 und 4. Morphologisch fand sich im Unterschied zu Gruppe 5 eine weitgehend intakte Leberläppchen Architektur ( Abbildung 57 - Abbildung 59 ). Die Sinusendothelzellen waren geschwollen, aber in ihrer Kontinuität erhalten ( Abbildung 60 ).

Laborchemisch fiel auf, daß die Enzymaktivitäten deutlich unter den der Gruppe 4 lagen, der hepatozelluläre Schaden somit weniger stark ausgeprägt war. Dies läßt sich auf zwei Faktoren zurückführen. Zunächst betrug die Phase der kontinuierlichen warmen Ischämie in Gruppe 6 7 min und nicht wie in Gruppe 4 10 min. Es erfolgte dann mit der NELP die Reoxygenierung. Wenngleich die Phasen der warmen Ischämie in beiden Gruppen etwa gleich lang waren(10 min in Gr. 4 zu 6 min plus 1 min plus 3 min =11 min in Gr. 6) ist zu vermuten, daß sich die Hepatozyten in Gruppe 6 über einen Zeitraum von 4 Stunden regenerieren konnten, bevor sie wieder einer operationstechnisch bedingten warmen Ischämie ausgesetzt waren. Wie die Galleproduktion während der NELP zeigt ( Abbildung 38 ), waren die ATP Konzentrationen offensichtlich ausreichend. Des weiteren ist anzunehmen, daß während der NELP schon ein Anteil der Transaminasen, welche durch Membranschäden der Hepatozyten nach 7 min warmer Ischämie ausgetreten sind, durch das Perfusat ( Abbildung 34 - Abbildung 37 ) ausgespült wurden.

Die hohe Metabolisierungsrate der Hyaluronsäure ( Abbildung 27 ) weist in Gruppe 6 auf ein funktionell intaktes Endothel hin. Hierin besteht auch morphologisch ein wesentlicher Unterschied zu den Lebern in Gruppe 5.


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Erstmals konnte somit der Nachweis geführt werden, daß es möglich ist, Lebern von NHBD nach 6 min warmer Ischämie und 4 Stunden NELP erfolgreich zu transplantieren, während die kalte statische Konservierung in UW versagte.

Eine weitere wesentliche Voraussetzung für die Nutzung von NHBD Lebern, besteht in der Notwendigkeit vor der Transplantation Aussagen über die Organqualität treffen zu können. Während dieser Punkt bei der Nierentransplantation durch die Verfügbarkeit der Hämodialyse im Falle eines primären Transplantatversagens nicht eine solch immense Bedeutung hat, hängt beim Organempfänger einer Leber das Leben von der primären Transplantatfunktion ab.

Wie wichtig das Monitoring der Organfunktion nach Explantation ist, wird deutlich, wenn man bedenkt, daß es in vielen Fällen nach Herzstillstand und Reanimationsversuchen nicht möglich ist, mit Bestimmtheit zu sagen, wie lange die Leber hypoperfundiert und ischämisch war oder welche Auswirkungen die unter Reanimationsbedingungen applizierten Katecholamine auf die Leberfunktion hatten. Wird danach eine Leber entnommen und statisch kalt konserviert ließe sich erst nach erfolgter Transplantation die Leberfunktion bestimmen. Die NELP hingegen bietet dadurch, daß die Leber physiologisch perfundiert wird, eine sehr gute Möglichkeit die Funktion einzuschätzen. Direkt an der perfundierten Leber kann die Galleproduktion gemessen, der Sauerstoffverbrauch berechnet und der Perfusionswiderstand ermittelt werden. Des weiteren können auch die Transaminasen, während die Perfusion läuft, bestimmt werden. Es kann natürlich nicht an Hand der hier vorgelegten Studie gefolgert werden, ab welcher Galleproduktion, Sauerstoffverbrauch oder ab welchem Widerstand die Lebern viabel sind und wann nicht. Dies bedürfte eines komplett neuen Studienentwurfs. Trotzdem kann man auf Grund der zahlreichen Gemeinsamkeiten zwischen porcinen und humanen Lebern annehmen, wenn ähnliche Daten während einer humanen Leberperfusion wie im obigen Protokoll während der Schweineleberperfusion erzielt werden, eine primäre Leberfunktion nach Transplantation sehr wahrscheinlich ist.

Alle gewonnenen Ergebnisse insbesondere der Gruppen 5 und 6 lassen den Schluß zu, daß die NELP das geeignetere Verfahren zu Konservierung von Lebern nicht herzschlagender Spender ist.

4.5 Rückschlüsse für die Klinik

Die vorgelegte tierexperimentelle Studie unterscheidet sich in einigen Aspekten von einer klinischen Situation. Während in dem obigen Protokoll definierte Bedingungen vorlagen, z.B. exakt 6 min komplette Ischämie vor Hepatektomie, ist bei der klinischen Anwendung von einer unbestimmten Zeit warmer Ischämie auszugehen. Die möglichen Organspender lassen sich in vier Kategorien einteilen: 1. Unfallopfer, die bei Ankunft in der Klinik bereits verstorben sind, 2. nach frustraner Reanimation, 3. bei bevorstehendem Herzstillstand, - z.B. wenn die intensivmedizinische Behandlung abgebrochen wird -, und 4. nach Herzstillstand bei Hirntoten Patienten. Diese Heterogenität der Spender verdeutlicht, wie schon eingangs erwähnt, die Notwendigkeit eines Organmonitorings nach Explantation, aber auch die Notwendigkeit einer gut organi


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sierten Logistik vor Ort. Diesem Aspekt ist besonderes Augenmerk zu widmen. Denkbar ist die Schaffung eines Explantationsteams, das den Verstorbenen sofort nach der Diagnose des Herzstillstandes und Feststellung des Todes in den OP transportiert.

Parallel hierzu muß von einem zweiten Team die Perfusionsmaschine hergerichtet und mit Blutkonserven und Dialysat gefüllt werden, damit direkt nach Explantation die Leber an die NELP angeschlossen werden kann. Während die NELP mit der entnommenen Leber läuft, sollten Viabilitätsuntersuchungen durchgeführt werden. Wenn die Leberqualität als gut angesehen werden kann und nur dann, müßte der Empfänger narkotisiert und anschließend hepatektomiert werden. Nach Entnahme aus der NELP, mit der unweigerlich das zweite Intervall warmer Ischämie beginnt, sollte die Transplantation besonders zügig erfolgen können. Insbesondere scheint es sinnvoll, um Ischämiezeit zu sparen, die Reperfusion bereits nach Fertigstellung der suprahepatischen V. Cava Anastomose und Pfortaderanastomose durchzuführen.

Neben diesen logistischen und operativen Abläufen müssen vor einer klinischen Anwendung auch ethische und rechtliche Belange erörtert und geklärt werden. Es stellen sich folgende Fragen: Stimmen die Angehörigen der Organentnahme zu und wann? Könnte der Patient schon mit Unterzeichnung des Krankenhausbehandlungsvertrags einen Passus unterzeichnen, der die Organentnahme im Falle des Todes erlaubt? Zur Zeit schließt das deutsche Transplantationsgesetz im §5 Abs. 1 Nr. 2 die Nutzung von NHBD praktisch aus, da der „endgültige, nicht behebbare Stillstand von Herz und Kreislauf eingetreten und seitdem mehr als drei Stunden vergangen sein müssen“. Eine solche gesetzliche Einschränkung findet sich in keinem anderen Land und ist wohl auch nur unter dem Gesichtspunkt der öffentlichen Meinungsbildung zu verstehen. Die Klippe einer erneuten Diskussion darüber, wann ein Mensch tot ist und warum denn nicht nur Organe von NHBD genutzt werden, konnte hierdurch umschifft werden. Auf dem 5. Kongreß der „International Society of Organ Sharing“, in Maastricht, NL, im April 1999 berichtete Kootstra, daß 1998 in seiner Klinik mehr als 40% der Nierenspenden von NHBD stammten und diese Zahl in den USA bereits 6% aller Nierenspenden aus allen Zentren betrifft. Bedenkt man, daß nur eine geringe Anzahl der Kliniken tatsächlich über eine NHBD-Logistik verfügen, verdeutlicht sich das enorme, nicht genutzte Potential an transplantablen Nieren. Bei weiter ansteigenden Wartelisten dürfte es nur eine Frage der Zeit sein, wann eine Novellierung dieser Gesetzespassage folgt.

Die Vorgehensweise, die auf dem „Workshop on NHBD“ in Maastricht, 1994, vorgeschlagen wurde und auch seither in den Niederlanden, Großbritannien und anderen europäischen Ländern praktiziert wird, könnte Vorbildfunktion übernehmen: 10 Minuten nach Herzstillstand werden abgewartet, um in dieser Zeit den Hirntod sicher eintreten zu lassen, da 10 Minuten ohne Zirkulation bei Normothermie irreversibel die Hirnfunktion schädigen. Denkbar wäre auch, daß der Verstorbene anschließend sofort zur Hepatektomie in den OP gebracht würde.


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Die klinischen Ergebnisse für die Nierenspende sind unstrittig, in Bezug auf die Leberspende von NHBD liegen solche bisher nicht vor. Die vorgestellten experimentellen Resultate könnten einen ersten Schritt zur Umsetzung in eine klinische Studie rechtfertigen. Es erscheint notwendig, daß nachdem das Transplantationsgesetz in Deutschland nun verabschiedet ist, erneut der Meinungsaustausch mit Patientenorganisationen, christlichen Einrichtungen und Ethikkommissionen sowie der Legislative gesucht wird.

4.6 Einsatzmöglichkeiten der NELP als Konservierungsmethode

Hickman et al. zeigten, daß 120 Minuten warme Ischämie zu einer 100%igen PNF führen. Es kann als gesichert gelten, daß der Schaden, den eine Leber unter warm ischämischen Bedingungen über einen Zeitraum von vier Stunden erleidet, irreversibel ist. Wird die Leber in UW über 4 Stunden kalt konserviert, ohne vorherige warme Ischämie, resultiert postoperativ eine gute Organfunktion (Gruppe 2). Das gleiche trifft für die Organfunktion nach 4 Stunden NELP (Gruppe 3) zu. Die Kaltkonservierung in UW bietet gemessen am Überleben und der Leberfunktion der transplantierten Schweine gegenüber der NELP keine Vorteile. Erstmals kann somit für die NELP gezeigt werden, daß sie tatsächlich eine alternative Konservierungsmethode zur Kaltkonservierung darstellt.

Ein wie im obigen Protokoll verwendeter Perfusionszeitraum von 4 Stunden reicht für klinische Anwendungen nicht aus. Insbesondere wiegen die potentiellen Vorteile der NELP, wie zum Beispiel das Leberfunktionsmonitoring, nicht die unbestreitbaren Vorteile der Kaltkonservierung, wie die einfache Handhabung, niedrigen Kosten und längeren Konservierungszeiten auf.

Es muß die Frage gestellt werden, ob sich dieser Zeitraum von 4 Stunden verlängern läßt. Mit dem vorliegenden Studienprotokoll und den gewonnen Ergebnissen läßt sich diese Frage nicht sicher beantworten, da keine längeren Perfusionszeiträume als 4 Stunden mit anschließender Transplantation untersucht wurden. Aber die Annahme, daß 4 Stunden NELP nicht den maximal längsten Zeitraum darstellen, wird durch das Überleben der Schweine in Gruppe 6 gestützt. Es liegt nahe zu vermuten, daß eine ischämisch geschädigte Leber nach 4 Stunden NELP primär funktioniert, auch nach mehr als 4 Stunden NELP ohne vorherige warme Ischämie, ihre Funktion aufnehmen wird. Auf welche Zeiträume sich dieses Konservierungsintervall ausdehnen lassen wird, bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. Neuhaus konnte zeigen, daß auch nach 24 Stunden Perfusion die Lebern, als wichtiges Viabilitätskriterium, reichlich Galle produzierten und die Freisetzung von Transaminasen niedrig war.

Zusammengefaßt ist das Potential der NELP als experimentelle Konservierungsmethode bisher noch nicht ausgeschöpft. Während die Kaltkonservierung unter statischen Bedingungen bei 0°C einem sterbenden System gleichkommt, da auch bei dieser Temperatur eine Proteolyse in den Hepatozyten stattfindet, trifft dies bei der NELP nicht zu. Wenn man die verbrauchten Substrate während der normothermen Perfusion


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substituiert und die anfallenden Metabolite beseitigt (Galle, Dialyse), stößt das Konzept der NELP nicht mehr an theoretische Grenzen, wie sie dem Konzept der Metabolismusreduktion unter Kaltkonservierung inne wohnen.

Diese Überlegungen sollten Anlaß geben den Perfusionszeitraum der NELP in weiteren Studien systematisch auszudehnen.

4.7 Einsatzmöglichkeiten der NELP zur Einsparung von Tierversuchen

Dem Tierschutz wird in den letzten Jahren in unserer Gesellschaft eine zunehmende Bedeutung eingeräumt. Die Entnahme einer Leber bei einem narkotisierten Tier gilt als sogenannter Akutversuch und ist bei der Behörde nur anzeigepflichtig. In einem Versuch, bei dem Untersuchungen am nicht narkotisierten Tier durchgeführt werden, unterliegen die Tiere bedeutend größeren Belastungen. Deshalb ist auch ein unvergleichlich aufwendigeres Genehmigungsverfahren erforderlich.

In der Gruppe 3 konnte gezeigt werden, daß eine Leber nach 4 Stunden NELP in der von uns entwickelten Apparatur mit guter postoperativer Funktion transplantiert werden kann. Somit war die normotherme Perfusion besonders physiologisch. Dies legt die Verwendung der NELP für biochemische, pharmakologische und physiologische Untersuchungen nahe, welche bisher überwiegend nur im Tierversuch durchgeführt werden konnten.

Bereits in der Vergangenheit konnten wir zeigen, daß Schweinelebern aus Schlachthöfen für Konservierungsuntersuchungen und zur Isolation von Hepatozyten für Zellkulturuntersuchungen genutzt werden können. Durch die Aufname der Organfunktion in Gruppe 6 nach LTX, konnte gezeigt werden, daß auch unter diesen Bedingungen die NELP ein Funktionieren der Leber erlaubt. Wie die Produktion von Galle und Harnstoff und der Abbau der Hyaluronsäure verdeutlichen, gibt es Unterschiede zwischen den Lebern der Gruppe 3 und 6, aber das Überleben der Tiere belegt, daß es sich nur um eine transitorische gering gradige Funktionseinbuße der Lebern nach warmer Ischämie handelte. Somit lassen sich vermutlich mit Lebern die in Schlachthöfen unter warm ischämischen Bedingungen gewonnen wurden, relevante Untersuchungen durchführen. Dies kann zu einer weiteren Einsparung sowohl von Versuchstieren als auch Tierversuchen führen.

4.8 Transaminasenfreisetzung nach hepatozellulären Schäden bei Ischämie

Die Enzyme GOT, GPT und LDH haben sich in der Klinik als wesentliche Meßgrößen der Leberzellschädigung etabliert. Sie werden zum Monitoring hepatozellulärer Schäden herangezogen, wenngleich die Enzyme es nicht erlauben zwischen Abstoßung, Infektion oder Ischämieschäden zu unterscheiden. In dieser Studie kam es in keinem Fall zu hyperakuten Abstoßungsreaktionen, was im Schweinelebertransplantationsmodell auch fast ausschließlich nur dann beobachtet wird, wenn zuvor gegen den Spender mit einem Hauttransplantat sensibilisiert wurde. Auch konnten Ge


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fäßverschlüsse, die öfter bei der pädiatrischen Lebertransplantation auftreten, nach den erfolgten Obduktionen ausgeschlossen werden. Fulminante Hepatitiden, wie sie auch durch Reinfektion nach Lebertransplantation auf dem Boden einer Hepatitis B oder C auftreten können, sind ebenfalls in diesem Protokoll auszuschließen. Daraus kann gefolgert werden, daß die Freisetzung der Enzyme allein auf hepatozelluläre Schädigung durch warme und kalte Ischämie zurückzuführen ist.

Der nach Lebertransplantation im Serum meßbare Aktivitätsanstieg korreliert mit dem Ausmaß des ischämischen Schadens. In Gruppe 4 mit langer (103 min) warmer Ischämie und damit größerer hepatozellulärer Schädigung sind die Enzymaktivitäten in stärkerem Ausmaß angestiegen als in Gruppe 1 mit kurzer (35 min) warmer Ischämie oder in der zweiten Gruppe nach kalter Ischämie ( Abbildung 23: - Abbildung 26 ).

Die Enzyme reagieren unterschiedlich auf denselben hepatozellulären Schaden. Bei geringeren Schäden, wie in den Gruppen 1, 2 und 3, zeigt GPT im Gegensatz zu den anderen Enzymen keinen wesentlichen Aktivitätsanstieg. GPT stellt einen Indikator für deutlicher ausgeprägte hepatozelluläre Schäden dar, da sie nur in der vierten und fünften Gruppe, in der die größte hepatozelluläre Schädigung entstand, über längere Zeit signifikant angestiegen war ( Abbildung 25 ).

4.9 alpha-GST-Freisetzung infolge hepatozellulärer Schäden

Klinische Studien zeigten, daß die Konzentration der alpha-GST bei Störungen der hepatozellulären Integrität, hervorgerufen durch Hepatitis-C-Infektion, Paracetamol-Intoxikation, hepatozelluläres Karzinom und Alkoholintoxikation sowie bei akuten Rejektionen ansteigt. Bisher gibt es keine Untersuchungen, in denen die Auswirkung von unterschiedlichen kalten und warm ischämischen Perioden auf die Freisetzung der alpha-GST bestimmt wurde. In den Gruppen 1-6 finden sich definierte Bedingungen, so daß die Freisetzung von alpha-GST auf die zuvor verursachte Ischämie zurückgeführt werden kann.

Während diese Studien mit dem für humane alpha-GST Bestimmungen hergestellten ELISA durchgeführt wurden, evaluierten wir erstmals den porcinen Test. Die Kreuzreaktivität zwischen dem humanen und porcinen Kit liegt unterhalb der Nachweisgrenze.

Die hier analysierten Enzyme alpha-GST, GOT, GPT und LDH reagieren unterschiedlich schnell mit einem signifikanten Aktivitäts- bzw. Konzentrationsanstieg auf die Zellschädigung. Sie erreichen zu verschiedenen Zeitpunkten den gemessenen Maximalwert.

Der zeitliche Verlauf der Enzymfreisetzung ist abhängig von der Enzymkonzentration in den Hepatozyten. Während alpha-GST in periportalen und zentrilobulären Zellen annähernd homogen verteilt ist, weisen die Transaminasen in den periportalen Hepatozyten die höchsten Aktivitäten auf. Die zentrilobulären Hepatozyten werden durch Ischämie stärker geschädigt als die periportalen. Wegen der niedrigeren Aktivitäten können daher kleinere Schäden an perizentralen Hepatozyten durch GOT, GPT und LDH weniger sensitiv erfaßt werden.


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alpha-GST ist ein relativ kleines Enzym mit einem MG von 50.000, wenn man es mit den Transaminasen vergleicht. Die GOT weist ein MG von 93.000 auf, die GPT von 110.000 und LDH von 134.000. Die Freisetzung könnte somit bei Zellmembranschäden früher erfolgen, was sich im Vergleich zur GOT am schnelleren Anstieg der Enzymkonzentration nach Reperfusion zeigt.

Die LDH-Aktivität zeigte einen ähnlichen Verlauf wie die GOT-Aktivität in Gruppe 4 nach einstündiger warmer Ischämie. In den Gruppen 1-3 mit geringer hepatozellulärer Schädigung ist Anstieg und Abnahme der LDH-Aktivität im Vergleich zur GOT-Aktivität verzögert. Daher eignet sich die LDH-Aktivität ebenfalls nicht zur Kontrolle des aktuellen Zustandes der Leber und bewährt sich, wie die GOT-Aktivität, eher als Indikator bei retrospektiver Beurteilung der Leberschädigung.

Bereits am ersten Tag unterschieden sich die alpha-GST-Konzentrationen nicht mehr signifikant vom Referenzbereich ( Abbildung 23: ). Da als Ursache für die hepatozellulären Schäden im obigen Transplantationsmodell nur Ischämie in Frage kommt und diese nach Reperfusion zu keiner weiteren Schädigung führt, ist für die Konzentrationsabnahme der alpha-GST die kurze Halbwertzeit von 60-90 min verantwortlich. Die anderen Enzyme hingegen weisen längere Halbwertzeiten als alpha-GST (GOT 17 Stunden; GPT 47 Stunden; LDH 113 Stunden) auf. Dadurch erreichten die Aktivitäten dieser Enzyme in allen Versuchsgruppen später als alpha-GST wieder den Referenzbereich. Zusammengefaßt korreliert der Verlauf der alpha-GST-Konzentration mit dem Schweregrad der ischämischen Schädigung, spricht aber schneller mit einem Konzentrationsanstieg und Abfall an, als die bisher verwendeten Enzyme.

4.10 Schlußfolgerung für die klinische Anwendung

Wenngleich die Untersuchungen sich auf Ischämieschäden beziehen belegen die klinischen Studien, daß die alpha-GST-Konzentration ein ubiquitärer Marker für hepatozelluläre Schäden ist, ähnlich den Transaminasen GOT, GPT und LDH. Für das intensivmedizinische Monitoring nach Lebertransplantation ist es vorteilhaft, wenn kurzfristig neue Schädigungen der Leber genau erfaßt werden können. Hierzu läßt der Aktivitätsverlauf von GOT, GPT und LDH nur eine zeitverzögerte Beurteilung des momentanen Zustandes der hepatozellulären Membranintegrität zu. alpha-GST scheint ferner besonders zur Erfassung frühzeitiger und geringgradiger Schädigungen geeignet zu sein. Für die Behandlung der Patienten ist ein frühzeitiges Erfassen zum Beispiel einer Leberarterienthrombose, eines primären Organversagens, einer Infektion oder Reinfektion der Leber mit Hepatitis B- oder C-Viren oder einer CMV-Hepatitis vorteilhaft, um entsprechend therapeutisch intervenieren zu können. In wie weit diese Aufgabe auch durch ähnlich schnell reagierende lysosomale Enzyme erfüllt werden kann, bleibt zu untersuchen.

Aber auch der Therapieerfolg nach Prednisolonbolusgabe bei akuter Abstoßungsreaktion ließe sich frühzeitiger erfassen, wenn alpha-GST zum Monitoring eingesetzt wird. Das belegen auch neuere Studien. Sollte es zukünftig gelingen, für alpha-GST anstelle des


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ELISA einen preiswerteren photometrischen Test zu entwickeln, wären alle Voraussetzungen für eine routinemäßige klinische Bestimmung der alpha-GST gegeben. Solange die alpha-GST nur als ELISA zur Verfügung steht, wird der klinische Einsatz nur bedingt erfolgen.

4.11 Beurteilung der Perfusionsergebnisse in den Gruppen 3 und 6

Durch die Integration des Dialysekreislaufs wurde die Kaliumkonzentration des Schweinevollbluts, das als Perfusat diente, von 6mmol/l auf 4,5mmol/l reduziert ( Abbildung 33 ). Auch nach Reperfusion kam es zu keinem signifikanten Kaliumanstieg im Perfusat, weder in Gruppe 3 noch in Gruppe 6. Dies bestätigte die im Teil 1 dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse (Abbildung 13). Es zeigte sich, daß ein Dialysatvolumen von 10l mit einer Kaliumkonzentration von 2mmol/l ausreicht, um die Kaliumkonzentration während der Perfusion im physiologischen Konzentrationsbereich zu halten. Nach 1 min Perfusion hatten sich die Kaliumkonzentrationen im Perfusat und Dialysat ohne nennenswerte Unterschiede zwischen den Gruppen angeglichen.

Die Funktionsfähigkeit und der Schädigungsgrad einer extrakorporal perfundierten Leber läßt sich u.a. anhand der Galleproduktion, des Sauerstoffverbrauchs, der Freisetzung von Transaminasen sowie der morphologischen Veränderungen beurteilen 60 , 116 , 152 . Wie die Abbildung 34 und Abbildung 35 zeigen, kommt es nach Reperfusion zu einem deutlichen Anstieg von a-GST und GOT. Die Maximalwerte waren nach 2 und 3 Stunden erreicht. Dies ist auf den initialen Ischämieschaden nach 6 min zurückzuführen, da sich in Gruppe 3 keine Zunahme der Transaminasenaktivität messen lies. Interessant ist, daß es nach 2 bzw. 3 Stunden zu keinem weiteren Anstieg kam. Hieraus läßt sich folgern, daß in Gruppe 6 die hepatozelluläre Membranintegrität zu diesem Zeitpunkt wiederhergestellt war. Es läßt sich ableiten, daß die NELP membranstabilisierend ist und somit potentiell Wiederbelebungseffekte einleitet.

Die fehlende Aktivitätszunahme der Transaminasen in Gruppe 3 während der Perfusion - mit Ausnahme der LDH, welche auf Erythrozytenschädigungen durch die Rollerpumpen zurückgeführt wird - läßt den Schluß zu, daß die NELP in dem hier vorgestellten System zu keinen hepatozellulären Schäden führt 60 . In der Literatur finden sich Hinweise, die zeigen, daß es bei der Verwendung einfacherer Perfusionssysteme zu einem kontinuierlichen Anstieg der GOT als Zeichen hepatozellulärer Schädigung während der Perfusion kommt 165 , 166 .

Auch die morphologische Auswertung der Biopsien nach NELP zeigt eine gut erhaltene Leberarchitektur ( Abbildung 49 und Abbildung 50 , und Abbildung 57 und Abbildung 58 ). Dies kann als Ergebnis eines Perfusionskonzeptes gewertet werden, dessen Ziel es von vornherein war, möglichst physiologische Perfusionsbedingungen zu schaffen.

Vergleicht man den Aktivitätsverlauf von GOT zwischen dem Versuchsaufbau des ersten mit dem des zweiten Protokolls ( Abbildung 16 und Abbildung 35 ) zeigen sich Parallelen mit der Gruppe 6. Dies war zu erwarten, da in beiden Fällen die Leber einer warmen Ischämie von 90 bzw. 60 min ausgesetzt war. Die Dynamik unterscheidet sich


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jedoch. Bereits nach zwei Stunden scheint die Freisetzung an GOT in Gruppe 6 zu stagnieren. Ob dies auf die längere warme Ischämie im Protokoll 1 oder auf die Verwendung der Perfusionskammer zurückzuführen ist, läßt sich nicht zweifelsfrei klären. Zur endgültigen Beurteilung hätte der Perfusionszeitraum in beiden Protokollen verlängert werden müssen.

Im Unterschied zur Leberperfusion in situ, bei der die Leber mit einem kontinuierlichen portalvenösen Fluß versorgt wird, wurde die Pfortader in unserer Apparatur über eine Rollerpumpe perfundiert. Da es hierbei unweigerlich zu Druckspitzen kommt, wäre eine Schädigung oder Funktionsbeeinträchtigung des Sinusendothels möglich gewesen. Wie die Abbildung 40 zeigt, findet sofort mit Reperfusion der Abbau der Hyaluronsäure statt, ohne signifikante Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Hieraus läßt sich ableiten, daß das Fehlen eines physiologischen Flußprofils in der Pfortader und Arterie auf die Funktionalität des Endothels unter den herrschenden Druck- und Flußbedingungen, wohl keinen nennenswerten Einfluß hat.

Das Endothel kann als Schutzschicht vor den Hepatozyten angesehen werden,,. 6 min warme Ischämie in Gruppe 6, scheinen die Funktionsfähigkeit des Endothels unter NELP Bedingungen nicht zu beeinflussen. Nach kurzer kalter Ischämie von 4h in den Gruppen 2 und 5 hingegen ist die Funktionalität gemessen am Hyaluronsäureabbau deutlich eingeschränkt. Als ein Zeichen des fehlenden Endothelschadens kann auch die weitgehend konstante Thrombozytenzahl gewertet werden ( Abbildung 44 ). Die vermehrte Freisetzung der hepatozellulären Enzyme in Gruppe 6 während der Perfusion, weist darauf hin, daß der hepatozelluläre Schaden im gewissen Umfang unabhängig vom endothelialen Schaden ist. Erst die Kombination aus hepatozellulärem Schaden durch 6 min warme Ischämie und endothelialem Schaden durch 4 h kalte Ischämie, führte in Gruppe 5 zum unausweichlichen primären Organversagen.

Zusammengefaßt zeigten die Konstanz der Enzymaktivitäten in Gruppe 3, die gute morphologische Konservierung der Leberarchitektur und der Abbau der Hyaluronsäure in beiden Gruppen, daß die NELP auf hohem physiologischen Niveau durchgeführt werden kann. Somit war die wichtigste Voraussetzung zum Erreichen der Zielsetzung - der erfolgreichen Transplantation von Lebern aus NHBD - gegeben.


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Thu Aug 15 18:39:25 2002