Zur Erlangung der Venia Legendi

für das Fach Chirurgie

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dr. med. Michael R. Schön,
Berlin 1999

Gutachter:
Prof. Dr. med. K. Schwemmle
Prof. Dr. med. Dr. vet. C. Hammer

Diese Untersuchungen wurden mit Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn und der Sonnenfeld-Stiftung, Berlin durchgeführt

Zusammenfassung

Es wurde untersucht ob die normotherme extrakorporale Leberperfusion (NELP) als Methode geeignet ist, Lebern vor Transplantation zu konservieren, und ob sie warm ischämische Zellschäden beheben kann. Zum ersten Mal konnte experimentell gezeigt werden, daß eine erfolgreiche Transplantation nach 4 Stunden mit NELP möglich ist und sogar so zuverlässig, wie die Kaltkonservierung in der University of Wisconsin Lösung. Die NELP erhält die Leberfunktion und ermöglicht eine Regeneration warm ischämischer Schäden in Nicht-herzschlagenden Spendern.

36 Schweine der Deutschen Landrasse wurden in sechs Gruppen transplantiert. In der Gruppe 1 wurde direkt nach Organentnahme transplantiert, in Gruppe 2 nach 4 Stunden Kaltkonservierung in der University of Wisconsin Lösung und in Gruppe 3 nach 4 Stunden NELP. In Gruppe 4 wurden die Lebern nach 60 Minuten warmer Ischämie direkt transplantiert, in Gruppe 5 nach 60 Minuten warmer Ischämie und 4 Stunden Kaltkonservierung und in Gruppe 6 nach 60 Minuten warmer Ischämie und 4 Stunden NELP. Alle Tiere deren Lebern vor Transplantation normotherm extrakorporal perfundiert wurden (Gruppen 3 und 6) überlebten mit guter Organfunktion. Im Unterschied hierzu führte die Abfolge von 60 Minuten warmer Ischämie und 4 Stunden Kaltkonservierung unweigerlich zur primären Organ-Nichtfunktion innerhalb der ersten 24 Stunden nach Lebertransplantation. Die Methode der NELP bietet die Chance eine Leber außerhalb des Körpers für Zeiträume von möglicherweise länger als 4 Stunden völlig funktionsfähig zu halten. Die NELP kann zur Organkonservierung vor Transplantation eingesetzt werden, aber auch dazu, Lebern von Nicht-Herzschlagenden Spendern zu nutzen.

Abstract

Normothermic extracorporeal liver perfusion (NELP) was studied as a means to preserve livers for transplantation and to reverse warm ischemic injury. For the first time we provide experimental evidence that successful transplantation after 4h of normothermic extracorporeal liver perfusion is possible and as reliable as 4h of cold preservation in University of Wisconsin solution. NELP preserves liver function completely and is capable of reversing 60 min of warm ischemic injury in non heart beating donors.

36 German Landrace pigs were transplanted in six groups. Group 1 animals were transplanted directly, group 2 animals after 4h of cold preservation with University of Wisconsin solution and group 3 animals following 4h of normothermic extracorporeal liver perfusion. Group 4 animals sustained 1h of warm ischemia before transplantation of the liver. In group 5 animals were transplanted following 1h of warm ischemia and 4h of cold preservation, and in group 6 after 1h of warm ischemia and 4h of normothermic extracorporeal liver perfusion. All animals receiving livers treated by normothermic extracorporeal liver perfusion survived without liver failure (group 3 and 6). In contrast, all animals in group 5 developed primary graft non-function within 24 h after transplantation. The technique of NELP holds the potential to keep a mammalian liver outside the body completely functional, possibly for longer than 4h. NELP can be used for liver preservation prior to transplantation or to utilise organs from non-heart-beating donors.

Schlagwörter:
Lebertransplantation, Organkonservierung, Normotherme extrakorporale Leberperfusion, Nicht-herzschlagende Organspender

Keywords:
Liver transplantation, organ preservation, normothermic extracorporeal liver perfusion, non-heart-beating-donors

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	Transplantation von Lebern Nicht-Herzschlagender Spender im Schweineleber-Transplantationsmodell
Widmung
Abkürzungsverzeichnis	Verzeichnis der Abkürzungen
1	Einleitung
1.1	Mangel an Spenderorganen
1.2	Ansatzpunkte der Problemlösung
1.3	Fragestellungen und Zielsetzungen
1.3	Kalte Ischämie zur Organkonservierung
1.4	Nicht-herzschlagende Organspender
1.5	Normotherme extrakorporale Leberperfusion (NELP)
1.6	Normotherme extrakorporale Leberperfusion als Methode zur Organkonservierung
1.7	Normotherme extrakorporale Leberperfusion als Methode zur Organkonservierung von Lebern aus nicht-herzschlagenden Spendern
2	Material und Methoden
2.1	Evaluierung der Perfusatdialyse während NELP
2.1.1	Spenderorgane
2.1.2	Perfusionskreislauf
2.1.2.1.1	Perfusat
2.1.2.1.2	Dialysekreislauf
2.1.2.1.3	Dialysat
2.1.3	Einteilung der Versuchsgruppen
2.1.4	Untersuchungsprogramm
2.1.4.1	Probennahme und Bestimmungen
2.1.4.2	Darstellung und Auswertung der Versuchsergebnisse
2.2	Lebertransplantation nach vorausgegangener NELP
2.2.1	Versuchstiere
2.2.2	Einteilung der Versuchsgruppen
2.2.2.1	Gruppe 1: sofortige Lebertransplantation
2.2.2.2	Gruppe 2: 4h Kaltkonservierung in UW vor Lebertransplantation
2.2.2.3	Gruppe 3: 4h NELP vor Lebertransplantation
2.2.2.4	Gruppe 4: 1h warme Ischämie und anschließend Lebertransplantation
2.2.2.5	Gruppe 5: 1h warme Ischämie, 4h kalte Ischämie in UW und anschließend Lebertransplantation
2.2.2.6	Gruppe 6: 1h warme Ischämie, 4h NELP und anschließend Lebertransplantation
2.2.3	Narkose
2.2.4	Lebertransplantation
2.2.4.1	Spendertiere
2.2.4.2	Empfängertiere
2.2.4.3	Postoperative Nachsorge
2.2.5	Untersuchungsprogramm
2.2.5.1	Probennahmen
2.2.5.1	Prä- und postoperative Blutentnahmen
2.2.5.2	Viabilitätsparameter
2.2.5.2	Postoperative Bestimmungen im Serum
2.2.5.3	Galleproduktion
2.2.5.4	Darstellung und Auswertung der Versuchsergebnisse
2.2.6	NELP der Gruppen 3 und 6
2.2.6.1	Neuentwicklung des Leberperfusionssystems mit integrierter Dialyse
2.2.6.2	Überwachung der Druck- und Flußregulation
2.2.6.3	Perfusionskammer und Druckoszillation
2.2.6.4	Dialysekreislauf und Oxygenierung
2.2.6.5	Perfusat, Dialysat und Perfusion
2.2.6.6	Bestimmung in Perfusat und Dialysat
2.2.7	Licht- und Elektronenmikroskopische Untersuchungen
2.2.7.1	Entnahme der Biopsien/Biopsieprotokoll
2.2.7.2	Fixierung der Biopsien
2.2.7.3	Präparationsmethoden für die Lichtmikroskopie
2.2.7.3	Fixierung, Einbettung und Färbung
2.2.7.4	Dokumentation der Lichtmikroskopie
2.2.7.5	Präparationsmethoden für die Elektronenmikroskopie
2.2.7.5	Fixierung, Kontrastierung und Nachfixierung
2.2.7.6	Einbettung
2.2.7.7	Herstellung der Semidünnschnitte
2.2.7.8	Herstellung der Ultradünnschnitte und Nachkontrastierung
2.2.7.9	Dokumentation der Transmissionselektronenmikroskopie
2.2.7.10	Selektion der Biopsien für die Transmissionselektronenmikroskopie
3	Ergebnisse
3.1	Evaluierung der Perfusatdialyse während NELP
3.1.1	Makroskopischer Aspekt der Lebern nach Perfusion
3.1.2	Elektrolytkonzentrationen und pH-Werte im Vergleich
3.1.2.1	Natrium
3.1.2.2	Kalium
3.1.2.3	pH-Werte
3.1.3	Die Enzymaktivitäten im Vergleich
3.1.3.1	GOT (AST)
3.1.3.2	GPT (ALT)
3.1.3.3	LDH
3.1.4	Sauerstoffverbrauch, Galle- und Harnstoffproduktion
3.1.4.1	Sauerstoffverbrauch
3.1.4.2	Galleproduktion
3.1.4.3	Harnstoffproduktion
3.2	Lebertransplantation nach vorausgegangener NELP
3.2.1	Chirurgisches Modell
3.2.2	Primäre Organ-Nicht-Funktion nach Lebertransplantation
3.2.3	Überleben
3.2.4	Biochemische Parameter nach Lebertransplantation
3.2.4.1	-GST
3.2.4.2	GOT
3.2.4.3	GPT
3.2.4.4	LDH
3.2.4.5	GT und Bilirubin
3.2.4.6	Hyaluronsäure
3.2.4.7	Gesamtprotein und Albumin
3.2.4.8	Thromboplastinzeit (TPZ, Quick)
3.2.4.9	Kreatinin
3.2.5	Parameter während der vierstündigen NELP in Gruppe 3 und 6
3.2.5.1	Natrium
3.2.5.2	Kalium
3.2.5.3	-GST
3.2.5.4	GOT
3.2.5.5	GPT
3.2.5.6	LDH
3.2.5.7	Vergleich von -GST, GOT, GPT und LDH untereinander
3.2.5.8	Galleproduktion
3.2.5.9	Gesamtprotein und Albumin
3.2.5.10	Hyaluronsäure
3.2.5.11	Harnstoff
3.2.5.12	Ammoniak
3.2.5.13	Leukozyten
3.2.5.14	Thrombozyten
3.2.6	Morphologische Ergebnisse nach licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen
4	Diskussion
4.1	Zur Wahl des Schweins als Versuchstier
4.2	Verbesserung der NELP
4.3	Lebertransplantation nach NELP
4.4	Überlebensdaten nach Lebertransplantation
4.5	Rückschlüsse für die Klinik
4.6	Einsatzmöglichkeiten der NELP als Konservierungsmethode
4.7	Einsatzmöglichkeiten der NELP zur Einsparung von Tierversuchen
4.8	Transaminasenfreisetzung nach hepatozellulären Schäden bei Ischämie
4.9	-GST-Freisetzung infolge hepatozellulärer Schäden
4.10	Schlußfolgerung für die klinische Anwendung
4.11	Beurteilung der Perfusionsergebnisse in den Gruppen 3 und 6
5	Zusammenfassung
Bibliographie	Literaturverzeichnis
Danksagung

Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:	Schema des Perfusionssystems
Abbildung 2:	Gleichzeitige Operation von Spender und Empfänger in Gruppen 1 und 4.
Abbildung 3:	Plazierung der mit Spiralen versehenen Perfusionsschläuche in V. portae und infrahepatischer V. cava inf. sowie in Ductus choledochus und A. hepatica
Abbildung 4:	Plazierung der Schläuche in der Durchtrittsplatte für die Perfusionskammer
Abbildung 5:	Blick durch den Deckel der Perfusionskammer auf die perfundierte Leber fünf Minuten nach Reperfusion. Der sterile Kunststoffbeutel isoliert die Leber vom temperierten Wasser der Perfusionskammer. Die Leber schwimmt ohne Kontakt zu den Plexiglaswänden in der Perfusionskammer. Gut sichtbar ist der Silikonschlauch der Pfortader und rechts davon der Silikonschlauch der V. cava. In Bildmitte befindet sich das Gallenblasenbett nach Cholecystektomie.
Abbildung 6:	Übersicht der Versuchsgruppen
Abbildung 7:	Dargestellt ist das Monitorbild vor Beginn der Perfusion. Blau korrespondiert mit dem venösen Perfusat, rot mit dem arterialisierten Perfusat. Die Farbe Gelb weist darauf hin, daß das in die V. portae gepumpte Perfusat gemischtvenös war. Die Kästchen zeigen online die Flüsse in ml/min, Drücke in mmHg und den berechneten Widerstand in p/V an.
Abbildung 8:	Neu entwickelte Leberperfusionsmaschine auf einer rollbaren Konsole mit integriertem Akku. Von links nach rechts: Perfusionskammer, Gasflußmeßgerät, Flügelzellenpumpe für den Perfusionskammerdruck, Notebook und Bedienpanel.
Abbildung 9:	Die Detailaufnahme der Perfusionsmaschine zeigt von links nach rechts Wasser und Dialysatbehälter, Wärmetauscher, Dialysator und den Membranoxygenator
Abbildung 10:	Schema des Perfusionssystems
Abbildung 11:	Darstellung des Zeitstrahls am Beispiel der Gruppe 6. Von allen ausgewerteten Biopsien wird nur die Biopsie 3 in alle 6 Gruppen und die Biopsie 2 zusätzlich in den Gruppen 3 und 6 dargestellt.
Abbildung 12:	Die Natriumkonzentrationen im Perfusat der Gruppen 1 und 2 unterschieden sich nicht signifikant während der dreistündigen Perfusion. Die Natriumkonzentration im Dialysat von Gruppe 2 erhöhte sich leicht von 140 auf 142 mmol/l.
Abbildung 13:	Es wurde ein Konzentrationsanstieg für Kalium im Perfusat der Gruppe 1 und eine Konzentrationsabnahme für Gruppe 2 (p=0,004 für t=30 min und p<0,0001 für t>30 min) gemessen. Im Dialysat von Gruppe 2 erhöhte sich die Kaliumkonzentration während der dreistündigen Perfusionszeit von 3 auf 4mmol/l.
Abbildung 14:	Die Kaliumfreisetzung während der Perfusion lag in Gruppe 1 zwischen Beginn und der 90sten Minute und zwischen der 90sten bis 180sten Minute über der von Gruppe 2. In der Gesamtbilanz wurde in Gruppe 1 signifikant mehr Kalium freigesetzt als in Gruppe 2.
Abbildung 15:	Der pH-Wert der Gruppe 1 fiel kontinuierlich mit dem Perfusionsbeginn während in Gruppe 2 nur in den ersten 30 Minuten ein pH Abfall gemessen wurde. Eine statistische Signifikanz von p<0,05 wurde für den Meßzeitpunkt 30 min und von p<0,0001 für die Meßzeitpunkte 60, 90, 120, 150 und 180 min nach Perfusionsbeginn berechnet.
Abbildung 16:	Die höchste Zunahme der GOT-Aktivität fand sich in den ersten 3 min nach Reperfusion. Die weitere Zunahme der GOT-Aktivität beider Gruppen verlief weitgehend parallel. Eine statistische Signifikanz von p<0,05 wurde für die Meßpunkte 30, 60 und 90 min berechnet.
Abbildung 17:	Zunahme der GPT-Aktivität beider Gruppen während der dreistündigen Perfusion. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wurde zu keinem Zeitpunkt berechnet
Abbildung 18:	Zunahme der GPT-Aktivität beider Gruppen während der dreistündigen Perfusion. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wurde zu keinem Zeitpunkt berechnet
Abbildung 19:	Sauerstoffverbrauch in beiden Gruppen während der dreistündigen Perfusion mit statistisch signifikantem Unterschied nach 3 h Perfusion.
Abbildung 20:	Die Gallegesamtproduktion nach 3 h Perfusion lag in Gruppe 2 signifikant über der Galleproduktion in Gruppe 1.
Abbildung 21:	Die Harnstoffkonzentration beider Gruppen während der dreistündigen Perfusion zeigt zu allen Meßpunkten einen statistisch signifikanten (p<0,05) Unterschied zwischen den Gruppen 1 und 2.
Abbildung 22:	Die Harnstoffproduktion während der Perfusion war in Gruppe 2 zu allen Zeitpunkten höher als in Gruppe 1, erreicht aber keine statistische Signifikanz.
Abbildung 23:	Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der -GST.
Abbildung 24:	Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der GOT.
Abbildung 25:	Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der GPT.
Abbildung 26:	Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der LDH.
Abbildung 27:	Die Hyaluronsäurekonzentration steigt während der anhepatischen Phase an. Nach Reperfusion sinken die Hyaluronsäurespiegel innerhalb der ersten 6h unter die anhepatischen Werte für die Gruppe 1, 3, 4 und 6 ab. Wurde die Leber kalter Ischämie ausgesetzt (Gruppen 2 und 6) lagen die Hyaluronsäurekonzentrationen bis zum ersten postoperativen Tag über denen der anderen Gruppen. Die Gruppen 2 zeigte einen vergleichsweise verzögerten Abbau der Hyaluronsäure in den Stunden nach Reperfusion.
Abbildung 28:	Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der Proteine.
Abbildung 29:	Prä- und postoperative Serumkonzentrationen der TPZ nach ReperfusionHarnstoff
Abbildung 30:	Prä- und postoperative Serumkonzentrationen von Harnstoff
Abbildung 31:	Prä- und postoperative Serumkonzentrationen von Kreatinin
Abbildung 32:	Natriumkonzentration in Perfusat und Dialysat der Gruppen 3 und 6 während der vier stündigen NELP.
Abbildung 33:	Kaliumkonzentration in Perfusat und Dialysat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 34:	-GST im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 35:	GOT im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 36:	GPT im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 37:	LDH im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 38:	Die Gesamtproduktion der Galle in Gruppe 3 nach 4 Stunden NELP lag signifikant über der Gallegesamtproduktion in Gruppe 6 (p<0,00081).
Abbildung 39:	Proteine im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 40:	Hyaluronsäurekonzentration im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 41:	Harnstoff in Perfusat und Dialysat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 42:	Ammoniak in Perfusat und Dialysat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 43:	Leukozyten im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 44:	Thrombozyten im Perfusat der Gruppen 3 und 6 während NELP
Abbildung 45:	Lichtmikroskopie Gruppe 1
Abbildung 46:	Elektronenmikroskopie Gruppe 1
Abbildung 47:	Lichtmikroskopie Gruppe 2
Abbildung 48:	Elektronenmikroskopie Gruppe 2
Abbildung 49:	Lichtmikroskopie Gruppe 3, Biopsie2
Abbildung 50:	Elektronenmikroskopie Gruppe 3, Biopsie 2
Abbildung 51:	Lichtmikroskopie Gruppe 3, Biopsie 3
Abbildung 52:	Elektronenmikroskopie Gruppe 3, Biopsie 3
Abbildung 53:	Lichtmikroskopie Gruppe 4
Abbildung 54:	Elektronenmikroskopie Gruppe 4
Abbildung 55:	Lichtmikroskopie Gruppe 5
Abbildung 56:	Elektronenmikroskopie Gruppe 5
Abbildung 57:	Lichtmikroskopie Gruppe 6, Biopsie 2
Abbildung 58:	Elektronenmikroskopie Gruppe 6, Biopsie 2
Abbildung 59:	Lichtmikroskopie Gruppe 6, Biopsie 3
Abbildung 60:	Elektronenmikroskopie Gruppe 6, Biopsie 3

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