Schönborn, Ines: Der Einfluß von Ovulationshemmern auf die Tumorbiologie und die Prognose des Mammakarzinoms

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Kapitel 1. Material und Methode

1.1 Epidemiologische Methodik

1.1.1 Studiendesign

Die primäre Datenerfassung für alle Mammakarzinompatientinnen erfolgte im Rahmen der „WHO Collaborative Study of Neoplasia and Steroid Contraceptives“. Diese WHO-Studie war eine internationale multizentrische Fall-Kontroll Studie zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen der Verwendung von OH und dem Karzinomrisiko für verschiedene Organlokalisationen (WHO 1985, WHO 1990). Von November 1982 bis Juli 1986 wurden 502 Fälle mit Mammakarzinom und 1316 Kontrollen rekrutiert. 490 Fälle und 1223 Kontrollen konnten letztlich für die Fall-Kontroll Studie ausgewertet werden (Ebeling et al. 1991).

Von allen primär in die WHO-Studie eingeschlossenen Frauen wurden ausschließlich die 490 Patientinnen mit Mammakarzinom für die hier vorliegende Studie zur Bedeutung der OH-Einnahme für die Tumorbiologie und die Prognose der Erkrankung rekrutiert. Im Verlauf der Studie mußten 19 Patientinnen ausgeschlossen werden, da sie unmittelbar nach der Diagnose nicht mehr nachbeobachtet werden konnten. Somit konnten 471 Fälle mit dokumentiertem Follow-up in diese Untersuchung eingeschlossen werden.

Sämtliche anamnestischen, klinischen und histomorphologischen Daten wurden bei Diagnose und Primärtherapie des Mammakarzinoms unter kontrollierten Bedingungen erfaßt (WHO 1985, WHO 1990). Nur Frauen, die nach 1930 geboren worden waren, hatten während ihres reproduktiven Lebensabschnittes auch die Möglichkeit, OH zu verwenden und konnten damit für die Studie rekrutiert werden.

Im Rahmen eines standardisierten Fragebogens wurden Informationen zu bekannten und potentiellen Risikofaktoren für das Mammakarzinom sowie eine komplette gynäkologische und geburtshilfliche Anamnese erhoben.

Faktoren, die durch hormonelle Veränderungen, Differenzen in der genetischen Belastung oder auch Unterschiede im sozialen Status und Verhalten einen Einfluß auf die Biologie des Mammakarzinoms oder die Prognose der Erkrankung haben können, wurden in dieser Studie einbezogen.

Das Follow-up der Patientinnen wurde mit Hilfe populationsbezogener und klinikbezogener Register erhoben. Weitere Informationen entstammen den Landeseinwohnermeldeämtern und wurden durch Kontakte mit den behandelnden Ärzten überprüft. Das mediane Follow-up für noch lebende Patientinnen erstreckte sich über einen Zeitraum von 117 (48-151) Monaten. Die mediane Überlebenszeit für verstorbene Patientinnen belief sich auf 44.5 (5-130) Monate. Das mediane Follow-up für die Gesamtgruppe betrug 107 (5-151) Monate.

1.1.2 Patientencharakteristika

Alle Patientinnen waren konsekutiv zwischen 1982 und 1986 wegen eines invasiven Mammakarzinoms an der Robert-Rössle-Klinik des ehemaligen Zentralinstitutes für Krebsforschung, heute Charité Campus Berlin-Buch, aufgenommen worden. Das Durchschnittsalter der Patientinnen betrug 45 (26-52) Jahre.

Die Diagnostik, operative Therapie und gegebenenfalls auch die adjuvante Behandlung erfolgten an einer Einrichtung und unterlagen im Rekrutierungszeitraum gleichbleibenden Therapiestandards. Alle Patientinnen wurden primär operiert. Bei Frauen mit brusterhaltender Operation erfolgte eine lokale Strahlentherapie. Keine der Patientinnen wies eine distale Metastasierung auf. Patientinnen mit positivem Lymphknoten(LK)-Status erhielten eine Chemotherapie (Bonadonna-Schema 6 Zyklen CMF). Bei 36 Patientinnen mit LK-negativen Tumoren wurde aufgrund ungünstiger prognostischer Kriterien ebenfalls eine Chemotherapie durchgeführt. Postmenopausale Patientinnen mit LK-positivem Mammakarzinom wurden adjuvant mit Tamoxifen 30mg/Tag behandelt. Aufgrund des Studiendesigns waren nur wenige


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der Patientinnen postmenopausal. Patientinnen wurden als postmenopausal bezeichnet, wenn sie seit mindestens einem Jahr keine Menstruationsblutung mehr gehabt hatten oder wenn nach operativer Entfernung beider Ovarien keine hormonelle Substitution erfolgt war. Tabelle 1.1-1 faßt die klinischen Charakteristika der rekrutierten Patientinnen zusammen.

Tabelle 1.1-1 Patientencharakteristika

 

 

Anzahl der Patientinnen

471

Alter bei Diagnose

(mittleres, Standardabweichung)

45 (SD ±5.99) Jahre

Menopause

 

Prämenopausal

373 (79.2%)

Postmenopausal

98 (20.8%)

OH-Einnahme

 

Ja

297 (63.1%)

Nein

174 (36.9%)

Primäre Therapie

 

Modifizierte Mastektomie

288 (61.1%)

Brusterhaltendes Vorgehen

183 (38.9%)

Adjuvante Chemotherapie (CMF)

 

Lymphknoten-negative Tumoren

36 ( 7.6%)

Lymphknoten-positive Tumoren

223 (47.3%)

Verstorben

 

am Mammakarzinom

161 (34.2%)

Andere Ursachen

1 ( 0.2%)

 

 

OH-Einnnahme

Von den erfaßten 471 Patientinnen hatten 297 (63.1%) zu irgendeinem Zeitpunkt vor der Diagnose ihrer Erkrankung OH eingenommen. Keine der Patientinnen hatte die Einnahme von OH nach der Diagnose des Mammakarzinoms fortgesetzt oder zu irgendeinem Zeitpunkt wieder aufgenommen. 184 Patientinnen (62% aller Frauen mit OH-Einnahme) hatten OH über mehr als 5 Jahre eingenommen und 92 dieser Frauen hatten sogar über mehr als 10 Jahre OH verwendet. Die Patientinnen hatten mit wenigen Ausnahmen Kombinationspräparate eingenommen. Die verwendeten OH enthielten

Tabelle 1.1-2 gibt einen Überblick zur Zusammensetzung der verwendeten Präparate.


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Tabelle 1.1-2 Ovulationshemmer (OH): verwendete Präparate und deren Zusammensetzung

 

Östrogen

Gestagen

Kombinierte OH

 

 

OvosistonR

0.1/0.08 mg Mestranol

2.0 mg CMA

GravistatR

0.05 mg EE

0.125 mg LNG oder

 

 

0.250 mg LNG (bis 1978)

MinisistonR

0.03 mg EE

0.125 mg LNG

Non OvlonR

0.05 mg EE

1 mg NETA

 

 

 

Sequenzpräparate

 

 

SequostatR

0.05 mg EE

( 1.-6. ZT2)

0.05 mg EE

1 mg NETA (7.-21. ZT)

DeposistonR

1 mg EE-PS1 (1x/Wo)

5 mg NETA (2 Tbl. 25. ZT)

 

 

 

1 Ethinylestradiolpropansulfonat

2 Zyklustag

1.2 Histopathologie

Die histomorphologischen Befunde wurden zum Zeitpunkt der Primärtherapie durch zwei unabhängige Pathologen ermittelt. Referenzschnitte gingen dabei im Rahmen der WHO-Studie an das WHO-Referenzzentrum. Die histomorphologischen Befunde des Referenzpathologen bildeten die Grundlage für die hier zugrundeliegende Erfassung der Tumorcharakteristika (Stalsberg et al. 1989).

Im Rahmen der Studie wurde für spätere Untersuchungen jeweils ein separater Paraffinblock asserviert, der in der vorliegenden Untersuchung für die Bestimmung der Östrogenrezeptoren (ER), der Progesteronrezeptoren (PR) und der Expression des proliferating cell nuclear antigens (PCNA) sowie des epidermal growth factor receptors

(EGF-R), des c-erbB-2-Proteins und des p53-Proteins verwendet wurde.

1.2.1 Histomorphologie

Die Klassifikation des histologischen Tumortyps erfolgte nach der zum Zeitpunkt der Rekrutierung gültigen WHO-Nomenklatur (WHO 1981).

Das histologische Grading wurde nach der Methode von Bloom and Richardson ermittelt (Bloom and Richardson 1957).

Tumorgröße und LK-Status wurden entsprechend der TNM-Klassifikation bestimmt (UICC, TNM 1987).

1.2.2 Immunhistochemie

Die immunhistochemischen Untersuchungen wurden an formalinfixiertem, paraffineingebettetem Material durchgeführt. Die Fixierung erfolgte in 4% Formalin (pH 7.0) über einen Zeitraum von maximal 26 Stunden. Nach Schneiden der Blöcke in 3 µm Schnitte wurden diese auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern 20 min bei 50°C getrocknet. Zur Vermeidung von Bestimmungsfehlern durch Denaturierung der Liganden wurden primär verschiedene Präparationsmodalitäten (24 h Lufttrocknung, Trocknung über 2 h bei 37°C oder über 20 min bei 50°C) getestet. Es ergaben sich dabei keine relevanten Differenzen in der Qualität und Quantität der immunhistochemischen Bestimmungen.

Die immunhistochemischen Untersuchungen zur Bestimmung der ER-/PR- und der PCNA-Expression wurden mit Hilfe der APAAP-Methode unter Verwendung von Neufuchsin als


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Chromogen durchgeführt (Cordell et al. 1984).

Die Bestimmung der c-erbB-2-Protein- und der EGF-R-Expression erfolgten nach der Streptavidin-Biotin-Methode, die der p53-Protein Expression nach der Avidin-Biotin-Methode. Die Färbung wurde mit einem Diethylaminobenzidin (DAB) enthaltenden Substratgemisch durchgeführt. Eine Übersicht der verwendeten Methoden und Antikörper findet sich in Tabelle 1.2-1.

In allen Untersuchungsreihen wurden entsprechende Kontrollschnitte mitgeführt.

In 8 Fällen war für die Bestimmung des c-erbB-2-Proteins kein Material mehr verfügbar. In 6 Fällen war dies für die Bestimmung des p53-Proteins der Fall. Für die EGF-R Bestimmung stand in 12 Fällen kein Material zur Verfügung. In einem Fall konnte die EGF-R-Expression nicht eindeutig bestimmt werden und wurde daher nicht berücksichtigt.

Tabelle 1.2-1 Immunhistochemische Methodik

Faktor

Antikörper

Methode

ER

MAK ER-ICA Kit (Abott Denmark)

unverdünnt, 1h, Raumtemperatur

APAAP

PR

MAK anti-PR (mPRI, Dianova Germany)

1:100, 1h, Raumtemperatur

APAAP

PCNA

MAK PC10 (DAKO Denmark)

1:20, 1h, Raumtemperatur

APAAP

c-erbB-2

MAK c-neu (Ab2, Dianova Germany)

1:100, 1h, Raumtemperatur

Streptavidin-Biotin

EGF-R

Anti-EGFR (Ab 4) polyklonal (Dianova

Germany), 1:50, 1h, Raumtemperatur

Streptavidin-Biotin

p53

MAK BP53-12-1 (Biogenex USA),

1:20, 1h, Raumtemperatur

Avidin-Biotin

1.2.3 Labortechnische Methodik

ER - Immunhistochemischer Nachweis: Nach Entparaffinierung in Xylol (2x3 min) und Rehydration, Inkubation der Schnitte mit 0.1% Pronase (Merck Germany) für 5 min bei Raumtemperatur zur Demaskierung des Antigens.

Applikation des Primärantikörpers (ER-ICA Abbott Denmark) unverdünnt für 1 h bei Raumtemperatur gefolgt von einem mouse anti-rat IgG Brücken-AK (Dianova Germany) 1:200 für 30 min bei Raumtemperatur. Inkubation mit einem rabbit

anti-mouse Sekundär-AK (Dako Denmark) 1:40 für 30 min bei Raumtemperatur. Applikation des monoklonalen APAAP-Komplexes (Dako Denmark) 1:40 für 30 min bei Raumtemperatur. Wiederholung des 2. und 3. Inkubationsschrittes (Sekundär-AK und APAAP-Komplex) für jeweils 10 min Inkubation mit chromogener Substratlösung unter Verwendung von Neufuchsin. Leichte Gegenfärbung mit Harris Hämatoxylin. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten Spülung mit TRIS Puffer (0.05 m, pH 7.4-7.6). In jeder Versuchsreihe wurden entsprechende Positiv-und Negativkontrollen mitgeführt.

PR und PCNA - Immunhistochemischer Nachweis: Entparaffinierung und Rehydration in Xylol (2x3 min) und absteigender Alkoholreihe.

Applikation des Primärantikörpers anti-PR MAK (Dako Denmark) in einer Verdünnung von 1:200 oder des PC10 MAK (Dako Denmark) in einer Verdünnung 1:20 für 1 h bei Raumtemperatur.

Inkubation mit einem rabbit anti-mouse Sekundär-AK (Dako Denmark) 1:40 für


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30 min bei Raumtemperatur. Applikation des monoklonalen APAAP-Komplexes (Dako Denmark) 1:40 für 30 min bei Raumtemperatur. Wiederholung des 2. und

3. Inkubationsschrittes (Sekundär-AK und APAAP-Komplex) für jeweils 10 min.

Inkubation mit chromogener Substratlösung unter Verwendung von Neufuchsin. Leichte Gegenfärbung mit Harris Hämatoxylin. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten Spülung mit TRIS Puffer (0.05 m, pH 7.4-7.6). In jeder Versuchsreihe wurden entsprechende Positiv-und Negativkontrollen mitgeführt.

EGF-R und c-erbB-2-Protein - Immunhistochemischer Nachweis: Entparaffinierung und Rehydration in Xylol (2x3 min) und absteigender Alkoholreihe. Blockierung der endogenen Peroxidase durch Inkubation mit 3% H2O2 für 5 min bei Raumtemperatur. Applikation von Schwein-Normalserum 1:5 für 20 min bei Raumtemperatur zur Blockierung der unspezifischen Bindungsorte. Keine Spülung.

Applikation des Primär-AK Anti-EGF-R (Ab 4) polyklonal (Dianova Germany)

1: 50 für 1 h oder des c-neu MAK (Dianova Germany) 1:100 für 1 h bei Raumtemperatur. Inkubation mit biotinyliertem horseradish anti-mouse Sekundär-AK (Amersham Netherlands) 1:200 für 45 min bei Raumtemperatur. Applikation eines Streptavidin-Biotin-Peroxidase Komplexes (Amersham Netherlands) 1:200 für 15 min bei Raumtemperatur. Inkubation mit chromogener Substratlösung unter Verwendung von DAB. Leichte Gegenfärbung mit Harris Hämatoxylin.

Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten Spülung mit PBS (0.01 m, pH 7.2). In jeder Versuchsreihe wurden entsprechende Positiv-und Negativkontrollen mitgeführt.

p53-Protein - Immunhistochemischer Nachweis: Entparaffinierung und Rehydration in Xylol (2x3 min) und absteigender Alkoholreihe. Vorbehandlung mit 0.05% Saponin für 30 min. Blockierung der endogenen Peroxidase durch Inkubation mit 3% H2O2 für 5 min bei Raumtemperatur. Präinkubation mit Kaninchen-Normalserum (Dako Denmark) 1:10 für 20 min bei Raumtemperatur zur Blockierung der unspezifischen Bindungsorte. Keine Spülung. Applikation des Primär-MAK BP53-12-1 (Biogenex USA) 1:20 für 1 h bei Raumtemperatur. Inkubation mit biotinyliertem rabbit anti-mouse Brücken-AK (Dako Denmark) 1:200 für 30 min bei Raumtemperatur. Applikation eines Avidin-Biotin-Peroxidase Komplexes (Dako Denmark) für 30 min bei Raumtemperatur. Inkubation mit chromogener Substratlösung unter Verwendung von DAB. Leichte Gegenfärbung mit Harris Hämatoxylin. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten Spülung mit TRIS Puffer (0.01 m, pH 7.2). In jeder Versuchsreihe wurden entsprechende Positiv-und Negativkontrollen mitgeführt.

1.2.4 Scoring

Die Analyse der immunhistochemischen Färbungen erfolgte mit Hilfe eines Olympus-Lichtmikroskops bei 40facher Vergrößerung durch zwei unabhängige Untersucher. Bei unterschiedlichen Einschätzungen wurde unter Verwendung eines Diskussionsmikroskops ein Konsensus erzielt. Es wurden mindestens 1000 Zellen pro Präparat ausgewertet.

Für die Bestimmung der ER- und PR-Expression wurde die Anzahl eindeutig rot gefärbter Nuklei unabhängig vom Färbungsmuster als prozentualer Anteil aller Tumorzellnuklei ausgedrückt. Die PCNA-Expression zeigte eine charakteristische diffuse oder granuläre nukleäre Färbung. Eindeutig rot gefärbte Nuklei wurden unabhängig von Färbungsmuster und Intensität als positiv bewertet. Die Klassifikation erfolgte für die Steroidrezeptoren und die PCNA-Expression in drei semiquantitativen Gruppierungen (<20%/20%-50%/>50%) nach existierenden Laborstandards. Entsprechend der klinischen Relevanz wurde eine ER/PR-Expression von <20% als Rezeptor-negativ beurteilt. Eine Bestimmung der nukleären Färbungsintensität der ER/PR wurde primär durchgeführt, jedoch brachte deren Erfassung mit Hilfe eines Scores keine zusätzliche prognostische Aussage, so daß für die weiteren Analysen darauf verzichtet wurde.

Die Einschätzung der c-erbB-2-Proteinüberexpression, des EGF-R und des p53-Proteins erfolgte qualitativ nach positiver oder negativer Expression. Bei Reaktivität von mehr als 10% der Zellen wurde der Tumor als positiv bewertet.

In der Beurteilung der c-erbB-2-Proteinüberexpression wurden nur eindeutig membrangebundene Färbungen als positiv eingeschätzt. Die EGF-R-Färbung war nahezu


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ausschließlich zytoplasmatisch lokalisiert. Für die Bewertung der

p53-Expression wurden nur deutlich nukleäre Färbungen als positiv beurteilt.

1.3 Methodische Verfahren

1.3.1 Statistische Methodik

Die primäre Datenerfassung und -haltung wurde mit Hilfe des Datenbanksystems dBaseIII plus durchgeführt. Die weiteren statistischen Analysen erfolgten unter Verwendung der SPSS/Win 6.0 und BMDP-Software.

Der Effekt verschiedener OH-Einnahmecharakteristika und Gestagenkomponenten auf die Häufigkeitsverteilung histomorphologischer und tumorbiologischer Prognosefaktoren wurde durch die Schätzung von Odds Ratios (ORs) unter Nutzung von log-linearen Modellen dargestellt. Die exakten 95% Konfidenzintervalle (95% KI) wurden nach der Methode von Baptista und Pike ermittelt (Baptista and Pike 1977). Die Auswahl der Kovariablen erfolgte durch Vorwärtsselektion und Rückwärtselimination auf der Grundlage eines p-Wertes von 0.1 und 0.15 respektive.

Alle Faktoren wurden als binäre Variablen in den Analysen berücksichtigt. Der Einfluß rangkategorialer Variablen wurden mit Hilfe binärer Hilfsvariablen untersucht. Die Klassifikation aller verwendeten Variablen ist aus Tabelle 1.3-1 ersichtlich.


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Tabelle 1.3-1 Verwendete Variablen und deren Kodierung

Variable

Kodierung

 

 

Allgemeine Variablen

 

Alter (Jahre)

<35/ge35; <40/ge40; <45/ge45; <50/ge50

Menopausenstatus

prämenopausal/postmenopausal

Operationsmodus

Mastektomie/Brusterhaltung

Chemotherapie

nein/ja

Histomorphologische Faktoren

 

Histologischer Tumortyp

DCI/andere; LCI/andere

Histologisches Grading

GI / GII+GIII; GI+GII / GIII

Tumorgröße

le2cm/>2cm

Lymphknoten (LK)-Status

N0 / ge1N+; le3N+ / ge4N+

Zellulär exprimierte Faktoren

 

ER-Expression

<20%/20%-50%/>50%

PR-Expression

<20%/20%-50%/>50%

PCNA-Expression

<20%/20%-50%/>50%

c-erbB-2-Proteinüberexpression

negativ/positiv

EGF-Rezeptor-Expression

negativ/positiv

p53-Proteinexpression

negativ/positiv

Ovulationshemmer (OH)

 

OH-Einnahme

nein/ja

Dauer der Einnahme

keine OH/1-60 Monate/ge61 Monate

Abstand der letzten Einnahme zur Diagnose

keine OH/bis Diagnose/2-60Monate/>60

Abstand der ersten Einnahme zur Diagnose

keine OH/le96/ge97 Monate

Alter bei 1. Einnahme

keine OH/<20/20-24/25-29/ge30 Jahre

OH-Typ (Gestagen)

keine OH/CMA/LNG/NETA/SP-NETA

Epidemiologische Risikofaktoren

 

Menarchealter

le12/13-14/ge15 Jahre

Alter bei erster Lebendgeburt

keine Lebendgeburt/le19/20-29/ge30 Jahre

Anzahl der Lebendgeburten

keine/1-3/ge4

Alter bei erstem Stillen

nie gestillt/le19/20-29/ge30 Jahre

Anzahl der gestillten Lebendgeburten

keine/1-3/ge4

Mammabiopsie

nein/ja

Mammakarzinom in Familie

nein/ja

Ausbildungszeit (Schule/Universität)

le8/9-10/11-15/ge16 Jahre

Zervixzytologien (Anzahl)

keine/ge1 pro Jahr/zweijährlich/weniger

Das mediane Follow-up für die gesamte Patientengruppe belief sich auf 107 (5-151) Monate. Für lebende Patientinnen umfaßte das mediane Follow-up einen Zeitraum von 117 (48-151) Monaten, für verstorbene Patientinnen betrug die mediane Überlebenszeit 44.5 (5-130) Monate. Die Überlebensanalysen basierten auf dem Zeitraum zwischen beginnender Primärtherapie und dem Tod der Patientin oder dem letzten verzeichneten Kontakt. Zum Zeitpunkt der vorliegenden Analyse waren 162 (34.4%) aller Patientinnen verstorben.

Univariate Überlebensanalysen wurden nach der Kaplan-Meier Methode durchgeführt (Kaplan and Meier 1958) und die Differenzen in den Überlebenskurven unter Verwendung des Logrank-Testes auf Signifikanz geprüft (Peto et al. 1977).

Für die multivariaten Überlebensanalysen wurde das proportionale Hazard-Modell nach Cox verwendet (Cox 1972).

Die primäre Auswahl der Kovariablen erfolgte unter Einschluß aller histomorphologischen (Tumortyp, Grading, Tumorgröße, LK-Status) und zellulär exprimierten (ER, PR, PCNA, EGF-R, c-erbB-2, p53) Prognosefaktoren, des Alters in 5-Jahresgruppen, des Menarchealters, des Menopausenstatus und der Therapiemodalitäten. Sämtliche Variablen, die in dieser Analyse signifikant waren, wurden als Kovariable für alle weiteren multivariaten Überlebensanalysen


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berücksichtigt (Tab. 2.3-4).

Um die Korrelation zwischen Paaren von Einzelfaktoren berücksichtigen zu können, wurden, wenn notwendig, Wechselwirkungsfaktoren in das Modell eingefügt.

Zur Analyse der zeitabhängigen Veränderung der Wertigkeit von Prognosefaktoren wurden die Hazard Ratios (HRs) für die einzelnen Prognosefaktoren in jährlichen Abständen jeweils für das n-te Jahr nach der Diagnose des Mammakarzinoms ermittelt. Nach längerem Follow-up war es für manche Faktoren aufgrund der abnehmenden Fallzahl nicht mehr möglich konsistente Schätzungen durchzuführen. Die Analysen wurden in diesen Fällen nicht weitergeführt.

1.3.2 Methodenkritik

1.3.2.1 Epidemiologische Methodik

Die Rekrutierung der Patientinnen für die vorliegende Studie erfolgte durch die konsekutive Erfassung aller nach 1930 geborenen Frauen, die im Beobachtungszeitraum wegen eines Mammakarzinoms stationär aufgenommenen und primär operiert wurden. Die Therapie erfolgte an einer Einrichtung nach während der Laufzeit der Studie gleichbleibenden Richtlinien. Der Versorgungsbereich der Einrichtung erstreckte sich über die gesamte Region Berlin-Ost/Brandenburg. Selection Bias durch gezielte Zuweisungen können in diesem Zusammenhang weitestgehend ausgeschlossen werden.

Die primäre Erfassung der Daten erfolgte auf der Grundlage eines standardisierten Fragebogens durch geschulte Interviewer zum Zeitpunkt des ersten stationären Aufenthaltes. Von ursprünglich erfaßten 502 Patientinnen, lehnten drei Patientinnen die Teilnahme an der Studie ab. Neun Frauen wurden wegen eines bereits früher diagnostizierten Mammakarzinoms aus der Studie ausgeschlossen. Die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten von Interviewer und Response Bias kann aufgrund dieses Vorgehens als gering angesehen werden.

Im Rahmen der Befragung wurde eine komplette gynäkologisch-geburtshilfliche Anamnese aufgenommen. Darüberhinaus wurden das Kontrazeptionsverhalten und die Einnahme hormoneller Präparate möglichst vollständig erfaßt. Zu diesem Zweck standen den Patientinnen Kalender und visuelles Anschauungsmaterial zu allen im Handel befindlichen Präparaten zur Verfügung. Wesentliche anamnestische Angaben und Daten zur OH-Einnahme wurden durch Rückfragen bei behandelnden Ärzten validiert (Nischan et al. 1993). Auf diese Weise wurden Recall Bias als eine wesentliche Fehlerquelle bei retrospektiver Datenerfassung weitgehend reduziert.

Zum Ausschluß von Confounding Effekten wurde eine möglichst weitreichende Erfassung von Confounding Faktoren (Störvariable) durchgeführt. Dabei handelt es sich um Faktoren, die potentiell sowohl mit der Erkrankung als auch mit der analysierten Einflußgröße assoziiert sind und dadurch bei Nichtberücksichtigung zu Verzerrungen der untersuchten kausalen Zusammenhänge führen. Als klassische Confounder im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Problematik der OH kommen Variablen wie Geschlecht, Alter, sozioökonomischer Status sowie die Menstruations- und Reproduktionsanamnese in Frage (Chilvers and Deacon 1990). Diese Faktoren wurden in den durchgeführten Analysen berücksichtigt. Die Altersstandardisierung erfolgte in

5-Jahresgruppen.

Als weitere Fehlerquelle epidemiologischer Studien wird die Möglichkeit des Auftretens von Surveillance Bias angesehen. Patientinnen, die OH eingenommen haben, befanden sich zumindest über diesen Zeitraum in regelmäßiger ärztlicher Betreuung, was potentiell eine bessere Diagnostik und damit Vorverschiebung des Diagnosezeitpunktes zur Folge haben kann. Eine echte Früherkennung wie sie heute durch die Verbreitung der Mammographie verstärkt erfolgt, war allerdings zum Zeitpunkt der Rekrutierung noch nicht möglich. Die Stadienverteilung in der vorliegenden Studie zeigte keine signifikanten Unterschiede zugunsten der Patientinnen,


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die OH eingenommen hatten, so daß das Vorliegen von Surveillance Bias weitestgehend ausgeschlossen werden kann.

Theoretisch können andere Selektionsmechanismen, die mit der OH-Einnahme verbunden sind, zu weiteren systematischen Fehlern in Studien zu diesem Thema führen (Hemminki 1996). So werden OH zumeist von fertilen Frauen mit aktivem Sexualleben verwendet. Frauen, die niemals OH eingenommen haben, könnten ein von diesen verschiedenes hormonelles Profil aufweisen, was letztlich zur Prägung eines biologisch anderen Tumortyps beitragen könnte. Der Anteil von Frauen ohne Schwangerschaften und auch der ohne Lebendgeburten ist in der vorliegenden Studie allerdings gering und zeigte keine Abhängigkeit von der OH-Einnahme, so daß das Vorliegen derartiger Selektionsmechanismen eher unwahrscheinlich erscheint.

In der Studie entsprechen die Häufigkeitsverteilung der histomorphologischen Faktoren Tumortyp, Tumorgröße, LK-Status und Grading sowie die Expressionsraten aller bestimmten zellulär exprimierten Faktoren ER/PR, PCNA, EGF-R, c-erbB-2 und p53 für die Gesamtgruppe den für representative, statistisch gut abgesicherte Studien erwarteten Häufigkeiten (Lipponen et al. 1992, Pujol et al. 1994, Gasparini et al. 1998). Dieses Ergebnis ist ein weiterer Hinweis darauf, daß Fehler in der Zusammensetzung der Studienpopulation durch mögliche Selektionsmechanismen weitgestgehend ausgeschlossen werden konnten.

1.3.2.2 Histomorphologie und Immunhistochemie

Das histologische Grading ist aufgrund der der Methode innewohnenden subjektiven Komponente am häufigsten Gegenstand fachlicher Diskussionen zur Reproduzierbarkeit histomorphologischer Befunde (Dalton et al. 1994, Kronqvist et al. 1997). In der vorliegenden Untersuchung erfolgte die Klassifikation des histologischen Gradings und des Tumortyps durch den bestätigten Referenzpathologen der WHO-Studie (Stalsberg et al. 1989). Die umfangreiche Erfahrung des pathologischen Referenzzentrums lieferte eine weitgehende Garantie für die Erstellung reproduzierbarer und international vergleichbarer Befunde.

Das immunhistochemische Scoring folgt international einer Vielzahl unterschiedlicher Scoringsysteme, die bis heute die Erstellung gültiger Standards und die Validierung von Prognosefaktoren erschweren. In Anlehnung an die Mehrzahl internationaler Studien zur Validierung immunhistochemisch bestimmter Faktoren wurde das Scoring in der vorliegenden Studie auf der Grundlage der Analyse von mindestens 1000 Zellen durchgeführt. Nach Ermittlung des prozentualen Anteils positiv gefärbter Zellen erfolgte die semiquantitative (ER/PR/PCNA) oder qualitative Klassifikation der Faktoren EGF-R/c-erbB-2/p53) nach intern existierenden Laborstandards. Entsprechend den Anforderungen zur Validierung von Prognosefaktoren waren diese anhand von Pilotserien aufgestellt und später in der Routine an representativen Serien kontrolliert worden (Clark 1994). Auf die Erfassung der Färbungsintensität wurde verzichtet, da deren Berücksichtigung durch Scoring-Indices im Rahmen der Validierung der Methode keine zusätzlichen Informationen erbracht hatte (Schönborn et al. 1995).

Untersuchungen zum Einfluß der Fixation auf die immunhistochemische Reaktivität weisen auf die Gefahr der kontinuierlichen Abnahme der Immunoreaktivität mit zunehmender Fixationsdauer hin (Hall et al. 1990, Fisher et al. 1994). Darüberhinaus kann eine inhomogene Gewebsfixierung des histologischen Materials zur nachfolgenden Beeinträchtigung der Immunoreaktivität im heterogenen Tumorgewebe führen. Diesem Effekt wird ein Teil der hohen Variabilität der Färbungsintensität bei immunhistochemischen Bestimmungen zugeschrieben (Visscher et al. 1992). Unterschiedliche Fixationslösungen können ebenso zu Differenzen in der immunhistochemischen Anfärbbarkeit führen (Fisher et al. 1994). In der vorliegenden Studie wurde das Gewebe über maximal 26 Stunden in 4% Formalin fixiert. Nach publizierten Untersuchungen sind infolge dieses Procederes keine signifikanten Einschränkungen der Immunoreaktivität durch den Verlust und die Maskierung von Liganden zu erwarten. Eine Veränderung der Immunoreaktivität durch die inhomogene Fixierung einzelner Gewebe kann dadurch jedoch nicht gänzlich ausgeschlossen werden.


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Darüberhinaus existieren kontroverse Auffassungen zum denaturierenden Einfluß der Antrocknung von Paraffinschnitten bei höheren Temperaturen und zur Lagerung solcher Präparate (Fisher 1994, Prioleau 1995). Zur Vermeidung von Bestimmungsfehlern durch Denaturierung von Liganden wurden primär verschiedene Präparationsmodalitäten getestet. Es fanden sich keine signifikanten Unterschiede in den erzielten immunhistochemischen Befunden zwischen Präparaten nach Lufttrocknung über 24 h bei Raumtemperatur, nach Trocknung über 2 h bei 37°C und Trocknung über 20 min bei 50°C (Schönborn et al. 1995). Eine langfristige Lagerung von beschichteten Objektträgern zur späteren Durchführung der immunhistochemischen Bestimmungen fand nicht statt.

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