3.  Material und Methoden

3.1. Zelllinien

3.1.1. Pankreaskarzinomzellen

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Die verwendeten Zellen waren humane Pankreaskarzinomzellen, die alle eine Mutation für das p53 Gen aufwiesen. Da das p53 Gen eine zentrale Bedeutung in der Zellzyklusregulation besitzt, war der Mutationsstatus von großer Wichtigkeit. Alle Zelllinien besaßen eine Mutation für das p53 Gen. Verwendet wurden MIAPaCa-2, bezogen von ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA), PaTu8902, PaTu 8988t und PaTu 8988s. Die letzten drei Zelllinien wurden von Dr. P. Elsässer aus dem pathologischen Institut der Universität Marburg zur Verfügung gestellt. Die PaTu 8988t und PaTu 8988s stammen aus demselben Tumor. Die Klone der multiresistenten Zellen EPP85-181P (sensibel), EPP85-181RNOV (mdr-1 Gen negativ) und EPP85-181RDB (mdr-1 Gen positiv) wurden vom Institut für Pathologie der Charitè zur Verfügung gestellt. Die letzten drei Zelllinien sind Klone, die aus einer Zelllinie durch Gentransfer von Resistenzgenen konstruiert wurden. Alle Zellen weisen eine Mutation für das p53 Gen auf. Das verwendete Wachstumsmedium war DMEM (Dulbecco’s modified essential medium) mit Zusatz von 5% hitzeinaktiviertem FBS (Fötales Kälberserum), 5% hitzeinaktiviertes Pferdeserum, 1% Penicillin-Streptomycin, GibcoBRL und 1% L-Glutamin (200 MM, GibcoBRL).

3.1.2. Zellen hepatozellulärer Karzinome

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Vier humane Tumorzelllinien Hep G2, SK-Hep 1, Hep 3B und PLC/PRF/5 wurden verwendet. Bei der Wahl der Zelllinien war der p53 Mutationsstatus von Bedeutung, da p53 ein zentrales Molekül für die Zellzyklusregulation ist und durch 2-ME heraufreguliert werden kann, so daß die erwartete Wachstumshemmung von 2-ME auf diese Zellen möglicherweise p53 abhängig ist. Die ersten beiden Zelllinien exprimieren Wild-Typ p53, die beiden letztgenannten sind mutiert für das p53 Gen. Da die Hep 3B Zellen eine Deletion des p53 Gens besitzen, wird kein p53 Protein gebildet. Alle vier Zelllinien wurden von ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) bezogen. Das verwendete Medium war MEM (“Minimum Essential Amino Acid Medium” with Earle´s Salts, GibcoBRL) mit einem Zusatz von 10% hitzeinaktiviertem FBS (Fötalem Kälberserum), 1% Penicillin-Streptomycin, GibcoBRL, 1% L-Glutamin (200 MM, GibcoBRL), 1% Sodiumpyruvat (100 MM, GibcoBRL) und von 1% nicht essentiellen Aminosäuren, GibcoBRL)

3.1.3. Bronchialkarzinomzellen

Verwendung fanden die H1299 Zellen, die von einem humanen nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom stammen, die eine Mutation mit Deletion für das p53 Gen aufwiesen. Bezogen wurden die Zellen von Dr. Gazdar aus der Abteilung für Thoraxchirurgie der University of Texas, Dallas, Texas, USA. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in RPMI Medium, ergänzt mit 5% hitzeinaktiviertem FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, GibcoBRL, 1% L-Glutamin (200 MM, GibcoBRL), 1% Sodiumpyruvat (100 MM, GibcoBRL) und mit 1% nicht essentiellen Aminosäuren, GibcoBRL). Die Cisplatin-resistenten H1299 Zellen wurden für 10 Monate einer steigenden Dosis Cisplatin ausgesetzt, bis ein Überleben und Proliferation in 2.0mg/ml möglich war. Das verwendete Medium entsprach dem der parentalen H1299 Zellen, jedoch betrug die Konzentration des FBS 10%.

A549 Zellen eines humanen nicht kleinzelligen Bronchialkarzinoms exprimierten den Wild-Typ des p53 Gens. Sie wurden von ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD USA) bezogen. Das verwendete Medium war F12 Medium mit Zusatz von 10% hitzeinaktiviertem FBS und 1% Penicillin-Streptomycin, GibcoBRL.

3.1.4. Normale humane Hepatozyten

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Die Hepatozytenkulturen wurden durch Perfusion eines Leberresektates, meist bei Metastasenresektion, unter sterilen Bedingungen mit einer enzymatischen Lösung mit DNase und Kollagenase (Strom et al. 1993) gewonnen. Man konnte sie ca. 10 Tage in Kultur halten. Das verwendete Medium war Williams Medium E mit Zusatz von 10% FBS, 1% L-Glutamin (200 MM, GibcoBRL), 1% Sodiumpyruvat (100 MM, GibcoBRL) und von 1% nicht essentiellen Aminosäuren, GibcoBRL). Die Hepatozyten dienten als Kontrollzellen bei einem Großteil der Experimente.

3.2. Kultur und Proliferationsanalysen

3.2.1. Tumorzellen

Die Tumorzellen wurden als subkonfluente adhärente Monolayerkulturen in einem Heraeus-Brutschrank bei 37°C, 5% CO2, und 95% O2 in 75 cm2 Zellkulturflaschen (Falcon) gehalten. Einmal wöchentlich wurden die Zellen passagiert: Die enzymatische Ablösung der Zellen vom Flaschengrund erfolgte durch kurze Inkubation im Brutschrank mit 0,25% Trypsin (GibcoBRL). Zum Passagieren oder Aussetzen der Zellen in einem Experiment wurden sie mittels einer Zählkammer nach Neubauer unter einem Durchlichtmikroskop von Olympus gezählt und in der gewünschten Anzahl kultiviert. Nach Zellzählung wurden die Zellen in einer 24-well-Platte (Falcon) mit 2 X 104 Zellen und 1 ml Medium pro well ausgesetzt. Gleich nach Aussaat der Zellen in die Kulturschalen wurden bei je zwei Schalen der Kontrollgruppe und der Testgruppen Zellzahlbestimmungen zur Überprüfung der Korrektheit der angenommenen Zelldichte durchgeführt. Die Platte wurde 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Bestimmung der nach 48 Stunden angewachsenen Zellen erfolgte durch Auszählen mittels eines Phasenkontrastmikroskops von Zeiss (Axiovert 135) von jeweils vier Einheiten aus der Kontrollgruppe bzw. aus den Therapiegruppen. Daraus läßt sich die Anzahl der nach der Aussaat tatsächlich angewachsenen Zellen, d.h. die “plating efficiency” bestimmen. Danach wurden die 12 wells in vier Behandlungsgruppen eingeteilt, so daß jeweils drei wells einer Gruppe zugeordnet waren. Die erste Gruppe diente zur Kontrolle und wurde nur mit Medium behandelt, zur Behandlung der zweiten Gruppe wurde ein unwirksamer Östrogenmetabolit als Kontrollöstrogen MEC (16ß-Hydroxy–17ß-estradiol ) mit einer Konzentration von 2µM benutzt, die Zellen der dritten bzw. vierten Behandlungsgruppe wurden mit dem Östrogenmetaboliten 2-ME (2-Methoxyestradiol) in verschiedenen Konzentrationen von 0,5µM bzw. 5,0µM versetzt. Es erfolgte eine 24-stündige Inkubation im Brutschrank. Die Auszählung fand regelmäßig in 48-stündigen Abständen an den Tagen 1, 3 und 5 statt. Die Zellzählung erfolgte mittels Zählkammer nach Neubauer. Die Zählungen wurden jeweils zweimal durch zwei unabhängige Personen blind durchgeführt und aus den beiden Werten der Mittelwert gebildet. Insgesamt wurde diese Zellzahlbestimmung für jede Zelllinie dreimal wiederholt und von den drei Werten der Mittelwert berechnet.

3.2.2. Humane Hepatozyten

Zur Einschätzung der Toxizität von 2-Methoxyestrdiol auf humanes Lebergewebe wurden frische humane Hepatozyten verwendet. Eine 6-well Platte (Falcon) wurde mit einem Collagen-Precoat überzogen. Dazu wurden 3ml einer Lösung von 2%igem Collagen (aus Rattenschwänzen, Sigma) in PBS in jedes Well gegeben, diese bei Raumtemperatur 30 min. inkubiert und dann die Flüssigkeit entfernt. Die Anzahl der Hepatozyten wurde ausgezählt und pro well 1 X 106 Zellen hineingegeben. Nach 48stündiger Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurden die Zellen behandelt. Dabei wurden die Wells zufällig bestimmten Behandlungsgruppen zugeordnet. Die Behandlungsgruppen bestanden aus einer nur mit Medium behandelten Kontrollgruppe, einer mit MEC 5µM, einer mit 2-Me 2,5µM, einer mit 2-Me 5µM und einer mit 2-Me 10µM behandelten Gruppe. Nach Behandlung wurden die Zellen wiederum 48 Stunden im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Die morphologische Beurteilung auf möglicherweise toxisch bedingte Zellveränderungen erfolgte blind durch drei unabhängige Untersucher unter einem Phasenkontrastmikroskop. Eine Zellzählung wurde nicht durchgeführt, da diese Zellen in vitro keine Proliferationstendenz haben.

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Zur weiteren Untersuchung einer möglichen Zellschädigung wurde zentrifugierter zellfreier Überstand gewonnen und zunächst bei einer Temperatur von -20°C eingefroren.

3.3. Therapeutische Substanzen

Das Wild-Typ p53 exprimierende Adenovirus sowie das als Kontrolle verwendete Lac-Z exprimierende Adenovirus, welches die Beta-Galactosidase codiert, wurden in der Abteilung für Thoracic and Cardiovascular Surgery unter der Leitung von Dr. Jack A. Roth im MD Anderson Cancer Center in Houston, Texas, USA konstruiert. Die Behandlung der Zellen und der Tiere erfolgte in einem S-2 Laborbereich nach den ortsüblichen Richtlinien.

2-Methoxyestradiol wurde von der Firma Steraloids, Newport, RI, USA bezogen. Das Kontrollöstrogen 16-Epiestriol stammt von der Firma Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland. Alle verwendeten Zytostatika wurden von der Apotheke der Charité bezogen.

3.4. Western Blot Analysen:

3.4.1. Aussaat der Zellen, Behandlung und Herstellung des Zelllysats

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Zur Bestimmung der Proteinmenge apoptosebezogener Proteine wurden folgende Untersuchungen durchgeführt. Nach Zellzählung wurden die Zellen aller Zelllinien in 10 cm Petrischalen (Falcon) in einer Dichte von 1 X 106 Zellen in 10 ml Medium pro Schale ausgesetzt. Die Behandlung der Zellen erfolgte analog zu den Proliferationsanalysen zwei Tage nach Aufsetzen der Zellen. Unterschiedlich war nur, daß hier zwei verschiedene Dosen 2-ME benutzt wurden, die in den Proliferationsanalysen eine ca. 50%ige Wachstumshemmung bewirkten. Die Hep 3B, Hep G2 und PLC/PRF/5 Zellen wurden mit PBS, 5µM MEC, 2,5µM 2-ME oder 5,0µM 2-ME inkubiert. Die SK-Hep 1 Zellen hingegen wurden mit PBS, 3µM MEC, 1,5µM 2-ME oder 3,0µM 2-ME inkubiert. Als Negativkontrolle für p53 diente die Zelllinie Hep 3B, die eine Deletion des p53 Gens aufweist und somit kein p53 Protein bilden kann. Als Positivkontrolle dienten die PLC/PRF/5 Zellen, die ein mutiertes p53 exprimieren, welches unkontrolliert viel nicht funktionelles p53 Protein bildet.

Die Schalen wurden nach der Behandlung für weitere 48 Stunden im Brutschrank inkubiert. Zum Ernten der Zellen wurden die Schalen nach Absaugen des Mediums mit 300µl denaturierendem Laemmli – Puffer (25 ml 0,5M Tris pH 6.8 (Sigma), 10 ml 20% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate, Pharmacia), 10 ml Glycerol (Merck), 50µl 10% Bromophenol Blue (Aldrich)) versetzt und 10 Minuten auf Eis zur Zelllyse stehengelassen. Nach eingetretener Zelllyse wurde das Lysat mit einem Disposable Cell Scraper (CostarCorporation) vom Grund der Platte abgelöst und in Eppendorf-Hütchen (1,5ml) pipettiert und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C eingefroren.

3.4.2. Messung der Proteinkonzentration

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben wurden eine Proteinstandardlösung (aus bovine Albumin, Sigma) mit einer Konzentration von 2 mg/ml, BCA Protein Assay Reagent A (Pierce) und B (Pierce) verwendet. Die Proteinstandardlösung wurde 1:1 mit Aqua B. Braun (Ecotainer®, Braun) verdünnt, um eine Anfangskonzentration von 1 mg/ml zu erhalten. Zur Erstellung einer Verdünnungsreihe wurden die Proben 2:1 mit Aqua dest verdünnt, um folgende Proteinkonzentrationen zu erhalten: 1 und 2: Leerwert (nur Aqua. dest.), 3 und 4: Prot.-Konz.: 62,5 µg/ml, 5 und 6: Prot.-Konz.: 125 µg/ml, 7 und 8: Prot.-Konz.: 250 µg/ml, 9 und 10: Prot.-Konz.: 500 µg/ml, 11 und 12: Prot.-Konz.: 1000 µg/ml. Diese Verdünnungsreihe wurde zunächst in Mikroröhrchen angesetzt und dann jeweils 20µl davon in die entsprechenden 12 wells der ersten Reihe einer Microtiterplatte (GreinerLabortechnik) pipettiert. Die zu messenden Proben wurden auf Eis aufgetaut und 2 min. bei 1500 U/min. und 4°C zentrifugiert, um einen Überstand ohne Zellreste zu gewinnen. Von diesem Überstand wurden 10µl jeder Probe mit 30µl Aqua dest. verdünnt (1:4), um die Proteinkonzentration der Proben in einen für die spätere photometrische Messung optimalen Bereich zu senken. Nach kurzem vortexen (MS1, Minishaker von IKA®) wurden dem Gemisch 20µl Probe entnommen und in ein well der Microtiterplatte gefüllt, beginnend in der zweiten horizontalen Reihe. Die Reagenzien A und B wurden im Verhältnis 50:1 gemischt und zu der Verdünnungsreihe sowie jeder Probe 300µl des Gemisches aus Reagenz A und B pipettiert. Die Microtiterplatte wurde 30 Minuten bei 37°C zur Bildung der Farbkomplexe inkubiert. Die photometrische Messung wurde mit einem Filter von 550 nm durchgeführt (Photometer von Anthos ht II), wobei die Messung nach vorherigem einmaligen Schütteln der Microtiterplatte erfolgte. Die errechneten Proteinkonzentrationen der Proben mit der Einheit µg/µl wurden aufgrund der Verdünnung mit dem Faktor 4 multipliziert. Waren einige Proteinkonzentrationen größer als der durch die Standardkurve abgedeckte Bereich des Photometers, wurde die Messung mit einer stärkeren Verdünnung der jeweiligen Proben (z.B. 1:6) wiederholt. Lagen alle Proteinkonzentrationen in einem für das Photometer meßbaren Bereich wurde 5% Mercaptoethanol (Sigma) zu jeder Probe dazugegeben, um die Disulfidbrücken zu spalten.

3.4.3. Gelelektrophorese und Proteintransfer

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In einem “Gel Caster” (Amersham Pharmacia Biotech) wurde ein 12,5%iges SDS-Polyacrylamid-Gel (6,9 ml ddH2O, 3,75 ml 1,5M Tris pH 8,8, 150 µl SDS 10% , 4,1 ml Acrylamid 30% & 0,8% Bisacrylamid (Rotiphorese Gel 30, 3029, Roth), 75 µl APS 10% (Ammoniumperoxydisulfate,A-6761, Sigma), 8 µl TEMED (Sigma) und mit 1-Butanol (Merck) überschichtet, um eine gerade Geloberfläche zu erhalten. Mit einem 12,5% Acrylamid-Gel läßt sich am besten eine Proteingröße in der Spanne 10-70 kDa nachweisen, welche in diesem Experiment alle zu detektierenden Proteine bzw. deren Molekulargewichte umfaßt. Nach einer ¾ Stunde war das Gel ausreichend polymerisiert, so daß das Butanol abgegossen und die Reste mit Aqua dest. ausgewaschen werden konnten. Der “Gel Caster” wurde mit einem 4%igen SDS-Polyacrylamid-Gel (6,2 ml ddH2O, 2,5 ml 0,5M Tris pH 6,8, 100µl SDS 10 %, 1,3 ml Acrylamid 30 %, 50 µl APS 10 %, 5 µl TEMED) aufgefüllt und je ein Kamm mit 10 Zinken in das Gel gesteckt. Während einer weiteren ¾ Stunde, in der das Gel polymerisierte, wurden die Proben auf Eis aufgetaut und für die Elektrophorese vorbereitet. Die Proben, eine Positiv- und eine Negativkontrolle für das Tumorsuppressorgen p53 sowie ein Marker (RainbowTM, RPN 756, Amersham Life Science) mit einer high molecular weight range (143000 – 220000) wurden in Mikroröhrchen jeweils so mit einem „Loading-Buffer“ zum Laden und zur Anfärbung (aus 20 ml ddH2O, 12,5 ml 0,5M Tris pH 6,8, 10 ml 10% SDS, 2,5 ml 2-Mercaptoethanol, 5 ml Glycerol, 50 µl Bromophenol Blue) gemischt, daß jede Probe die gleiche Menge Protein enthielt. Dabei wurden je nach Proteinkonzentration in der Probe 30-100 µg Protein pro Probe (8µl Marker) benutzt. Dieses Gemisch wurde in die Geltaschen gegeben, wobei die erste Tasche den Marker enthielt, die nächsten Taschen Zelllysate der verschiedenen Behandlungsgruppen. Die letzten Taschen schließlich enthielten eine Negativ- und eine Positivkontrolle für p53. Während der 1½-stündigen Gelelektrophorese (in einem “Mighty Small II von Pharmacia biotech) bei 100V und 4mA wurden die Proteine im Gel aufgetrennt (in einem Puffer aus 6 g Tris, 28,8 g Glycin, Merck, 2 g SDS mit Aqua dest. auf 2 Liter aufgefüllt). In einer Transferkammer (TE 22 Mighty Small Transpher Tank Transfer Unit, Amersham Pharmacia Biotech), mit einem Puffer aus 6,05 g Tris, 28,9 g Glycin, 400 ml Methanol (Merck) mit Aqua dest. auf 2 Liter gefüllt, wurden die Proteine bei 100 V und 400 mA über eine ¾ Stunde auf eine Nitrozellulosemembran (Amersham Life Science) übertragen. Die proteinbeladenen Nitrozellulosemembranen wurden in einer Lösung aus Ca2+- und Mg2+-freiem PBS mit 1/1000 Tween® 20 (Aldrich) bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt.

3.4.4. Sichtbarmachung der Proteinbanden

Zur Sichtbarmachung der auf der Membran gebundenen Proteine wurde die Nitrozellulosemembran mit einem für das jeweils zu untersuchende Protein spezifischen Antikörper inkubiert. Dieser konnte sich an das entsprechende Protein anlagern und ein zweiter Antikörper, beladen mit einem photosensiblen Endstück lagerte sich während einer weiteren Inkubation an den ersten Antikörper an. Das photosensible Endstück konnte nun mittels einer chemischen Reaktion aktiviert und auf einem Röntgenfilm dargestellt werden. Die so ermittelten Proteinbanden gaben Aufschluss über das Vorhandensein und die Konzentration verschiedener Proteine.

Während der Inkubation mit den Antikörpern wurden die Nitrozellulosemembranen in einer Lösung aus 1x PBS mit 5% Trockenmilch (Hipp) und 1/1000 Tween® 20 auf dem Shaker (Promax 2020 von Heidolph) mit einer Geschwindigkeit von 125/min bewegt. Zunächst wurden die Membranen gründlich gespült und die Bildung unspezifischer Bindungen an die Proteine auf der Membran verhindert. Ein Wechsel der Lösung erfolgte nach 15 min., nach 5 min. und nach weiteren 5 min.. Eine 1%ige Trockenmilchlösung in PBS wurde hergestellt und der primäre Antikörper gegen ein bestimmtes nachzuweisendes Protein auf der Membran in einer Verdünnung von 1: 50 bis 1:500 je nach Antikörper hinzugegeben. Als primäre Antikörper wurden p53 (p53 Ab-3 [BP53-12], Mouse Mab, IgG2a, Cat.-Nr. MS-159-P von NeoMarkers) in einer Verdünnung von 1:500, p21WAF1 (Ab-1, monoclonal Mouse IgG, Cat.-Nr. OP64-100 UG von Oncogene Research Products Calbiochem®) in einer Verdünnung von 1:300, bcl-2 (purified Mouse Anti-Human IgG1, Cat.-Nr. 65111A von PharMingen) in der Verdünnung 1:300 und ß-Actin (monoclonal anti-ß-Actin, Mouse Ascites Fluid IgG1, Cat.-Nr. A5441 von Sigma) in der Verdünnung 1:700 verwendet. Dieser Antikörper in Lösung wurde nach Abgießen der 5%igen Milchlösung auf die Membranen gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur und 130 Shakes/min. inkubiert. Die Membranen wurden wiederum in der 5%igen Trockenmilchlösung gespült, mit einem Wechsel der Lösung nach 15 min., 5 min. und 5 min.. Als sekundärer Antikörper wurde HRP-konjugierter Antikörper (ImmunoPure®, anti-goat, mouse IgG, (H+L), Cat.-Nr. 31430 von Pierce) benutzt, der in 2 ml Aqua dest. gelöst wurde und so eine Konzentration von 0,8 mg/ml enthielt. Dieser wurde in einer Verdünnung von 1:5.000 verwendet. Auch der sekundäre Antikörper wurde in eine 1%ige Trockenmilchlösung in PBS gegeben und mit den Membranen eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Shaker mit 130/min. inkubiert. Nach Entfernung des sekundären Antikörpers wurden die Membranen wiederum mit einer 5%igen Milchlösung dreimal jeweils eine Viertelstunde gespült, um eine unspezifische Bindung überschüssigen Antikörpers zu verhindern. Die Lagerung sowohl der primären als auch der sekundären Antikörper erfolgte im Kühlschrank bei 4°C..

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Zur späteren Detektion auf einem Röntgenfilm wurden jeweils 5 ml beider Lösungen aus dem ECL-Kit (ECLTM Western blotting analysis system, Cat.-Nr. RPN 2108 von Amersham Pharmacia Biotech) gemischt, die nach einer Minute im Dunkeln polymerisieren und die Membranen nacheinander für jeweils eine Minute im Dunkeln zum Ablauf einer chemischen Reaktion in dieses Gemisch gelegt. Im alkalischen Milieu katalysiert die auf dem sekundären Antikörper gebundenen horse radish peroxidase die Oxidation von in den Lösungen enthaltenem Luminol. Dieses gelangt dadurch in einem angeregten Zustand und sendet Licht der Wellenlänge 428 nm aus.

Anschließend wurden die Membranen mit einem Papiertuch getrocknet und einzeln in Klarsichtfolie (Haft-Folie der Bartling-Werke) verpackt in eine Filmkassette gelegt. In der Dunkelkammer wurde ein für diese Lichtemission sensibler Film (Biomax ML 18x24 cm, Cat.-Nr. 819 4540 von Kodak) in die Kassette eingelegt und mit einer Belichtungszeit von 2 min. begonnen. Nach Entwicklung dieses Films in einem Filmentwickler (45 compact, PROTEC, Processor-Technology) wurde die weitere Belichtungszeit, falls nötig, nach der Stärke des Signals auf dem Film variiert. Die Belichtungszeiten richteten sich zum einen nach der Menge des geladenen Proteins, zum anderen aber auch danach, welcher primäre Antikörper verwendet wurde. So variierten sie von wenigen Sekunden (z.B. für die Anfärbung durch ß-Actin) bis zu einer Dreiviertelstunde (z.B. bei Verwendung von p21 als primären Antikörper).

Auf die Filme wurden die Markierungsbanden für die Proteingewichte von 220 kDa, 97,4 kDa, 66 kDa, 46kDa, 30kDa, 21,5 kDa und 14,3 kDa von der jeweiligen Membran übertragen. So konnte das Proteingewicht, das den Proteinbanden auf dem Film zugrunde liegt in seiner Größenordnung eingeordnet und auf seine Richtigkeit überprüft werden.

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Alle Western Blot Untersuchungen wurden mindestens dreimal wiederholt und bestätigt.

3.5. AST-Messung:

Zur Einschätzung des Ausmaßes der Zellschädigung in den Behandlungsgruppen wurde das zelleigene Enzym Aspartataminotransferase (AST) mittels eines Test Kits von Sigma photometrisch bestimmt. Zur Erstellung einer Standardreihe wurde eine Multienzymsubstanz von Sigma verwendet. Alle Reagenzien sowohl ungelöst als auch gelöst wurden im Kühlschrank bei 4°C aufbewahrt.

Zunächst wurden die Reagenzien zur AST-Bestimmung vorbereitet; Reagenz A wurde in 10 ml Aqua dest., Reagenz B in 16 ml Aqua dest. und die Multienzyme in 3 ml Aqua dest. (entspricht 1130 U/l) gelöst. Zu Reagenz A wurden 0,8 ml Reagenz B gegeben und gevortext. Aus der Multienzymlösung wurde eine Standardreihe erstellt, indem für den Standard mit der höchsten Konzentration (141,25 U/l) die Multienzymlösung 1:8 mit 0,9%iger NaCl-Lösung verdünnt wurde. Weitere 6 Standards wurden in einer Verdünnungsreihe mit sich jeweils halbierender Konzentration in der Verdünnung 1:2 mit 0,9%iger NaCl-Lösung erstellt.

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Die Belegung der Microtiterplatte erfolgte mit jeweils 50µl 0,9%iger NaCl-Lösung als Leerwert an den ersten beiden Positionen, dann folgten je 50 µl der Standards jeweils doppelt nebeneinander in den ersten beiden Wells der jeweiligen Reihe und insgesamt in aufsteigender Konzentration vertikal untereinander in den ersten beiden senkrechten Reihen angeordnet.

Die Proben der zentrifugierten Zellüberstände wurden nun auf Eis aufgetaut und je 50µl jeder Probe in die Wells gegeben, an Position 3 der ersten Reihe beginnend.

Da es sich bei der Enzymbestimmung um eine kinetische Messung handelt, wurden die 200µl pro well des A/B-Gemisches mittels einer Multichannelpipette (Eppendorf) möglichst zügig auf die Standards und Proben gegeben. Die photometrische Messung wurde mit einem Filter von 340nm durchgeführt, wobei die erste Messung nach einer Wartezeit von 30s zum Ausgleich unterschiedlicher Reaktionszeiten in den einzelnen wells und die zweite Messung nach 10 min. erfolgte. Die Enzymkonzentrationen wurden in U/l angegeben. Auch diese Untersuchungen wurden dreimal widerholt und ergaben jeweils dasselbe Resultat.

3.6. Apoptosenachweis mittels Fluoreszenzfarbstoff

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Die Zellen aller Karzinom-Zelllinien wurden in einer Dichte von 1 X 104 pro Kammerin Chamber Slides (NUNC) im entsprechenden Medium ausgesetzt. Nach drei Tagen folgte analog zu den Western-Blot-Analysen die Behandlung der Zellen. Nach zweitägiger Behandlungszeit wurden im Phasenkontrastmikroskop an zufällig ausgewählten Stellen Nativaufnahmen der Zellen der verschiedenen Behandlungsgruppen mit einer Vergrößerung von 32x und einer Verschlußzeit von ½ bzw. einer Sekunde angefertigt.

Zum Fixieren der Zellen wurde das Medium vorsichtig abgesaugt, um vorhandene apoptotische Zellen nicht abzulösen, die Zellen vorsichtig zweimal in 1x PBS gewaschen und mit 4%igem Paraformaldehyd (aus 95% Paraformaldehyd (Aldrich) bedeckt. Nach einer Fixationszeit über Nacht bei 4°C wurde das Paraformaldehyd abgesaugt und die Zellen erneut zweimal mit 1x PBS gewaschen.

Zur Anfärbung der Zellen wurde der Hoechst-Farbstoff B-2261 (Hoechst-Nr. 33342, Cat.-Nr. B-2261 von Sigma) benutzt. Zur Erstellung der Färbelösung wurde der Farbstoff 1:100 mit 0,1x PBS verdünnt, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu erreichen. Für die 8 Kammern eines Chamber Slides wurden 25µl dieser Lösung benötigt, dazu wurden 75µl 0,1 X PBS gegeben, das Gemisch gevortext und 400µl Glycerol hinzugefügt. Nach guter Durchmischung wurde von diesen 500µl Färbelösung 60µl in jede Kammer gegeben, um die Zellen gleichmäßig zu bedecken. Die so behandelten Chamber Slides wurden im Dunkeln und bei Raumtemperatur für 15 min. inkubiert. Anschließend wurde der Farbstoff abgesaugt und zweimal mit 1 X PBS gewaschen, um überschüssige Farbstoffreste zu entfernen. Nach möglichst vollständiger Entfernung des PBS aus allen Kammern wurden die Kammeraufsätze der Chamber Slides von dem darunter liegenden Objektträger abgehoben. Zur Konservierung wurde Medium aus 80% Glycerin, 20% 1x PBS und einer Spatelspitze Natriumacid reinst (Merck) auf den Objektträger aufgetragen und mit einem Deckglas abgedeckt. Gelagert wurden diese Objektträger lichtgeschützt bei -20°C.

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Die vier zweifach vorhandenen Behandlungsgruppen auf einem Objektträger wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) mit einem DAPI-Filter betrachtet. Von den Zellen jeder Behandlungsgruppe wurden an mehreren zufällig gewählten Stellen Aufnahmen gemacht, um die angefärbten Kerne gesunder wie auch apoptotischer Zellen darstellen und fotografieren zu können. Gezählt wurden geblindet mindestens 500 Zellen pro Behandlungsgruppe von zwei unabhängigen Untersuchern. Der prozentuale Anteil der apoptotischen Zellen wurde ausgerechnet und graphisch dargestellt. Bei der Zellzählung der gesunden sowie der apoptotisch veränderten Zellen wurden sie getrennt nach “gesund” und “apoptotisch” gezählt, wobei als Apoptose jede sichtbare Kernveränderung von beginnender Einfurchung und Abschnürung von Kernfragmenten bis hin zu einer vollständigen Auflösung des Kerns in Bruchstücke gewertet wurde. Die Bildverarbeitung erfolgte mit dem Bildverarbeitungsprogramm „ISIS“. Dieses Experiment wurde insgesamt dreimal wiederholt.

3.7. Immuncytologischer Apoptosenachweis

Die Aussaat der Zellen der Tumor-Zelllinien sowie frischer humaner Hepatozyten erfolgte in Chamber Slides wie für die Fluoreszenzfärbung beschrieben. Das Medium wurde vorsichtig aus den Kammern entfernt ohne die Zellen vom Grund zu lösen und eventuelle Rückstände durch Waschen mit 1x PBS beseitigt. Durch Zugabe von gepuffertem 6% Formaldehyd (J.T. Baker) mit pH 7,4 wurden die Zellen über Nacht bei 4°C fixiert. Dann das Formaldehyd entfernt und gründlich mit 1 X PBS (pH-Wert 7,4) ausgespült. Nach vollständigem Absaugen des PBS wurden die Chamber Slides bei Raumtemperatur getrocknet und konnten so bis zur Färbung gelagert werden.

3.7.1. Immunfluoreszenz-Färbungen:

Zum Nachweis einer Induktion von Apoptose wurden verschiedene Färbetechniken angewandt und mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie betrachtet. Zunächst wurden die Chamber Slides mit 70%igem Ethanol eine Stunde permeabilisiert, dann eine unspezifische Bindung durch Waschen mit TNB-Puffer (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% bovine serum albumin, 0,5% sodium-azide (Amersham), pH 7,5) verhindert. Dann wurden einige Zellen mit dem ersten Antikörper anti-Apo-2.7 (Verdünnung 1/10 in TNB-Puffer, von Immunotech Marseille) eine Stunde bei 22°C inkubiert. Es erfolgten fünf Waschvorgänge und eine einstündige Inkubation mit dem zweiten Antikörper, HRP-konjugierten rabbit anti-mouse-IgG (Verdünnung 1/50 in TNB-Puffer, von DAKO, Hamburg). Nach fünf weiteren Waschzyklen wurde Tyramide Signal Amplification (TSA-Indirect NEMTM, Verdünnung 1/40 von Life Science Products, Boston) für 15 min. hinzugegeben. Es folgten fünf Waschvorgänge und eine einstündige Inkubation mit fluorescein-konjugiertem Streptavidin (Verdünnung 1/50 in TNB-Puffer, DAKO, Hamburg). Zum Schluß wurden die Nuclei mit Propidiumjodid (Sigma; 100 µg/ml PBS) bei Raumtemperatur im Dunkeln gegengefärbt und die Zellen mit PBS gewaschen sowie anschließend mit ddH2O gespült.

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Ein anderer Teil der Zellen wurde nach der Blockierung unspezifischer Bindungen eine Stunde mit biotinyliertem Annexin V (Hölzel Diagnostika, Köln) mit einer Verdünnung von 1/10 in TBS (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 40, pH 7,5) inkubiert. Dann wurden sie dreifach mit TNT ( 100 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 40, pH 7,5) gewaschen und eine weitere Stunde mit Streptavidin-PE (Verdünnung 1/100 in TNB mit 2 mM CaCl2, von Immunotech, Marseille) inkubiert. Nach drei weiteren Waschzyklen mit TNT-Puffer (mit CaCl2) wurden die Nuclei mit Bisbenzimid (Hoechst 33258, Sigma, München) gegengefärbt.

Ein dritter Teil der Zellen wurde mit dem „TUNEL-Reaktionskit“ APO-DIRECTTM (Pharmingen, San Diego) angefärbt. Zunächst wurden die Zellen zwei Stunden mit 70%igem Ethanol permeabilisiert und zweifach mit PBS gewaschen. Dann wurde 50,75 µl TUNEL-Reagenz (10µl TdT-Reagenz, 0,75 µl TdT Enzym, 8µl FITC-dUTP, 32 µl ddH2O) auf die Monolayer gegeben und drei Stunden bei 37°C im Brutschrank und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Zellen zweimal mit PBS und zweifach mit dem im APO-DIRECTTM-Kitenthaltenen Puffer gewaschen. Abschließend erfolgte eine Gegenfärbung der Nuclei mit Propidiumjodid bei Raumtemperatur im Dunkeln und ein weiterer Waschvorgang mit PBS sowie eine Spülung mit ddH2O.

Nach dem Trocknen der angefärbten Zellen wurden sie unter einem Fluoreszenz Mikroskop (C. Zeiss, Oberkochen, Deutschland, ausgestattet mit Epilumination) beobachtet und fotografiert. Die unterschiedlichen Anfärbungen zeigten verschiedene Fluoreszenzen: Apo2.7 emittierte gelb-grünes Licht, eine Bindung an Annexin zeigte sich durch rotes Licht und bei der TUNEL-Reaktion wurde eine gelbe Fluoreszenz sichtbar. Um die Intensitäten der verschiedenen Färbungen untereinander vergleichen zu können, wurden in jedem Apoptose-Test die angefärbten Zellen mit der gleichen Dauer unter dem Mikroskop betrachtet.

↓27

Zur TUNEL-Färbung der Pankreaskarzinomzellen MIAPaCa-2, PaTu 8902, PaTu 8988t und PaTu 8988s wurden die Zellen ebenfalls in Chamber slides in einer Dichte von 1 X 105 aufgesetzt. Nach zweitägiger Behandlung mit 1,5µM 2-ME (MIAPaCa-2), 2,0µM 2-ME (PaTu 8902 und PaTu 8988t) und 10µM 2-ME (PaTu 8988s) wurden die Zellen mit Ethanol und Aceton im Verhältnis 1:1 für 20 min. bei –20°C fixiert. Danach wurde die endogene Peroxidase mit 3% H2O2 enthaltendem Methanol für 15 min. bei Raumtemperatur blockiert. Die Proben wurden mit 0,1% Triton X-100 und 0,1% Natriumzitrat für 2 min. bei 4°C inkubiert. Als positive Kontrolle diente eine Vorbehandlung mit o,25 IE/L DNase I für 20 min. Es folgte die Inkubation der Kontrollen und der behandelten Zellen mit TdT Puffer [30mM Tris (pH 7,2), 140mM Natriumcacodylat und 1mM Kobaltchlorid]. Bedeckt wurden die Zellen mit 100IE/ml TdT (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, USA) und 0,2nM biotinyliertem 16-dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) für 2 Stunden bei 37°C. Die Reaktion wurde mit einer Inkubation in Transfer-Puffer (300mM Natriumchlorid und 30mM Natriumzitrat) für 30 min. bei Raumtemperatur beendet. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Proben mit 2% BSA für 10 min. bei Raumtemperatur behandelt. Danach folgte die Inkubation mit 1:10 peroxidasekonjugiertem Strepdavidin (Dako Corp., Carpinteria, CA, USA) für 30 min. bei Raumtemperatur, eine weitere Waschung mit PBS und eine Färbung mit Diaminobenzidin für 2 min. bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden mit Harris Hämatoxilin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) gegengefärbt. Braune Zellen wurden als apoptotisch angesehen. Eine Mindestzahl von 500 Zellen pro Behandlungsgruppe wurden ausgezählt und die mittlere Anzahl der apoptotischen Zellen errechnet. Analog dazu erfolgte die Färbung der Mauslebern nach Leberresektion. Der einzige Unterschied war eine zuvor notwendige Deparaffinisierung der Schnitte. Die Ergebnisse stammen aus Versuchen, die dreimal wiederholt wurden.

3.8. Zellzyklusanalysen

Um eine Aussage über die Zellverteilung in den verschiedenen Zellzyklusphasen zu erhalten, wurden Zellzyklusanalysen durchgeführt, denn 2-ME beeinflußt den Zellzyklus auf unterschiedliche Weise unter anderem durch eine Stabilisierung des p53 Proteins. Auch der Nachweis apoptotischer Zellen mit Quantifizierung ist möglich.

Die Zellen wurden mittels einer Zählkammer nach Neubauer ausgezählt und in 6 cm-Petrischalen (Falcon) in einer Dichte von 5 X 105 pro Platte ausgesetzt. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit PBS, MEC oder 2-ME behandelt. Die Dosis 2-ME richtete sich nach den Ergebnissen der Proliferationsanalysen. Die Dosis, die eine Wachstumshemmung von 50% bewirkte (IC50), wurde verwendet. Somit erhielten die Zelllinien Hep 3B, Hep G2 und PLC/PRF/5 eine Dosis von 5µM Kontrollöstrogen 16ß-Hydroxy–17ß-estradiol, sowie 2,5µM und 5,0µM 2-ME. Die etwas sensiblere Zelllinie SK-Hep 1 wurde mit PBS, 3µM MEC, 1,5µM 2-ME oder 3,0µM 2-ME behandelt. Bei den Pankreaskarzinomzellen betrug die Dosis 1,5µM MEC oder 2-ME für MIAPaCa-2 Zellen, 2,0µM MEC oder 2-ME für PaTu 8902 und PaTu 8988t und 10µM MEC oder 2-ME für PaTu 8988s Zellen. Die Platten wurden für weitere 48 bzw. 72 Stunden im Brutschrank inkubiert.

↓28

Zunächst wurden die Zellen mit PBS gewaschen, dann erfolgte die Ernte enzymatisch mit 0,25% Trypsin. Die Zellen sollten durch die Manipulation nicht beschädigt werden. Nach Ablösung der Zellen wurden sie wiederum zweimal mit PBS gewaschen. Dann erfolgte die Fixierung der Zellen für 60 min. in 70%igem Ethanol bei 4° C. Nach einem Waschvorgang mit PBS erhielten die Zellen 10µg/ml RNase (Typ 1-A von Sigma, zuvor bis 100°C erhitzt, um DNase zu inaktivieren). Danach wurden sie resuspendiert und 15 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde eine PBS-Lösung mit 50µg/ml von dem DNA-spezifischen Fluorochrom Propidiumjodid hinzugegeben und die Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und bis zur Messung in Dunkelheit aufbewahrt.

Propidiumjodid gehört zu der Klasse der interkalierenden Fluorochrome, die sich periodisch zwischen die Basenpaare der DNA einfügen. Da sie sich auch in Doppelsträngige RNA einlagern ist eine vorherige Behandlung mit RNase notwendig.

Gesunde somatische Zellen machen einen Zellzyklus bestehend aus G1-, S-, G2- und M-Phase durch (Abbildung 2). Nach der Mitose folgt die G1-Phase, eine Wachstumsphase, aber ohne Synthese von Chromatin. Diese erfolgt in der Synthesephase, der S-Phase, hier wird die komplementäre DNA erstellt. Daran schließt sich eine Ruhephase ohne weitere Synthese an, die G2-Phase. Zur weiteren Replikation erfolgt wiederum eine Mitose. Ein Zellzyklus dauert in Säugerzellen etwa 22 Stunden. Die Zellen können sich auch direkt aus der G1-Phase in die G0-Phase, die Ruhephase, als Dauergewebszelle weiterdifferenzieren. Unter bestimmten Umständen können sie erneut proliferieren.

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Da die Zellen nicht alle synchron ihren Zellzyklus durchlaufen, werden sie bei der Zellzyklusanalyse in unterschiedlichen Phasen angetroffen. Die meisten Zellen lassen sich in der G1-Phase finden, da diese zeitlich am längsten dauert, gefolgt von der etwas kürzeren S-Phase. Es lassen sich weniger Zellen in der wesentlich kürzeren G2-Phase bestimmen und nur einige vereinzelte Zellen in der von allen am kürzesten Mitose-Phase.

Abbildung 2
Normaler Zellzyklus somatischer Zellen mit den verschiedenen Phasen. G1-Phase (2n DNA): RNA und Proteine werden synthetisiert, nicht jedoch DNA. S-Phase (2-4n DNA): DNA Synthese. G2-Phase (4n DNA): Tetraploider Chromosomensatz komplett. M-Phase (4n → 2n DNA): Zellteilung. (G = Gap = keine DNA-Synthese; S = DNA-Synthese; M = Mitose).

Zur Bestimmung des DNA-Gehaltes der Zellen wurde eine Zytometrie-Analyse am zweiten und dritten Tag nach der Behandlung mit 2-ME (FACS) durchgeführt (El-Naggar et al. 1992). Es wurden pro Zelllinie 10.000 Zellen der HCC Zelllinien in einem Calibur flow cytometer von Becton-Dickinson (ausgestattet mit einem einzelnen 488-nm Argon-Ionenlaser und an einen Macintosh Quadra 650 Computer angeschlossen) analysiert (Weber et al. 2000). Die Pankreaskarzinomzelllinien wurden in einem EPICS Profile II flow cytometer (Coulter Corp., Hialeah, FL, USA) prozediert und die Daten anschließend mit dem Coulter Cytological program analysiert. Die grüne Fluoreszenz (FITC) wurde durch einen 530/30-nm band-pass Filter, die rote Fluoreszenz (Propidiumjodid) durch einen 582/42-nm band-pass Filter gesammelt. In den Zellzyklusanalysen wurde der DNA-Gehalt jeder einzelnen Zelle bestimmt und in den Graphiken entlang der Abszisse aufgetragen. Mit „M1“ sind die Zellen bezeichnet, die nur wenig DNA enthalten, welches mit einer DNA-Fragmentation korreliert. Dieses ist ein charakteristisches Zeichen der Apoptose. Unter „M2“ sind die Zellen mit einem haploiden Chromosomensatz in der G1- und beginnenden S-Phase zusammengefaßt. Bei gesunden Zellen befinden sich die meisten in diesem Zyklusabschnitt. Die übrigen in den Graphiken repräsentierten Zellen weisen einen hohen DNA-Gehalt auf, sie haben die Synthesephase bereits durchlaufen und haben einen tetraploiden Chromosomensatz. Alle Versuche wurden mindestens dreimal durchgeführt.

3.9. Tierversuche

3.9.1. Beschreibung und Haltung der Tiere

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Die Verwendung und Haltung der Tiere erfolgte jeweils nach Genehmigung des Tierversuchsantrages der jeweiligen zuständigen Behörden. Die Haltung entsprach ebenfalls den örtlichen Bestimmungen. 4-6 Wochen alte weibliche athymische Nacktmäuse (Charles River, Hannover, Deutschland [Hep 3B Zellen]; Charles River, Wilmington, MA, USA [MIAPaCa-2 und A549 Zellen]) waren geeignete Tiere. Sie besitzen einen genetischen Defekt eines rezessiven Gens auf Chromosom 11 und haben dadurch keinen Thymus entwickelt, was annähernd keine zellvermittelte immunologische Abstoßungsreaktion gegenüber körperfremden Zellen zur Folge hat. Fremde Tumorzellen können sich daher gut in ihrem Körper einnisten und proliferieren. Um das Immunsystem weiter zu supprimieren, wurden die Tiere vor der Injektion der Pankreaskarzinom- und die Bronchialkarzinomzellen mit 350 cGy unter einer 137Cs Quelle bestrahlt. Am darauffolgenden Tag waren die Zellen auf 70-80% konfluierend herangewachsen, so daß die Zellinjektion erfolgen konnte. Nach enzymatischer Ablösung der Zellen mit Trypsin und Waschung mit HBSS (Hanks‘ Balanced Salt Solution) wurde die Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit ermittelt und in die richtige Zellzahl pro Volumen zur Zellinjektion gebracht. Verschiedene Tiermodelle wurden als geeignet angesehen.

3.9.2. Hepatozelluläres Karzinom

Zur Induktion von Tumoren, die vom HCC stammen, verwendeten wir die Zelllinie Hep 3B, die in Nacktmäusen anwächst und Tumoren bildet, wie bereits mehrfach in der Literatur beschrieben (Hahn et al. 1982, Curtin et al. 1986). Da die Zellen nicht in der Leber selbst wachsen und somit ein orthotopes HCC Tumormodell nicht zur Verfügung steht, entschlossen wir uns für eine subcutane Injektion, um subcutane Tumoren zu erzeugen. Der Vorteil dieses Tumormodells ist die einfache Handhabung der Zellinjektion, ein gutes kontinuierliches Monitoring der Wachstumsdynamik der Tumoren und die Möglichkeit, den Versuch rechtzeitig abzubrechen, falls Tumoren ungewöhnlich rasch zu einer nicht tierschutzgerechten Größe heranwachsen. 2 X 106 Hep 3B Zellen wurden in 100µl PBS suspendiert und subcutan in die linke kaudale Flanke von 20 Mäusen mit einer 27G Kanüle injiziert. Drei Tage nach der Injektion wurden die Tiere randomisiert, indem sie für 5 Minuten in einen gemeinsamen Käfig gebracht und anschließend wieder in zwei zufällig zusammengestellte Gruppen mit jeweils 10 Tieren aufgeteilt wurden. Zur Herstellung der 2-ME enthaltenden Lösung wurden 50 mg 2-ME in 500µl DMSO (Dimethylsulfonamide, Sigma) gelöst und dann zur besseren oralen Verabreichung mit 2000µl Olivenöl verdünnt, um eine Lösung von 1mg 2-ME in 50µl Lösung zu erhalten. Ab dem dritten Tag nach Zellinjektion erfolgte die Fütterung der Tiere mit einer Knopfkanüle, die in den Rachen eingeführt wurde. 50µl, die entweder 1mg 2-ME oder lediglich DMSO und Olivenöl enthielten, wurden täglich bis zum 32. Tag nach Zellinjektion verabreicht. Ab dem 20. Tag nach Tumorzellinjektion wurde die subcutane Tumorgröße jeder Maus alle zwei Tage in zwei Ebenen gemessen und die Tumorausdehnung in die dritte Ebene aus dem Mittelwert der anderen beiden Ebenen abgeschätzt. Die Berechnung der jeweiligen Tumorgröße erfolgte nach der Formel 4/3 π r3 zur Berechnung eines Kugelvolumens unter der Annahme, daß die dreidimensionale Tumorausdehnung der Gestalt einer Kugel ähnelt. Nach Beendigung der Versuche am 32. Tag wurden alle Tiere durch Überdosis einer Narkose mit Halothan (Sigma) und zusätzlicher zervikaler Dislokation getötet. Dieser Versuch wurde nach den Richtlinien des Tierschutzbeauftragten nur einmal durchgeführt und mit dem Student’s t-Test die Signifikanz errechnet.

3.9.3. Pankreaskarzinom

Die MIAPaCa-2 Zellen wachsen in der Lunge nach intravenöser Verabreichung. 3 x 106 Zellen wurden in 100µl PBS suspendiert und in die Schwanzvene der Nacktmäuse injiziert. Die Zellmenge war ausreichend, um in allen Tieren multiple Lungenmetastasen zu induzieren und gering genug, um keine letale Lungenembolie auszulösen. Die Randomisierung erfolgte nach drei Tagen, wonach sie wieder zufällig in zwei Gruppen mit jeweils 10 Tieren aufgeteilt wurden. An diesem Tag begann die Therapie analog zur Behandlung der HCC tragenden Tiere. Die Therapiegruppe erhielt 1mg 2-ME in 50µl Lösung pro Tier täglich per os. Die Kontrollgruppe erhielt ebenfalls 50µl der gleichen Lösung, jedoch ohne 2-ME Zusatz. Der Behandlungszeitraum betrug 21 Tage, wonach die Tiere durch Überdosis einer Narkose mit Halothan (Sigma) und zusätzlicher zervikaler Dislokation getötet wurden. Im Anschluß daran wurde in die Lungen über die Trachea 1ml pro Maus 15%ige India Ink Lösung injiziert, um das Lungenparenchym mit schwarzer Tinte zu füllen. Dadurch hatten die Lungen ein volles Volumen, so daß die Oberfläche aufgespannt erschien. Die weißen Tumorknoten färben sich hierdurch nicht an und sind somit durch den hohen Farbkontrast sehr gut zu erkennen und zu untersuchen. Die entnommenen Lungen wurden in Fekete’s Lösung (60% Äthanol, 3% Formaldehyd und 4% glacial Essigsäure) fixiert. Die Gesamtzahl der Tumorknoten auf der Oberfläche von jeweils 5 Lungenlappen wurde unter einem Stereoskop durch zwei unabhängige Untersucher ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe ermittelt. Dieser Versuch wurde dreimal durchgeführt. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Student’s t-Test berechnet.

3.9.4. Bronchialkarzinom

↓31

A549 Zellen wurden in einer Menge von 2 X 106 in die Schanzvenen von Nacktmäusen analog zur Injektion der MIAPaCa-2 Zellen gespritzt. Die Fütterung mit 2-ME begann 5 Tage nach Zellinjektion in einer Dosis von 1mg pro Maus in 50µl Lösung bis zum Ende des Versuchs am 21. Tag nach Zellinjektion. Das Wild-Typ p53 oder das Lac-Z exprimierende Adenovirus wurde in einer Menge von jeweils 5 x 109 pfu (Plaque forming units) an den Tagen 5, 7 und 9 nach Zellinjektion in die Schwanzvene injiziert. Nach 21 Tagen wurden die Tiere durch Überdosis mit Halothan und zusätzlicher zervikaler Dislokation getötet. Eine Injektion von India Ink Lösung über die Trachea und Fixierung der Lungen in Fekete’s Lösung erfolgte analog zu dem Procedere wie bei der Beschreibung für die Pankreaskarzinomzellen. Die Kolonien auf der Oberfläche aller 5 Lungenlappen wurden von zwei unabhängigen Untersuchern ohne Kenntnis der zugehörigen Behandlungsgruppe ausgezählt. Der Versuch zur Zählung der Lungenkolonien wurde dreimal wiederholt, und die statistische Signifikanz mit dem Student’s t-Test errechnet.

3.9.5. Leberresektion zur Proliferationsuntersuchung

20 weibliche Nacktmäuse wurden in 4 zufällig bestimmte Gruppen unterteilt. Davon erhielten 10 Mäuse zwei Tage lang jeweils 1mg pro Maus 2-ME per os. Die Zubereitung und die Menge an 2-ME erfolgte analog zum Procedere wie für das hepatozelluläre Karzinom beschrieben. Am dritten Tag wurde 2-ME weiter verabreicht, und die beiden Gruppen wurden weiter in jeweils zwei Gruppen unterteilt. Davon unterzogen wir die eine Hälfte einer zweidrittel Leberresektion über eine Laparotomie in Vollnarkose. Die andere Hälfte wurde ebenfalls laparotomiert, jedoch ohne Leberresektion. Somit entstanden vier Gruppen. Dieser Versuch wurde zweimal durchgeführt.

1.

Keine Resektion

Kein 2-ME

2.

Keine Resektion

2-ME 1mg/die

3.

Leberresektion

Kein 2-ME

4.

Leberresektion

2-ME 1mg/die

↓32

Die 2-ME Gabe wurde weitere 2 Tage fortgesetzt, wonach die Tiere durch Halothan Überdosis und zusätzlicher zervikaler Dislokation getötet wurden. Die Lebern wurden entnommen und in Formalin fixiert, um dann in Paraffin für weitere Untersuchungen eingebettet zu werden.

3.10. Immunhistochemie

Immunhistochemische Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Gefäßdichte innerhalb der Lungenmetastasen der MIAPaCa-2 Zellen messen zu können. Geprüft wurde ein eventueller antiangiogenetischer Effekt durch 2-ME. Weiterhin wurden Schnitte von Lungenmetastasen der A549 Zellen durchgeführt, um eine eventuelle Stabilisierung des p53 Proteins durch 2-ME nachzuweisen. Außerdem sollte die Größe der einzelnen Tumorknoten auf diese Weise miteinander verglichen werden. Bei den Untersuchungen der Mauslebern nach in vivo Behandlung mit 2-ME nach Leberresektion sollte eine eventuelle Induktion von Apoptose der Hepatozyten durch 2-ME während der Leberregenerationsphase mit Proliferation von Hepatozyten nachgewiesen werden. Es kamen zwei verschiedene Techniken zum Einsatz. Die Lungenmetastasen aus MIAPaCa-2 Zellen wurden an Gefrierschnitten untersucht. Hingegen war bei den Lungenmetastasen der A549 Zellen und bei den Mauslebern die Paraffineinbettung die bessere Methode.

3.10.1. Gefrierschnitte

Nach der Tötung der Tiere wurden die entnommenen Lungen mit den MIAPaCa-2 Zellen zum Nachweis der Angiogenese für Gefrierschnitte vorbereitet. Auch Lungen mit Metastasen von A549 Zellen wurden analog gefärbt. Dazu wurden die Lungen in OCT (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) eingebettet und auf Trockeneis gelegt, bis die Proben gefroren waren. Bis zur weiteren Bearbeitung wurden die so entstandenen Blöcke bei –80°C gelagert. Nach der Anfertigung der Gefrierschnitte wurden die Proben mit 5% Ziegenserum und 1% Pferdeserum geblockt. Danach wurden die Schnitte mit dem Ratten Anti-Maus Antikörper CD31 (PECAM-1, PharMingen, San Diego, CA, USA) bei 4°C über Nacht inkubiert. CD31 befindet sich selektiv in Endothelzellen, so daß man gezielt die Endothelien der Gefäße darstellen kann. Als sekundärer Antikörper wurde ein Peroxidase konjugierter Anti-Ratte IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA, USA) verwendet. CD31 wurde mit Diaminobenzidine sichtbar gemacht. Die Anzahl der Gefäße in einer Gesamtmenge von 30 Tumorknoten pro Behandlungsgruppe wurde ausgezählt und deren Mittelwerte verglichen.

3.10.2. Paraffinschnitte

↓33

Die Lungen mit den A549 Kolonien zum Nachweis der Apoptose bzw. zum Nachweis der p53 Expression nach Behandlung mit 2-ME und dem p53 exprimierenden Adenovirus wurden in Formalin 3% fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Analog dazu wurde bei der immunhistochemischen Färbung der Mauslebern für PCNA beim Leberresektionsversuch verfahren. Nach Anfertigung der Schnitte wurden die Proben mit zusammengemischtem Maus Anti-humanem p53 (DO-7, PharMingen, San Diego, CA, USA) und biotinyliertem Antimaus-Immunglobulin (DAKO Corp., Carpinteria, CA, USA) gemeinsam über Nacht bei 4°C inkubiert, um Komplexe aus primärem und sekundärem Antikörper zu bilden. Danach ergänzten wir 0,1% hitzeinaktiviertes normales Mausserum (Sigma, St. Louis, MO, USA) für 2 Stunden bei 4°C. Nach der Deparaffinisierung und Blockierung mit 1%iger fettfreier Milch wurden die Schnitte mit Komplexen aus primärem und sekundärem Antikörper für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Schnitte mit Streptavidin, welches an Horseradish Peroxidase (DAKO Corp., Carpinteria, CA, USA) konjugiert ist, inkubiert. Die Sichtbarmachung erfolgte mit Diaminobenzidine, die Gegenfärbung mit 0,4% Methylgrünlösung.


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28.11.2006