4.  Ergebnisse

4.1. 2-ME zur Behandlung des hepatozellulären Karzinoms (HCC)

4.1.1. Wachstumshemmung durch 2-ME beim HCC

↓33

Die vier verwendeten Zelllinien zeigten eine dosisabhängige Wachstumshemmung durch 2-ME (Abbildung 3).

Abbildung 3
Proliferationsanalysen der vier verwendeten HCC Zelllinien. Nach Inkubation wurde über einen Zeitraum von 5 Tagen die Zellzahl bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Dreifachzählungen ± SEM (System Error of the mean). Die Dosen sind in µM angegeben.

↓34

Besonders sensibel war die Zelllinie SK-Hep1 mit einer Wachstumshemmung bis 98% bei 2.0µM 2-ME. Die Kontrollgruppen, die entweder nicht oder mit dem nicht aktiven Metaboliten 16-Epiestriol behandelt wurden, zeigten keinerlei Wachstumshemmung. In diesen Gruppen wurde eine exponentielle Wachstumskurve beobachtet. Die mit 2-ME behandelten Zellen hingegen zeigten eine dosisabhängige Wachstumshemmung mit einer Hemmung von über 90% nach Behandlung mit 2µM 2-ME. Während der Proliferationsversuche untersuchten wir jeweils vor den Zählungen die Petrischalen auf Kontamination, Zellzahl und –morphologie unter dem Phasenkontrastmikroskop. Dabei fiel auf, daß die mit 2-ME behandelten Zellen deutliche Veränderungen in der Zahl und Morphologie erfuhren. Beispielhaft sind in Abbildung 4 representative Fotos von SK-Hep 1 Zellen, die während der Versuche angefertigt wurden. In Abbildung 4A und 4B erkennt man vitale Zellen, die weitgehend adhärent sind und eine geordnete morphologische Struktur aufweisen. Die Zellzahl scheint orientierend in diesen beiden Gruppen ähnlich zu sein. In Abbildung 4C hingegen zeigen sich massive Veränderungen. Die Zellen sind zu Gruppen zusammengeschrumpft, und es sind größere zellfreie Areale zu erkennen, was auf eine geringere Zellzahl hindeutet. Die Morphologie hat sich im Sinne des apoptotischen Zelltodes mit Kernfragmentierungen und Zellschrumpfung verändert. Die anderen drei Zelllinien verhalten sich analog.

Abbildung 4
Phasenkontrastaufnahmen der SK-Hep1 Zelllinie nach 3-tägiger Behandlung mit A: PBS, B: MEC 1.5µM und C: 2-ME 1.5µM. Belichtungszeit: 1sec, Vergrößerung: 384-fach. Die Pfeile markieren typische apoptotische Zellen (4C).

4.1.2. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Kernmorphologie

↓35

Um die Kerne morphologisch besser differenzieren zu können, führten wir eine Kernfärbung durch, die im Fluoreszenzmikroskop deutlich wird (Abbildung 5-8).

Abbildung 5
Fluoreszenzfärbung (Hoechst) der SK-Hep1 Zellen nach Behandlung mit A: PBS, B: MEC 2.0µM, C: 1.5µM 2-ME und D: 4.0µM 2-ME. Behandlungsdauer: 3 Tage. Vergrößerung; 384 fach. Unterschiede zu der regulären Kernstruktur, die auf Apoptose hinweisen, sind durch weiße Pfeile markiert.

Unter dem Mikroskop zeigten sich bei den Kernen der Kontrollgruppe und der mit MEC behandelten Gruppe nach Anfärbung gleichmäßig intensiv leuchtende Zellkerne, wobei es sich um morphologisch reguläre Zellkerne in Monolayer handelte (Abbildung 5A und 5B). Auch hier waren die Zellen vital, adhärent und gleichmäßig verteilt. Die spontane Apoptoserate betrug hier etwa 5%. Nach Gabe von 2-ME verminderte sich die Anzahl der Zellen deutlich und es wurden charakteristische Apoptosezeichen sichtbar (Abbildung 5C und 5D). Es trat Zellschrumpfung durch Zytoplasmaabnahme ein. Besonders bei einer Dosis von 4µM 2-ME wurde gehäufte nukleäre Fragmentation mit Chromatinkondensation und „Membranblebbing“, hauptsächlich in den zu Zellclustern zusammengelagerten Zellen, beobachtet.

↓36

Abbildung 6
Fluoreszenzfärbung (Hoechst) der HepG2 Zellen nach Behandlung mit A: PBS, B: MEC 5.0µM und C: 5.0µM 2-ME. Behandlungsdauer: 3 Tage. Vergrößerung; 384 fach. Unterschiede zu der regulären Kernstruktur, die auf Apoptose hinweisen, sind durch weiße Pfeile markiert.

Die in Abbildung 6 dargestellten Hep G2-Zellen zeigten auch nach 2-ME Gabe in der hohen Dosis von 5.0µM nur diskrete Abweichungen von der regulären Kernstruktur in Form von Kernfragmentationen (Abbildung 6C). Die Apoptoserate stieg auf nur ca. 2% an. Wie auch bei den SK-Hep 1 Zellen wirken die nicht und die mit 16-Epiestriol behandelten Zellen adhärent, vital und gleichmäßig verteilt.

Abbildung 7
Fluoreszenzfärbung (Hoechst) der Hep 3B Zellen nach Behandlung mit A: PBS, B: MEC 4.0µM, C: 2.0µM 2-ME und D: 4.0µM 2-ME. Behandlungsdauer: 3 Tage. Vergrößerung; 384 fach. Unterschiede zu der regulären Kernstruktur, die auf Apoptose hinweisen, sind durch weiße Pfeile markiert.

↓37

Bei der Zelllinie Hep 3B wurden ebenfalls in den beiden Vergleichsgruppen farbintensive reguläre Zellkerne in Monolayern gefunden. Wiederum sind die Zellen vital, adhärent und gleichmäßig verteilt. Die spontane Apoptoserate lag hier bei etwa 0,5 % (Abbildung 7A und 7B). Hingegen zeigte sich nach Behandlung mit 2-ME ein Anstieg der Apoptoserate auf 2,5% bei einer Dosis von 2.0µM und auf 5% bei 4.0µM 2-Me (Abbildung 7C und 7D). Zugleich wurden entsprechende apoptotische Veränderungen der Zellen vor allem bei höheren Dosen 2-Methoxyestradiol gefunden.

Abbildung 8
Fluoreszenzfärbung (Hoechst) der PLC/PRF/5 Zellen nach Behandlung mit A: PBS, B: MEC 3.0µM, C: 3.0µM 2-ME und D: 4.0µM 2-ME. Behandlungsdauer: 3 Tage. Vergrößerung; 384 fach. Unterschiede zu der regulären Kernstruktur, die auf Apoptose hinweisen, sind durch weiße Pfeile markiert.

Die Kontrollgruppen A und B in Abbildung 8 zeigten wie bei den andern Zelllinien vitale Zellen mit normaler Kernmorphologie. Nach Behandlung mit 2-ME kam es erneut zur Zunahme der apoptotisch veränderten und teilweise geschrumpften Zellen. Bei einer Dosis von 3µM 2-ME zeigte sich eine beginnende Kernfragmentation mit Chromatinkondensation und ein Anstieg der Apoptoserate auf 2%, die bei einer Dosis von 4.0µM 2-ME auf 9.5% gesteigert wurde (Abbildung 8C und 8D).

↓38

Bei der Auszählung der Zellen unter dem Mikroskop zur Differenzierung zwischen normalen und apoptotischen Zellen konnte in den mit 2-ME behandelten Gruppen der Anstieg der apoptotischen Zellen beobachtet werden. SK-Hep 1 zeigt eine maximale Apoptoserate von 10% bei 1,5µM 2-ME. Das ist deutlich weniger, als nach den Erfahrungen der vorhergehenden Untersuchungen erwartet. Größtenteils ist diese Diskrepanz methodenbedingt, da in der Zubereitung und Färbung der Zellen Schritte mit Waschungen eingeführt wurden, die zum Verlust der teilweise gelösten apoptotischen Zellen führten.

Abbildung 9
Prozentualer Anteil der apoptotischen Zellen aller vier Zelllinien in den mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbten Zellkulturen. Die Zellzählung erfolgte geblindet durch zwei unabhängige Untersucher. Es wurden mindestens 500 Zellen pro Behandlungsgruppe ausgezählt. Die Dosierungen unter den Namen der Zelllinien entsprechen den Dosen 2-ME.

4.1.3. Immunzytologischer Apoptosenachweis

Um einen immunzytologischen Nachweis der Induktion von Apoptose erbringen zu können, färbten wir die Kulturen nach Behandlung mit 2-ME, MEC oder PBS auf Apo 2.7, Annexin V und TUNEL. Alle drei Färbemethoden können apoptotischen Zelltod nachweisen. Als Kontrolle verwendeten wir humane Hepatozytenkulturen, die aus Leberresektaten gewonnen wurden, wie in Material und Methoden beschrieben. Man erkennt das Vorliegen von apoptotischen Zellen nach Behandlung mit 2-ME in allen vier Zelllinien mit allen drei Färbemethoden. Kein Nachweis apoptotischer Zellen gelang in den Kontrollgruppen der mit PBS oder MEC behandelten Zellen. Ebenso verhielten sich die humanen Hepatozyten, bei denen auch in den mit 2-ME behandelten Gruppen kein Zuwachs der Apoptoserate zu erkennen war. Abbildung 10 zeigt das Ergebnis. Kontrollzellen und Zellen, die mit MEC inkubiert wurden, zeigten keinerlei Unterschiede im Anfärbeverhalten. Sehr geringe bis keine spezifisch gefärbte Zellen auf Apoptose sind erkennbar. Auch hier sieht man wiederum eine sehr gleichmäßige Verteilung der adhärenten und vitalen Zellen. Die Zellen, die mit 2-ME behandelt wurden, zeigten deutliche spezifische Färbungen für Apoptose bei allen Tumorzelllinien (Abbildung 10.1. C, F, I; 10.2. C, F, I; 10.3. C, F, I; 10.4. C, F, I;). Der apoptotische Zelltod wurde also allein durch 2-ME ausgelöst. Am stärksten färbten sich die SK-Hep1 und die Hep 3B Zellen an, die auch in den Fluoreszenzuntersuchungen den höchsten Anteil apoptotischer Zellen besaßen. Etwas weniger Färbung zeigten Hep G2 und PLC/PRF/5 Zellen, was ebenfalls unsere Auszählungen der mit Hoechst gefärbten Zellen bestätigt. Normale Hepatozyten zeigten in allen drei Behandlungsgruppen eine geringe Färbung für Apoptose. Normale Hepatozyten werden demnach durch 2-ME nicht geschädigt, ein Unterschied der Färbeintensität war zwischen Kontrollgruppe, MEC-Gruppe und 2-ME-Gruppe nicht feststellbar. Auch die Kriterien Zellzahl, Verteilungsmuster und Zellvitalität war in allen drei Gruppen gleich.

↓39

Abbildung 10.1.-10.2.
Spezifische immunzytologische Färbungen zum Nachweis apoptotischer Zellen. Die verwendeten Dosen von 2-ME oder MEC betrugen für Sk-Hep 1 3,0µM und für Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 und den frischen humanen Hepatozyten 5,0µM. Der Behandlungszeitraum betrug 2 Tage. Die Färbung erfolgte für Apo 2.7 (A-C), Annexin V (D-F), oder TUNEL (G-I). Kontrolle mit PBS A, D, G, mit MEC B, E, H. Bei Vorliegen von Apoptose war eine spezifische Färbung vorhanden: Gelbe Punkte bei Apo 2.7 (C), rote Färbung bei Annexin V (F) und gelbe Punkte in der TUNEL Färbung (I).

Abbildung 10.3.-10.4.
Spezifische immunzytologische Färbungen zum Nachweis apoptotischer Zellen. Die verwendeten Dosen von 2-ME oder MEC betrugen für Sk-Hep 1 3,0µM und für Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 und den frischen humanen Hepatozyten 5,0µM. Der Behandlungszeitraum betrug 2 Tage. Die Färbung erfolgte für Apo 2.7 (A-C), Annexin V (D-F), oder TUNEL (G-I). Kontrolle mit PBS A, D, G, mit MEC B, E, H. Bei Vorliegen von Apoptose war eine spezifische Färbung vorhanden: Gelbe Punkte bei Apo 2.7 (C), rote Färbung bei Annexin V (F) und gelbe Punkte in der TUNEL Färbung (I).

Abbildung 10.5.
Spezifische immunzytologische Färbungen zum Nachweis apoptotischer Zellen. Die verwendeten Dosen von 2-ME oder MEC betrugen für Sk-Hep 1 3,0µM und für Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 und den frischen humanen Hepatozyten 5,0µM. Der Behandlungszeitraum betrug 2 Tage. Die Färbung erfolgte für Apo 2.7 (A-C), Annexin V (D-F), oder TUNEL (G-I). Kontrolle mit PBS A, D, G, mit MEC B, E, H. Bei Vorliegen von Apoptose war eine spezifische Färbung vorhanden: Gelbe Punkte bei Apo 2.7 (C), rote Färbung bei Annexin V (F) und gelbe Punkte in der TUNEL Färbung (I).

↓40

Aus den Untersuchungen zur Wirkung von 2-ME auf das Wachstumsverhalten von Tumorzelllinien ergab sich, daß 2-ME bei 4 getesteten HCC-Zelllinien signifikant zu einer Wachstumshemmung durch Induktion von Apoptose führt. Kein Unterschied der Färbeintensität ist zwischen Kontrollgruppe, mit MEC oder mit 2-ME behandelten Gruppen der Hepatozyten erkennbar. Auch die Anzahl, das Verteilungsmuster und die Vitalität der Zellen ist offensichtlich in allen Gruppen gleich. Somit kommt es bei normalen Hepatozyten zu keinem Zuwachs der apoptotischen Zellen durch 2-ME.

4.1.4. Messung der Zellschädigung mittels AST-Konzentrationen

Durch Messung der AST-Konzentration im zellfreien Mediumüberstand aller Behandlungsgruppen sowie gesunder humaner Hepatozyten versuchten wir, indirekt Rückschlüsse über eine mögliche Zellschädigung (Freisetzung intrazellulärer Enzyme in das Medium) nach Behandlung mit 2-Methoxyestradiol zu ziehen (Abbildung 11).

Abbildung 11
Messung der AST-Gehalte im Überstand aus den Zellkulturen nach Behandlung mit PBS, MEC und 2-ME.

↓41

Es ergab sich, daß die mit 2-ME behandelten SK-Hep 1 und Hep G2 Zellen einen deutlichen Anstieg der AST Werte im Gegensatz zu den mit PBS oder MEC behandelten Zellen zeigten (Abbildung 11). Die normalen Hepatozyten reagierten jedoch nicht mit einem Anstieg der AST-Werte nach Behandlung mit 2-ME, was zu erwarten war. Die Hep 3B und PLC/PRF/5 Zellen, die eine deutliche Wachstumshemmung durch Apoptose nach 2-ME erlitten, zeigten ebenfalls keinen Anstieg der AST Werte in allen Behandlungsgruppen wie bei den normalen Hepatozyten. Nach diesen Befunden scheint diese Methode als Parameter für die Einschätzung der Zellschädigung ungeeignet.

4.1.5. Zellzyklusanalysen

Zur weiteren Untersuchung des Mechanismus der Wachstumshemmung von Tumorzellen durch Behandlung mit 2-ME, führten wir Analysen im Durchflußzytometer durch. Dieses Verfahren erlaubt die quantitative Bestimmung von Zellen in den einzelnen Zellzyklusphasen sowie apoptotischer Zellen in den unterschiedlichen Behandlungsgruppen. Die Zellzyklusanalyse wurde am 2. und 3. Tag nach Behandlung durchgeführt. Man erkennt eine normale Verteilung der Zellen in den verschiedenen Zellzyklusphasen in den mit PBS und MEC behandelten Gruppen mit der größten Fraktion der Zellen in der G1-Phase. Es schließt sich die S-Phase, die Synthesephase an und endet mit der G2/M-Phase, in der sich die Zellen teilen. Bei allen vier Zelllinien zeigte sich eine Zunahme der Apoptose-Induktion bei den mit 2-ME behandelten Zellen am dritten Behandlungstag, was durch eine Zunahme der Zellen in der Sub-G1 Region gekennzeichnet ist. Hier befinden sich Zellen mit geringem DNA-Inhalt, was kleinfragmentierter DNA entspricht. Dies ist ein typisches Zeichen für Apoptose. Hep G2 Zellen hatten einen geringeren Anteil der Zellen in der Sub-G1 Region, und somit waren weniger apoptotische Zellen vorhanden.

Abbildung 12
Zellzyklusanalysen zur Bestimmung der einzelnen Zellzyklusphasen in Abhängigkeit der Behandlungsgruppen. Die Behandlungsdosen mit MEC oder 2-ME waren 1,5µM bei SK-Hep 1 Zellen, 2,5µM bei Hep G2, Hep 3B und PLC/PRF/5 Zellen für 3 Tage. Die Pfeile markieren die Sub-G1 Region, deren Zellgehalt durch apoptotische Zellen gebildet wird.

↓42

Tabelle 4 zeigt die Verteilung der Zellen in der Sub-G1-Phase und der G1-Phase nach Behandlung mit PBS oder 2-ME. Man sieht einen deutlichen Zuwachs der Zellen in der Sub-G1-Phase bei den SK-Hep 1, Hep 3B und PLC/PRF/5 Zellen bei gleichzeitiger Verringerung der Zellen in der G1-Phase. Weniger deutlich ist der Unterschied bei der Hep G2 Zelllinie, die eine sehr geringe Apoptoserate nach Behandlung mit 2-ME aufweist.

Tabelle 4
Prozentualer Anteil der Zellen in Sub-G1- bzw G1-Phase nach Behandlung mit PBS oder 2-ME.

Zelllinie

Behandlung

Sub-G1 in %

Signifikanz

G1 in %

Sk-Hep 1

Kontrolle

0,73

P < 0,0001

61,92

1,5µM 2-Me

17,76

25,11

Hep G2

Kontrolle

0,36

P < 0,8

21,33

2,5µM 2-Me

0,64

23,75

Hep 3B

Kontrolle

1,66

P < 0,005

29,13

2,5µM 2-Me

4,7

30,47

PLC/PRF/5

Kontrolle

1,62

P < 0,001

38,29

2,5µM 2-Me

10,39

19,42

↓43

Bei allen Zelllinien kam es nach Behandlung mit 2-ME zu einem teilweise stark erhöhten Anteil an Zellen in der Sub-G1-Region bei verringerter G1-Fraktion. 2-ME induziert also Apoptose. In den Kontrollgruppen wurde keine über die spontane Rate hinausgehende Apoptose gefunden. Ein Arrest in der G1- oder G2-Phase als weiterer Mechanismus der Proliferationshemmung nach 2-Me-Gabe wurde nicht beobachtet.

4.1.6. Molekulare Veränderungen nach 2-ME-Gabe

Mittels Western Blot Analysen wurden verschiedene apoptosebezogene Proteine untersucht. Dabei zeigten sich deutliche molekulare Unterschiede bei den mit 2-ME behandelten Zellen. Als Negativkontrolle für das Protein p53 dienten Hep 3B-Zellen, die eine Deletion und damit kein detektierbares p53-Protein aufweisen. Als Positivkontrolle wurde die Zelllinie PLC/PRF/5 benutzt, die ein mutiertes p53-Gen besitzt, was eine massive Überexpression eines nicht funktionsfähigen p53 Proteins zur Folge hat. Nach Gabe von 2-ME wurde bei der Wild-Typ p53 exprimierenden Zelllinie SK-Hep 1 eine starke Hochregulation des p53 Proteins um das 4-fache gefunden. Um die Funktionalität des hochregulierten p53 Proteins einschätzen zu können, untersuchten wir die Expression des p21 Proteins, einem direkten Effektorprotein des p53, im Zusammenhang mit der Hochregulation des p53 Proteins. p21 wurde nach Behandlung mit 2-ME um das 6-fache heraufreguliert. Dieser Befund erhärtet die These, daß 2-ME funktionell aktives p53 Protein hochreguliert, was die These des funktionell aktiven p53 Proteins nach 2-ME erhärtet. Auch bcl-2 als das stärkste bekannte Antiapoptoseprotein wurde auf seine Expression nach Behandlung mit 2-ME untersucht. In der 2-ME Gruppe wurde deutlich, daß bcl-2 um das 9-fache niedriger exprimiert ist, was durch eine densitometrische Analyse gemessen wurde. Abbildung 13 zeigt diese Expressionsmuster.

Abbildung 13
Western Blot Analyse der SK-Hep 1 Zelllinie. Die geladene Proteinmenge betrug für p53 50µg, für p21 und bcl-2 100µg und für ß-Actin 10µg pro Bande.

↓44

Bei den Hep G2 Zellen, die ebenfalls Wild-Typ p53 exprimieren, konnten wir p53 und p21 nachweisen (Abbildung 14). p53 wurde ebenfalls heraufreguliert, jedoch in einem geringeren Ausmaß als in SK-Hep 1 Zellen. p21 zeigte keine vermehrte Expression nach Behandlung mit 2-ME. Bcl-2 konnte nicht nachgewiesen werden. Die Hep 3B Zellen besitzen eine Deletion für das p53 Gen und exprimieren kein p53 Protein. Die PLC/PRF/5 Zellen sind mutiert für das p53 Gen und exprimieren viel funktionell inaktives p53 Protein. Somit ergaben die gemessenen apoptosebezogenen Proteine in den beiden zuletzt genannten Zelllinien keine zusätzlichen Ergebnisse und sind daher nicht dargestellt.

Abbildung 14
Western Blot Analyse der Hep G2 Zelllinie. Die geladene Proteinmenge betrug für p53 50µg, für p21 und bcl-2 100µg und für ß-Actin 10µg pro Bande.

↓45

Die Western-Blot Analysen zeigten somit, daß 2-ME funktionell aktives p53 Protein hochregulieren kann. Die Bedeutung davon ist, daß Induktion von Apoptose bei Wild-Typ p53 exprimierenden Zellen, zumindest zum Teil, p53 abhängig ist. Dies gilt auch, wenn auch in geringerem Ausmaß, für die Hep G2 Zellen, die ebenfalls Wild-Typ p53 exprimieren. Da bei SK-Hep1 Zellen gleichzeitig das Antiapoptoseprotein bcl-2 herunterreguliert wird, wird die Induktion der Apoptose durch 2-ME dadurch weiter gefördert. Diese beiden Beobachtungen erklären vermutlich die besondere Sensibilität der SK-Hep1 Zellen auf 2-ME.

4.1.7. Wirksamkeit von 2-ME in vivo

Als Tiermodell dienten athymische weibliche Nacktmäuse wie in Material und Methoden beschrieben. Nach Beendigung der Versuche trugen wir das durchschnittliche Tumorvolumen der beiden Behandlungsgruppen in einer Graphik zusammen (Abbildung 15). In der mit 2-ME behandelten Gruppe wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe eine signifikante Wachstumshemmung der Tumoren um 55% beobachtet.

Abbildung 15
In vivo Versuch mit subcutanen Tumoren nach Injektion von Hep 3B Zellen bei weiblichen athymischen Nacktmäusen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (System error of the mean).

↓46

Die Wachstumshemmung ist im Students t-Test mit p < 0.04 signifikant. Zwei der Tiere aus der mit 2-ME behandelten Gruppe waren komplett tumorfrei. Augenscheinliche Toxizität wie Gewichtsverlust, Verweigerung der Nahrungsaufnahme oder Verhaltensveränderungen wurden nicht beobachtet. Dieses unveränderte Verhalten war in beiden Gruppen gleich. Alle Tiere aus diesem Versuch sind unmittelbar vor der Tötung in Abbildung 16 aufgereiht. Die Mäuse sind nach der Größe der Tumoren innerhalb der Behandlungsgruppe, links mit dem kleinsten beginnend, sortiert. So kann man im direkten Vergleich die Tumorgrößen abschätzen.

Abbildung 16
Abbildung aller Tiere nach Beendigung des Tierversuches. Eine Maus aus der Kontrollgruppe war eine Woche nach Versuchsbeginn aus unklaren Gründen verstorben.

4.2.  2-ME zur Behandlung des Pankreaskarzinoms

4.2.1. p53 Mutationsstatus verschiedener Zelllinien

Da die Wirkung von 2-ME bei Tumorzellen p53 abhängig sein kann, verwendeten wir Zelllinien mit einer Mutation für das p53 Gen, um zu untersuchen, ob auch p53 unabhängige Mechanismen bei der Induktion der Apoptose von Bedeutung sind. Dazu wurde eine PCR und Sequenzierung der DNA durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 dargestellt. Alle vier verwendeten Pankreaskarzinomzelllinien wiesen eine Mutation für das p53 Gen in unterschiedlichen Exonen auf. Untersucht wurden die Exone 5 – 8, da sich 90% der p53 Mutationen in diesen Exonen befinden. Die Zelllinien PaTu 8988t und PaTu 8988s stammen aus einem einzigen Tumor, so daß es sich um dieselbe Mutation handelt. Durch die Mutation des p53 Gens wird jeder beobachtete Effekt von 2-ME auf diese Tumorzellen eher p53 unabhängig sein.

↓47

Tabelle 5
p53 Status in 4 humanen Pankreaskarzinomzelllinien.

Zelllinie

Exon

Codon

Basenaustausch

Aminosäure

PaTu 8902

5

176

T zu A

Cys zu Ser

PaTu 8988t

8

282

C zu T

Arg zu Trp

MIAPaCa-2

7

248

C zu T

Arg zu Trp

PaTu 8988s

8

282

C zu T

Arg zu Trp

4.2.2. Wachstumshemmung durch 2-ME beim Pankreaskarzinom

Die vier humanen Pankreaskarzinomzelllinien PaTu 8902, PaTu 8988t, PaTu 8988s und MIAPaCa-2 wurden mit verschiedenen Dosen 2-ME und MEC inkubiert und nach 1, 3 und 5 Tagen gezählt. Abbildung 17 zeigt die Proliferation aller vier Zelllinien ohne Behandlung und mit verschiedenen Dosen 2-ME als Dauerbehandlung über 5 Tage. Dargestellt sind die prozentualen Zellzahlen im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe, die mit 100% angegeben ist. Die Proliferationsrate der mit 2-ME behandelten Zellen war dosisabhängig signifikant langsamer als die Kontrollgruppen. Drei der vier Zelllinien zeigten eine sehr ähnliche Wachstumskinetik nach Behandlung mit 2-ME. PaTu 8902, PaTu 8988t und MIAPaCa-2 Zellen reagierten mit einer Wachstumshemmung von 50-90% nach 5 Tagen Behandlung mit der geringen Dosis von 2µM 2-ME. Die PaTu 8988s Zelllinie war deutlich weniger sensibel als die anderen. Deshalb lag die IC50 in einem Bereich von 2-10µM bei den vier verwendeten Zelllinien.

Abbildung 17
Proliferationsanalysen der vier verwendeten humanen Pankreaskarzinomzelllinien. Die Zellen wurden kontinuierlich 5 Tage lang mit unterschiedlichen Dosen 2-ME und MEC behandelt. (letzteres nicht abgebildet). Die abgebildeten Dosen sind in µM angegeben.

↓48

Untersuchungen unmittelbar vor den Zellzählungen unter dem Phasenkontrastmikroskop ergaben deutliche morphologische Veränderungen im Sinne von Zellschrumpfung und Isolierung aus dem Zellverband mit Nachbarzellen sowie Fragmentierung der Kerne analog zu den HCC Zellen. Dies sind deutliche Zeichen für Apoptose. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß der Mechanismus der Wachstumshemmung apoptotischer Zelltod ist, der zeit- und dosisabhängig ist. Die unbehandelten Kontrollen und die mit MEC behandelten Zellen zeigten keinerlei morphologische Veränderungen, blieben adhärent, vital und gleichmäßig verteilt.

4.2.3. Induktion von Apoptose und Veränderungen des Zellzyklus durch 2-ME

Die vorgenannten Pankreaskarzinomzellen wurden wie im Abschnitt Material und Methoden beschrieben, behandelt. Analog zu den anderen Versuchen wurden die Zellen mit 2-ME oder MEC inkubiert und dem Durchflußzytometer zugeführt. In Abbildung 18 sind die Ergebnisse dargestellt. Man erkennt in dieser Abbildung einen normalen Zellzyklus in den nicht behandelten und in den mit MEC behandelten Kontrollgruppen. Die Zellverteilung ist typisch, die meisten Zellen befinden sich in der G1-Phase, erkennbar an dem hohen Peak. Rechts davon befindet sich die S-Phase, in der die DNA-Synthese stattfindet. Der DNA-Gehalt nimmt in dieser Phase zu. Der Peak rechts davon entspricht der G2/M-Phase, der Phase, aus der die Zellen in die Mitose einmünden, um so ihren DNA-Gehalt wieder zu halbieren. Die Zelllinien PaTu 8902, PaTu 8988t und MIAPaCa-2 zeigen in der mit 2-ME behandelten Gruppe ein morphologisch deutlich verändertes Zellzyklusmuster. Hier befinden sich Zellen in der Sub-G1 Region, was Zellen mit geringen Mengen DNA entspricht, einem typischen Muster bei Apoptose. Die S-Phase ist deutlich überrepräsentiert. Bei den weniger sensiblen Zellen PaTu 8988s sind keine Zellen in der Sub-G1 Region, sie haben auch keinen Zuwachs der S-Phase. Diese Zellen erleiden keinen apoptotischen Zelltod.

Abbildung 18
Durchflußzytometrische Ergebnisse nach Behandlung der vier Pankreaskarzinomzelllinien PaTu 8902, PaTu 8988t, MIAPaCa-2 und PaTu 8988s. Links ist jeweils die Kontrollgruppe ohne Behandlung, in der Mitte die Gruppe nach Behandlung mit MEC und rechts die mit 2-ME behandelten Gruppen dargestellt. Die Pfeile markieren die Sub-G1 Region, in der Zellen mit geringem DNA-Gehalt auftreten, wie es bei apoptotischen Zellen typisch ist. Die Behandlungsdosen sind in µM unter den jeweiligen Graphiken dargestellt.

↓49

Tabelle 6 zeigt die Anzahl der durch das Durchflußzytometer gemessenen apoptotischen Zellen je nach Behandlungsgruppe. Hier wird deutlich, daß die Zelllinien PaTu 8902, PaTu 8988t und MIAPaCa-2 einen signifikanten Zuwachs an apoptotischen Zellen in der mit 2-ME behandelten Gruppe, nicht jedoch in den beiden Kontrollgruppen aufweisen. PaTu 8988s, die in den anderen Untersuchungen weniger sensible Zelllinie hat indessen keinen Zuwachs der apoptotischen Zellen.

Tabelle 6
Prozentueller Anteil der apoptotischen Zellen nach Behandlung mit PBS, MEC oder 2-ME.

In Tabelle 7 sind im selben Versuch wie in Abbildung 18 und Tabelle 6 die relativen Zellzahlen in den verschiedenen Zellzyklusphasen dargestellt.

↓50

Tabelle 7
Darstellung der relativen Zellzahlen in verschiedenen Zellzyklusphasen je nach Behandlungsgruppe

PaTu 8902

PaTu 8988t

Kontrolle

MEC

2-ME

Kontrolle

MEC

2-ME

G1

37.5

37.5

19.8

44.0

40.8

24.7

S

43.5

46.1

57.9

38.5

40.2

69.8

G2/M

19.0

16.4

22.3

17.5

19.0

5.5

MIAPaCa-2

PaTu 8988s

Kontrolle

MEC

2-ME

Kontrolle

MEC

2-ME

G1

55.7

55.0

37.3

51.8

53.5

73.9

S

38.3

35.8

49.3

31.4

31.0

15.2

G2/M

6.0

9.2

13.4

16.8

15.5

10.9

Man erkennt hier im Detail die Verteilung der Zellen in den einzelnen Phasen. Es läßt sich auch die Akkumulation der Zellen in der S-Phase der Zelllinien PaTu 8902, PaTu 8988t und MIAPaCa-2 bei gleichzeitigem signifikanten apoptotischen Zelltod in den mit 2-ME behandelten Gruppen feststellen. Bei den PaTu 8988s Zellen ist der Anteil der Zellen in der S-Phase in der mit 2-ME behandelten Gruppe geringer, jedoch wird hier ein Zuwachs der Zellen in der G-1 Phase von 51,8% in der Kontrollgruppe auf 73,9% in der mit 2-ME behandelten Gruppe beobachtet. Es besteht hier also ein G1-Arrest, der ebenfalls zur Wachstumshemmung führt.

4.2.4. Apoptosenachweis durch immuncytologische TUNEL-Färbung

Um den Nachweis des apoptotischen Zelltodes durch 2-ME weiter zu bestätigen, führten wir eine spezifische Färbung für DNA-Enden durch, die TUNEL-Färbung. Abbildung 19 zeigt representative Ausschnitte der gefärbten Präparate. Eine intensive Färbung bei den mit 2-ME und mit DNase vorbehandelten Zellen wird deutlich. Dies bedeutet, daß viele DNA Fragmente vorhanden sind, was apoptotischem Zelltod entspricht. Die Vorbehandlung mit DNase diente als Positivkontrolle. Zusätzlich erkennt man morphologische Veränderungen im Sinne eines apoptotischen Zelltodes in diesen Gruppen. Die Anzahl der apoptotischen Zellen betrug nach Auszählung zwischen 30 und 90%. Hingegen war in den Kontrollgruppen (PBS oder MEC) keinerlei Färbung erkennbar. Auch morphologische Veränderungen lagen nicht vor. Abbildung 20 zeigt im Balkendiagramm die Menge der apoptotischen Zellen nach Auszählung der nach TUNEL gefärbten Präparate. Die in den Kontrollgruppen befindlichen Zellen weisen eine Spontanapoptoserate von 2-8% auf. Ein Unterschied zwischen den Kontrollgruppen und den mit MEC behandelten Zellen besteht nicht. Bei Auszählung der mit 2-ME behandelten Zellen bemerkt man einen hohen Anteil apoptotischer Zellen von 30% bei den PaTu 8902 bis nahezu 100% bei den sensiblen MIAPaCa-2 Zellen. Die PaTu 8988s Zellen hingegen haben keinen gesteigerten Anteil an apoptotischen Zellen in der mit 2-ME behandelten Gruppe gegenüber den Kontrollgruppen trotz der hohen Dosierung von 10µM.

↓51

Abbildung 19
TUNEL Färbung der vier verwendeten Zelllinien mit unterschiedlichen Behandlungsgruppen. A: Mit PBS inkubierte Kontrolle; B: Mit 16-Epiestriol (MEC) inkubierte Kontrolle; C: Mit 2-ME inkubiert; D: Mit DNase inkubiert. Die Dosen für MEC und 2-ME waren 1,5µM für MIAPaCa-2, 2µM für PaTu 8988t und PaTu 8902 und 10µM für PaTu 8988s.

Abbildung 20
Prozentsatz apoptotischer Zellen nach Behandlung wie in Abbildung 19.

4.2.5. Wirksamkeit von 2-ME in vivo

↓52

Aufgrund der hohen Sensibilität der MIAPaCa-2 Zellen und des aggressiven Wachstums in Nacktmäusen entschieden wir uns für diese Zelllinie, um die in vivo Versuche durchzuführen. In dem verwendeten Lungenmetastasenmodell konnten in Vorversuchen zur Etablierung des Modells bei allen Tieren rasenartig wachsende Lungenherde induziert werden. Bei 10 Tieren pro Behandlungsgruppe beobachteten wir eine signifikante Wachstumshemmung in der mit 2-ME behandelten Gruppe. Kein Tier konnte tumorfrei den Versuch beenden. Abbildung 21 zeigt exemplarisch an je einem Lungenlappen zwei verschiedener Mäuse das Befundergebnis.

Abbildung 21
Exemplarisch dargestellte Lungenlappen von Mäusen nach Beendigung der Versuche. A: Kontrollgruppe mit Fütterung von DMSO in Olivenöl; B: Behandlung mit 1mg 2-ME pro Maus täglich über 3 Wochen nach Injektion der Zellsuspension. Die Abbildung zeigt Lungenlappen von jeweils zwei verschiedenen Mäusen aus Gruppen von je 10 Tieren.

Man erkennt deutlich die hohe Anzahl der Metastasen in der Kontrollgruppe. Hingegen waren die Metastasen in der mit 2-ME behandelten Gruppe deutlich weniger und kleiner. Die Mäuse aus der Kontrollgruppe hatten ein um 20% geringeres Gewicht als die Mäuse der Behandlungsgruppe und hatten den deutlichen klinischen Anschein der Tumorkachexie (nicht gezeigt). Abbildung 22 zeigt ein Balkendiagramm mit der Anzahl der gezählten Metastasen aller Tiere im Durchschnitt pro Behandlungsgruppe. Man erkennt, daß die mit 2-ME behandelte Gruppe eine um 60% geringere Anzahl an Kolonien aufweist im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis ist statistisch signifikant (p < 0,0005 im Students t-Test).

↓53

Abbildung 22
Anzahl der Lungenmetastasen auf der Oberfläche aller 5 Lungenlappen aller Mäuse bei n = 10 pro Gruppe. (* = p< 0,0005).

4.2.6. Immunhistochemische Färbung zum Nachweis der Blutgefäße

Um eine Hemmung der Angiogenese als möglichen Wirkmechanismus von 2-ME zu untersuchen, färbten wir Lungenschnitte nach Beendigung der Versuche mit einem spezifischen Marker für Endothelzellen, dem CD31. In den Schnitten sieht man, daß die Tumorkolonien nicht nur geringer in der Anzahl, wie oben beschrieben, sondern auch deutlich kleiner im Durchmesser sind. Eine Verringerung der Gefäßdichte in der mit 2-ME behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe konnte in diesem Versuch nicht nachgewiesen werden (Abbildung 23).

Abbildung 23
Darstellung der Dichte der Blutgefäße im Tumor mit einer Färbung für CD31.

↓54

Augenscheinlich ist kein Unterschied der Gefäßdichte in den Tumoren der beiden Behandlungsgruppen erkennbar. Die Auszählung der Gefäße zeigte einen nicht signifikanten Rückgang der Gefäßdichte um 18% in der Behandlungsgruppe gegenüber der Kontrolle. (Abbildung 24).

Abbildung 24
Balkendiagramm der Auszählung der Gefäßdichte innerhalb der Tumoren der beiden Behandlungsgruppen. Die Error bars zeigen die SEM. (p < 0.06 im Students t-Test).

4.2.7. Kombinationstherapie aus 2-ME und anderen Zytostatika

In der Klinik werden Chemotherapien häufig durch die Kombination aus zwei oder drei Substanzen entweder in der Effektivität erhöht, oder es werden die Nebenwirkungen durch eine jeweils reduzierte Dosis verringert. Um in vitro eine Zunahme der Effektivität einschätzen zu können, wurde 2-ME mit unterschiedlichen Substanzen kombiniert angewendet. Untersucht wurden hierbei Gemcitabine, Docetaxel und der monoklonale Anti-EGF Rezeptor Antikörper C225. Letzterer ist ein chimärer Human-Maus Antikörper, der spezifisch an den EGF Rezeptor (EGFR = Epidermal Growth Factor Receptor) bindet und so das EGF Rezeptor vermittelte Wachstum hemmt.

↓55

Die Ergebnisse zeigen, daß es jeweils zu einer gewissen additiven Wachstumshemmung kommt. In Abbildung 25 sind die Proliferationsanalysen der zwei verwendeten Zelllinien AsPc-1 und MIAPaCa-2 nach 5 tägiger Behandlung mit 2-ME alleine oder in Kombination mit Gemcitabine, Docetaxel oder C225 dargestellt.

Abbildung 25
Proliferationsanalysen der zwei Zelllinien AsPc-1 (A-D) und MIAPaCa-2 (E-H) nach 5 tägiger Behandlung mit 2-ME alleine (A, E) oder kombiniert mit Gemcitabine (B, F), Taxol (C, G) oder C225 (D, H). Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (System error of the mean).

Die AsPc-1 Zellen zeigten insgesamt etwas weniger Wachstumshemmung durch 2-ME alleine. 1µM 2-ME bewirkte eine Hemmung von ca. 22% (A). Hingegen konnte 1µM 2-ME eine ca. 65%ige Wachstumshemmung der MIAPaCa-2 Zellen bewirken (E). Gemcitabine und Docetaxel alleine waren jeweils in der Lage, eine Wachstumshemmung bei beiden Zelllinien zu bewirken. Gemcitabine führte bei der geringen Dosis von 3ng/ml in beiden Zelllinien zu einer Hemmung von 30%, die mit 0,5µM 2-ME im Sinne einer additiven Wachstumshemmung auf 43% bei den AsPc-1- (B) und auf 49% bei den MIAPaCa-2 Zellen (F) gesteigert werden konnte. Docetaxel hemmte das Wachstum in einer Dosis von 0,1pg/ml um 28% in den AsPc-1- und um 37% in den MIAPaCa-2 Zellen. Der Zusatz von 0,5µM 2-ME addierte die Wachstumshemmung auf 63% bei den AsPc-1- (C) und auf 75% bei den MIAPaCa-2 Zellen (G). Der Antikörper C225 zeigte nur eine geringe Wachstumshemmung von 4% bei den AsPc-1 Zellen und 13% bei den MIAPaCa-2 Zellen. Durch Zugabe von 0,5µM 2-ME konnte auch hier eine gesteigerte Wachstumshemmung auf 15% bei den AsPc-1- (D) und auf 38% bei den MIAPaCa-2 Zellen (H) erreicht werden.

4.2.8. Apoptosenachweis nach Kombinationsbehandlung

↓56

Fluoreszenzfärbungen zur Darstellung der Kernmorphologie wurden angefertigt, um einen eventuellen Zuwachs der Apoptoserate nach Zugabe der Zytostatika darzustellen. Bei beiden Zelllinien wurde ein Zuwachs der Apoptoserate nach Behandlung mit 2-ME alleine festgestellt wie auch in anderen Versuchen bereits geschildert. Die Zugabe von Gemcitabine, Taxol oder C225 bewirkte jedoch keinen weiteren Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen (Daten nicht gezeigt).

Zusammenfassend ergab die Kombination von 2-ME mit Gemcitabine und Docetaxel bei beiden verwendeten Zelllinien eine additive Wachstumshemmung bis auf 63% bei AsPc-1 und auf 75% bei MIAPaCa-2 Zellen. Die Kombination von 2-ME und dem monoklonalen Anti-EGF Rezeptor Antikörper zeigte ebenfalls eine Steigerung der Wachstumshemmung auf 15% bzw. 35%. Eine Zunahme der Apoptoseinduktion über das Ausmaß der 2-ME Wirkung hinaus konnte durch die Zugabe von Gemcitabine und Docetaxel aber nicht erreicht werden.

4.3. 2-ME zur Behandlung des Bronchialkarzinoms

4.3.1. Kombination aus 2-ME und Gentherapie in vitro

2-ME hat die Eigenschaft, das p53 Protein in den Wild-Typ p53 exprimierenden A549 Zellen durch Stabilisierung und Verlängerung der Halbwertszeit zu vermehren, wie in Voruntersuchungen gezeigt wurde (Mukhopadhyay et al. 1997). Danach war es von Interesse, Folgeuntersuchungen mit einer Kombination aus 2-ME und dem Wild-Typ p53 exprimierenden Adenovirus (Ad-p53) durchzuführen. Dies sollte insbesondere im Tierversuch untersucht werden, wobei 2-ME wiederum systemisch oral und das Adenovirus systemisch intravenös verabreicht werden sollte. Da bei einer systemischen Erkrankung wie einer multiplen Lungenmetastasierung eine systemische Therapie erfolgen muß, sollte untersucht werden, ob in der genannten Kombination ein Effekt auf das Wachstum der Tumorherde zu beobachten ist. Der p53 stabilisierende Effekt von 2-ME soll das vom Adenovirus stammende p53 in der Expression erhöhen, um einen ausreichenden Spiegel p53 Protein in der Tumorzelle zu erhalten, um die Tumorzelle zu töten oder eine Wachstumshemmung zu erzeugen. Vorbereitend wurde eine dosisabhängige Wirkung von 2-ME und Ad-p53 auf die A549 Zellen untersucht. Dabei zeigte sich, daß Ad-p53 in einer Menge von 30 MOI (multiplicity of infection) und die geringe Dosis von 1µM oder weniger 2-ME keine Wachstumshemmung der A549 Zellen hervorrief. Die Kombination aus beiden Komponenten ergab jedoch eine signifikante Wachstumshemmung (Abbildung 26). In den hier angegebenen Dosen kam es bei den Zellen aus den Kontrollgruppen, aber auch bei den Zellen, die entweder mit 2-ME oder Ad-p53 alleine behandelt wurden, zu einem kontinuierlichen Wachstum ohne signifikanten Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen. Wenn 2-ME und Ad-p53 kombiniert wurden, kam es nicht nur zu einer Wachstumshemmung der Zellen, sondern zu einem Rückgang der Zellzahlen nach 5 Tagen.

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Abbildung 26
Wachstumsanalysen von A549 Zellen nach 5-tägiger Behandlung mit 1µM 2-ME, Ad-p53 30 MOI (multiplicity of infection), oder der Kombination aus beiden.

4.3.2. Kombination aus 2-ME und Gentherapie in vivo

Um diesen Effekt in vivo nachvollziehen zu können, injizierten wir 2 x 106 A549 Zellen in die Schwanzvene von Nacktmäusen, um Lungenmetastasen zu induzieren. Das Therapieschema wurde wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt. Nach 21 Tagen Versuchsdauer wurden die Tiere getötet und die Kolonien auf der Lungenoberfläche ausgezählt. Diese Versuche wurden dreimal durchgeführt. Die Zählung der Metastasen erfolgte durch zwei unabhängige Untersucher mit einer Abweichung der Zahlen, die unter 10% lagen. Abbildung 27 zeigt die Anzahl der Metastasen auf der Lungenoberfläche der einzelnen Gruppen.

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Mit Ad-p53 in der benutzten Dosis von drei Applikationen mit 5 x 108 pfu (plaque forming units) konnte eine statistisch nicht signifikante Hemmung des Metastasenwachstums um 15,9% (p = 0.12) erreicht werden. Hingegen führte die Monotherapie mit 2-ME in der Dosis von 75mg/kg KG zu einer Wachstumshemmung um 42,3% im Vergleich mit den unbehandelten Kontrolltieren (p < 0,0001). Die Kombination aus 2-ME und Ad-p53 konnte das Metastasenwachstum weiter bis zu einer 72,6%igen Hemmung senken (p < 0,05 gegen 2-ME alleine). In anderen Experimenten mit weiteren Kontrollgruppen (16-Epiestriol für 2-ME und Ad-LacZ für Ad-p53) zeigte sich keinerlei Effekt auf das Tumorwachstum (keine Abbildung).

Abbildung 27
Anzahl der Lungenmetastasen auf der Oberfläche aller 5 Lungenlappen pro Tier bei 10 Tieren pro Gruppe. Dargestellt sind Mittelwerte ± SD. * = signifikant weniger Kolonien als unbehandelte Kontrollen (p < 0,0001); ** = signifikant weniger Kolonien als 2-ME alleine (p < 0,05).

Aus diesem Versuch zeigt Abbildung 28 exemplarisch Lungenlappen von je zwei Tieren aus der Kontrollgruppe ohne Therapie (A und D), mit 2-ME alleine behandelt B und E) und mit der Kombination aus 2-ME und Ad-p53 behandelt (C und F). Bei den makroskopischen Bildern A-C wird schon leicht erkennbar, dass die Anzahl der Lungenmetastasen in der mit 2-ME alleine behandelten Gruppe (B) deutlich geringer ist, als in der nicht behandelten Kontrollgruppe (A). Nach dem Zusatz von Ad-p53 sieht man einen weiteren Rückgang der Anzahl der Metastasen. Auch die Größe der einzelnen Herde wirkt in den Behandlungsgruppen makroskopisch schon geringer als in der Kontrollgruppe. Immunhistochemische Färbungen mit H&E (Abbildung 28D-F) verdeutlichten, daß nicht nur die Anzahl der Kolonien reduziert waren, sondern auch der Durchmesser der einzelnen Herde, wie bereits bei den makroskopischen Bildern (A-C) vermutet. Der mittlere Durchmesser ± SD von 20 Kolonien pro Tier innerhalb der unbehandelten Kontrollgruppe betrug 245 ± 40µm, 108 ± 13µm bei der 2-ME alleine Gruppe und 54 ± 5µm bei der Gruppe der Kombination aus 2-ME und Ad-p53 (p = 0,0001). Um die Reduktion der gesamten Tumorlast einschätzen zu können, kann man sie durch Einbeziehen der beiden Parameter Anzahl und der Größe der Tumorherde errechnen. Der mittlere Durchmesser der Herde wird zur Berechnung des Tumorvolumens benutzt. Das Tumorvolumen wird dann mit der Anzahl der Herde multipliziert. Somit kann berechnet werden, daß die Kombination aus 2-ME und Ad-p53 eine 336-fache Reduktion der gesamten Tumorlast im Vergleich zur nicht behandelten Kontrollgruppe bewirkt. Eine 21-fache Reduktion wurde durch 2-ME alleine und eine zusätzliche 16-fache Reduktion durch den Zusatz von Ad-p53 erreicht.

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Abbildung 28
Lungenmetastasen auf der Oberfläche von je zwei representativen Tieren aus verschiedenen Behandlungsgruppen makroskopisch (A-C) und immunhistochemisch mit H&E Färbung (D-F). Kontrollgruppe: A,D; 2-ME alleine: B,E; 2-ME + Ad-p53: C,F.

Die Metastasen im histologischen Bild sind mit gestrichelter Linie eingerahmt und durch Pfeile markiert.

Um nun festzustellen, ob die in den in vitro Untersuchungen beobachtete Stabilisierung des p53 Proteins mit anschließender Akkumulation innerhalb der Zellen auch in vivo eintritt, färbten wir die Lungen immunhistochemisch mit einem Antikörper gegen p53 (Abbildung 29).

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Abbildung 29
Färbung von Lungenmetastasen für das p53 Protein ohne Behandlung (A) und mit 2-ME Behandlung (B). Die Pfeile markieren auf p53 positiv gefärbte Zellen. Schnitte mit CD31 zur Darstellung der Gefäße gefärbt (C-E). C: unbehandelt, D: mit 2-ME alleine behandelt, E: mit 2-ME und Ad-p53 behandelt.

Wir konnten an den Paraffinschnitten erkennen, dass die Metastasen der Tiere, die nicht mit 2-ME behandelt wurden, keine oder nur eine sehr schwache p53 Färbung zeigten (Abbildung 29A), wie es bei Wild-Typ p53 exprimierenden Zellen wie der A549 Zelllinie typisch ist. Die Metastasen der mit 2-ME behandelten Tiere hingegen zeigten eine kräftige Färbung und somit eine hohe Expression des p53 Proteins (Abbildung 29B). Eine signifikante mittlere Anzahl von 44 ± 4% SD von 100 gezählten Tumorherden in drei Mäusen färbte sich stark positiv für p53 in der mit 2-ME alleine behandelten Gruppe. In der Kontrollgruppe färbten sich 12 ± 1% von 100 Herden stark positiv für p53 (p < 0,0001). Diese unterschiedliche Färbung für das p53 Protein läßt die Vermutung zu, daß die Wachstumshemmung zumindest partiell durch die Steigerung der p53 Überexpression durch 2-ME bewirkt wird. Die Anzahl der Blutgefäße innerhalb der Tumorherde zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen (Abbildung 29 C-E). Die mittlere Anzahl ± SD in 10 zufällig ausgewählten Herden pro Lunge von je drei Mäusen betrug in der Kontrollgruppe 44 ± 3, in der 2-ME Gruppe 40 ± 2 und in der 2-ME + Ad-p53 Gruppe 42 ± 2 (p = 0,81 im ANOVA Test).

Die Kombination von 2-ME und dem Wild-Typ p53 Vektor führte also zu einem hochsignifikanten Rückgang von Lungenmetastasen im Mausmodell. Der Wirkmechanismus ist dabei offenbar eng verknüpft mit dem durch 2-ME induzierten Anstieg von p53. Dagegen war eine antiangiogenetische Wirkung in diesem System nicht nachweisbar.

4.4. Wirkung von 2-ME auf multiresistente humane Zellen

4.4.1. Cisplatinresistente Bronchialkarzinomzellen

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Um die Wirkung von 2-ME auf das häufige und klinisch relevante Problem der Chemoresistenz von Tumoren zu untersuchen, verwendeten wir verschiedene Zellen, die ein unterschiedliches Ausmaß an Resistenz gegen verschiedene Zytostatika besitzen. Die Bronchialkarzinomzelllinie H1299 erlangte wie in Material und Methoden beschrieben, durch eine kontinuierliche Inkubation mit Cisplatin eine Resistenz gegenüber der zuvor letalen Dosis von 2μg/ml. Abbildung 30 zeigt eine dosisabhängige Wachstumsreduktion durch 2-ME bei den resistenten Zellen. 2μM 2-ME führten zu einer Hemmung um 69%. Das Ausmaß der Hemmung entsprach dem der parentalen, nicht resistenten Zellen und in etwa den untersuchten Tumorzellen anderer Tumortypen, wie beim HCC, Pankreaskarzinom und Bronchialkarzinom gezeigt.

Abbildung 30
H1299 Bronchialkarzinomzellen resistent bei 2,0µg/ml Cisplatin nach 5 Tagen Behandlung mit 2-ME in unterschiedlichen Konzentrationen. Die Konzentrationen sind in µM angegeben. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.

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Wenn dieselben cisplatinresistenten Zellen mit einer Kombination aus 2-ME und einem Adenovirus inkubiert wurden, die den Wild-Typ des p53 Gens exprimieren (Ad-p53), konnte eine additive Wachstumshemmung beobachtet werden. Mit einer MOI (multiplicity of infection) von 1 konnte durch das Adenovirus das Wachstum nach 5 Tagen um 50% gehemmt werden. 2-ME mit einer Dosis von 1.0µM hemmte das Wachstum um 59%. Die Kombination der beiden Substanzen ergab eine Wachstumshemmung von 87% bei dieser Bronchialkarzinomzelllinie (Abbildung 31). Somit scheint auch der Gentransfer mit p53 die Chemoresistenz zu überwinden. Die Kombination aus dem Gentransfer und 2-ME wirkt unabhängig vom Resistenzniveau additiv.

Abbildung 31
H1299 Bronchialkarzinomzellen resistent bei 2,0µg/ml Cisplatin nach 5 Tagen Behandlung mit 2-ME 1.0µM, Ad-p53 MOI 1 oder der Kombination aus beiden. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.

4.4.2. Multiresistente Pankreaskarzinomzellen

Uns interessierte in diesem Zusammenhang auch die Wirkung auf Zellen von Pankreaskarzinomen. Dazu stand uns eine humane Zelllinie vom Pankreaskarzinom in 3 Klonen zur Verfügung, um sie an verschiedenen Zytostatika zu testen (Abbildung 32). Ein Klon war eine parentale chemosensible Zelllinie EPP85-181P, ein weiterer Klon war eine mdr-1 Gen positive chemoresistente Zelllinie EPP85-181RDB und der dritte Klon war eine mdr-1 Gen negative resistente Zelllinie EPP85-181RNOV. Die Resistenz bestand gegen Mitoxantrone, Daunorubicin, Etoposide, Teniposide, Amsacrine, Cisplatin, Paclitaxel und Vindesine. Die mdr-1 positiven Zellen zeigten eine bis zu 1000-fach erhöhte IC50 gegen Paclitaxel, Vindesine, Daunorubicin und Mitoxantrone. Mdr-1 negative Zellen waren etwas weniger resistent mit einer Zunahme der IC50 um das 10-fache gegen Vindesine, Amsacrine und Mitoxantrone.

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Abbildung 32
Resistenzniveau der drei Zellklone eines humanan Pankreaskarzinoms EPP85-181P (sensibel), EPP85-181RDB (mdr-1 Gen positiv) und EPP85-181RNOV (mdr-1 Gen negativ). Insbesondere der mdr-1 Gen positive Klon EPP85-181RDB zeigte eine hohe Resistenzrate gegen die meisten Zytostatika.

Nach Behandlung der drei verwendeten Klone mit 2-ME zeigte sich, das alle Zellklone komplett sensibel waren und an der Proliferation gehindert werden konnten. Verglichen mit den Ergebnissen der anderen verwendeten Zelllinien MIAPaCa-2, AsPc-1, PaTu 8902, PaTu 8988s und PaTu 8988t lag die IC50 bei den resistenten Zellen mit 1,65µM für EPP85-181P, 0,56µM für EPP85-181RDB und mit 0,56µM für EPP85-181RNOV in einem sehr ähnlichen Bereich (Abbildung 33). Insbesondere ist der sehr resistente mdr-1 Gen positive Klon EPP85-181RDB gleichermaßen sensibel auf 2-ME wie die sensible Zelllinie.

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Abbildung 33
Bestimmung der IC50 der drei Klone des humanan Pankreaskarzinoms EPP85-181P (sensibel), EPP85-181RDB (mdr-1 Gen positiv) und EPP85-181RNOV (mdr-1 Gen negativ). Man erkennt eine komplette Sensibilität gegenüber 2-ME. (2-ME: 2-Methoxyestradiol; 16-E: 16-Epiestriol).

2-ME ist also auch bei hochresistenten Bronchialkarzinomzellen und Pankreaskarzinomzellen wirksam. Offenbar spielt dabei der Resistenzmechanismus eine untergeordnete Rolle.

4.5.  Toxizität von 2-ME in vivo

Um die Toxizität von 2-ME auf proliferierende normale Zellen untersuchen zu können, verwendeten wir ein Tiermodell mit Leberresektion an Nacktmäusen, wie in Material und Methoden beschrieben. Keines der Tiere hatte klinische Zeichen einer Leberinsuffizienz oder anderer Nebenwirkungen durch die Operation. Nach Entnahme der Lebern zeigte sich, daß bei den Tieren mit Leberresektion bereits nach 2 Tagen Versuchsdauer eine weitgehende Regeneration der Leber stattgefunden hatte. Dies war auch bei den mit 2-ME behandelten Tieren der Fall, was darauf hindeutete, daß die Leberregeneration durch die Anwesenheit von 2-ME nicht beeinträchtigt wurde. Färbungen zum Nachweis von Apoptose zeigten, daß keine Zunahme der Anzahl der apoptotischen Zellen in den mit 2-ME behandelten Gruppen auftrat (Abbildung 34). Braun gefärbte Zellen, die wir als apoptotisch ansahen, waren in erhöhtem Ausmaß nur in der positiven Kontrolle zu erkennen. Alle anderen Gruppen zeigten nur einen geringen Prozentsatz von braun gefärbten Zellen. Auch eine für Apoptose typische Zellmorphologie, wurde nicht beobachtet. Um zu zeigen, daß eine Proliferation der Leber stattgefunden hat, färbten wir die Lebern mit dem Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), was aktiv proliferierende Zellen anfärbt. Proliferierende Zellen fanden sich nur in den Gruppen mit Leberresektion. Dabei war die Färbung unabhängig davon, ob eine Behandlung mit 2-ME stattfand oder nicht. Die Zellmorphologie änderte sich auch nach 2-ME Behandlung nicht. Die beiden Gruppen mit Leberresektion, ohne und mit Behandlung mit 2-ME hingegen wiesen eine deutliche Färbung der Zellkerne auf, was auf eine stattfindende Proliferation hindeutete. Auch hatte die Färbung die gleiche Intensität, ob 2-ME verabreicht wurde oder nicht. Die Mittelwerte der apoptotischen Zellen sind in Abbildung 35 dargestellt. Es sind keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festzustellen. Die Prozentzahlen der aktiv proliferierenden Zellen sind in Abbildung 36 dargestellt. Hier erkennt man eine deutliche Zunahme der proliferierenden Zellen in allen Gruppen mit Leberresektion.

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Abbildung 34
Representative Fotographien von histologischen Schnitten von Mauslebern aus allen Behandlungsgruppen mit TUNEL Färbung auf Apoptose (A, C, E, G, I) und auf Proliferation (PCNA) (B, D, F, H, J). Vergrößerung: 512 fach. Ohne 2-ME und ohne Resektion: A, B; mit 2-ME ohne Resektion: C, D; ohne 2-ME mit Resektion: E, F; mit 2-ME mit Resektion: G, H; positive Kontrollen: I, J. Die Pfeile zeigen apoptotische Zellen.

Abbildung 35
Prozentsatz apoptotischer Zellen in der Leber in allen Behandlungsgruppen. Positive Kontrolle: Mit DNase vorbehandelte Lebern. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (System Error of the Mean).

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Abbildung 36
Prozentsatz der aktiv proliferierenden Zellen in den verschiedenen Behandlungsgruppen. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.


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28.11.2006