6.  Zusammenfassung

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In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß der physiologische Östrogenmetabolit 2-Methoxyestradiol (2-ME) eine sehr starke Wachstumshemmung auf Tumorzellen verschiedener solider Tumoren ausübt. Die untersuchten Tumoren sind das hepatozelluläre Karzinom (HCC), das Pankreaskarzinom und das Bronchialkarzinom. Alle drei Tumoren haben eine sehr schlechte Prognose, die sich in den letzten 20 Jahren trotz neuer OP-Techniken und neuer zytostatisch wirkender Substanzen sowie molekularer Therapieansätze nicht wesentlich verbessert hat. Beim HCC und beim Pankreaskarzinom konnten wir durch die Verwendung mehrerer Zelllinien eine Generalisierbarkeit der gefundenen Ergebnisse dokumentieren, denn es kam zu einer dosisabhängigen Wachstumshemmung von bis zu 90% bei allen bis auf eine Pankreaskarzinomzelllinie. Die Wirkung lies sich noch verstärken, indem wir 2-ME beim Pankreaskarzinom mit in der Klinik üblichen Zytostatika wie Gemcitabine, Docetaxel oder einem monoklonalen Antikörper gegen den EGF Rezeptor kombinierten. Wir fanden eine additive Wachstumshemmung in der Kombination mit allen verwendeten Substanzen. Beim Bronchialkarzinom basierten unsere Untersuchungen auf Vorarbeiten, bei denen bereits ein tumorhemmender Effekt durch 2-ME gefunden wurde. Wir kombinierten 2-ME mit Gentherapie. Dazu setzten wir ein Adenovirus, welches das Tumorsuppressorgen p53 exprimiert, ein. Hier konnten wir zeigen, daß das vom Gen des Adenovirus stammende p53 Protein nach systemischer intravenöser Applikation in den Lungenmetastasen exprimiert werden kann. 2-ME stabilisierte dieses p53 Protein, so daß eine ausreichende Menge funktionsfähigen p53 Proteins vorhanden war, um die Tumorzellen zu töten oder im Wachstum zu hemmen. Dies war der erste Bericht über eine erfolgreiche intravenöse Applikation eines adenoviralen Vektors mit einem Tumorsuppressorgen.

2-ME war nicht nur in der Lage, wachstumshemmend auf normale Tumorzellen zu wirken. Wir konnten auch zeigen, daß multiresistente Pankreaskarzinomzellen, die eine bis zu 1000-fach letale Dosis Zytostatika überleben, komplett sensibel gegenüber 2-ME waren. Die Wachstumshemmung durch 2-ME war in diesem Versuch identisch zwischen parentalen sensiblen Zellen und den multiresistenten Zellen. Die IC50 lag hier bei 0,56μM bzw bei 1,65μM je nachdem, ob das mdr-1 Gen exprimiert wurde oder nicht. Diese Werte entsprechen in etwa denen, die bei anderen Tumorzelltypen gefunden wurden. Auch Bronchialkarzinomzellen, die eine Resistenz gegen Cisplatin aufwiesen, zeigten sich ebenfalls komplett sensibel gegenüber 2-ME.

Untersuchungen zur Toxizität von 2-ME zeigten, daß Kulturen von normalen humanen Hepatozyten, die von Leberresektaten gewonnen wurden, die Behandlung mit 2-ME überlebten. In parallelen Versuchen mit HCC Zellen zeigte sich eine signifikante Wachstumshemmung der Tumorzellen. Da die normalen Hepatozyten nicht proliferieren, untersuchten wir proliferierende Hepatozyten, indem wir Leberresektionen bei Mäusen durchführten. In der Leberregenerationssphase behandelten wir die Mäuse mit 2-ME. 2-ME hatte keine nachteilige Wirkung auf die Tiere. Nach Beendigung des Versuches waren die resezierten Lebern fast komplett regeneriert. Immunhistochemische Untersuchungen konnten zeigen, daß die Anzahl der apoptotischen Zellen in der regenerierenden Leber in der mit 2-ME behandelten Gruppe nicht zunahm. Durch eine Färbung mit PCNA konnte die Proliferation der Hepatozyten nach Resektion und damit die Regeneration verdeutlicht werden. Hier war die Proliferationsrate unabhängig von der Behandlung mit 2-ME.

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Als wesentlichen Mechanismus der Wachstumshemmung von Tumorzellen durch 2-ME fanden wir die starke Induktion von Apoptose in allen Zellen, bis auf die relativ resistente Pankreaskarzinomzelllinie PaTu 8988s. Mit mehreren Untersuchungstechniken konnten wir die Apoptose nachweisen. Um die Mechanismen der Apoptoseinduktion zu untersuchen, führten wir Western Blot Untersuchungen durch, die Veränderungen des Expressionsmusters apoptosebezogener Proteine aufzeigen sollten. Wir fanden eine Induktion des p53 Proteins in den HCC Zelllinien, die den Wild-Typ p53 exprimieren. Die Pankreaskarzinomzellen waren alle mutiert für das p53 Gen, so daß hier nach 2-ME Behandlung p53 unabhängige Apoptose vorlag. Messungen des p21 Proteins, einem direkten Effektor von p53, zeigte, daß es parallel zu p53 hochreguliert wurde, was darauf schließen läßt, daß das hochregulierte p53 funktionell aktiv ist. In einer Zelllinie (SK-Hep 1) wurde das stärkste Antiapoptoseprotein bcl-2 herunterreguliert, was eine Förderung der Apoptoseinduktion nach sich zieht. Somit führen mehrere Mechanismen zum apoptotischen Zelltod.

Tierversuche an Nacktmäusen zeigten nicht nur, daß 2-ME Tumorzellen töten kann, sondern lassen auch Rückschlüsse für eine klinische Anwendung zu. So konnten wir zeigen, daß subcutane HCC Tumoren zu 55% und Lungenmetastasen von Pankreaskarzinomen und Bronchialkarzinomen um 59, bzw. 55% im Wachstum gehemmt werden konnten. Die Kombination mit dem p53 tragenden Adenovirus verringerte die Tumormasse um weitere 14%. Die gesamte Tumormasse konnte durch diese Kombination um das 336-fache gegenüber der Kontrollgruppe reduziert werden. Den beschriebenen antiangiogenetischen Effekt konnten wir weder beim Pankreaskarzinom, noch beim Bronchialkarzinom nachvollziehen. Die Tiere zeigten keinerlei klinisch apparente Nebenwirkungen wie Durchfall, Gewichtsverlust, Bewegungsarmut oder anderes. Die Kontrollgruppe der Tiere mit Lungenmetastasen vom Pankreaskarzinom hingegen zeigte eine deutliche Tumorkachexie mit 20%igem Gewichtsverlust im Vergleich zur Therapiegruppe.

Schlußfolgernd ist 2-ME eine Substanz, die von großem klinischen Interesse ist. Durch die hohe Wirksamkeit in vitro und in vivo bei gleichzeitig sehr geringen Nebenwirkungen wird sie derzeit in der Klinik in Phase I/II Studien getestet. Die orale Gabe macht die Durchführung der Therapie ambulant möglich. Kombinationen mit wirksamen zytostatischen Substanzen scheinen die Wirksamkeit bei Gleichbleiben der Nebenwirkungen noch zu verstärken. Besonders interessant scheint die Therapie bei multiresistenten Tumoren, wie sie beim Tumorrezidiv meist vorliegen.


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28.11.2006