Thema: 2-Methoxyestradiol als neue Substanz zur Behandlung solider Tumore

Habilitationsschrift

zur Erlangung der Lehrbefähigung
für das Fach

Chirurgie

vorgelegt dem Fakultätsrat der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dr. Guido Schumacher


geboren am 01.06.1963 in Bonn

Präsident: Prof. Dr. rer. nat. J. Mlynek

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Öffentlich-wissenschaftlicher Vortrag am: 12. Februar 2004

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. A.H. Hölscher
2. Prof. Dr. med. H.P. Bruch

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Allgemeinen Tumorproblematik
  • 1.2. Epidemiologie
    • 1.2.1. Genetische Faktoren
    • 1.2.2. Umweltfaktoren
      • 1.2.2.1. Rauchen
      • 1.2.2.2. Alkohol
      • 1.2.2.3. Diät
      • 1.2.2.4. Infektionen
      • 1.2.2.5. Sonnenexposition
      • 1.2.2.6. Andere Ursachen
  • 1.3. Onkogene und Tumorsuppressorgene
    • 1.3.1. Zellmutationen
    • 1.3.2. Onkogene
    • 1.3.3. Tumorsuppressorgene
  • 1.4. Zellzyklusregulatoren
    • 1.4.1. Das Tumorsuppressorgen p53
    • 1.4.2. Das Tumorsuppressorgen p21^WAF1
    • 1.4.3. Die bcl-2-Familie
  • 1.5. Solide Tumoren mit schlechter Prognose
    • 1.5.1. Das hepatozelluläre Karzinom (HCC)
    • 1.5.2. Das Pankreaskarzinom
    • 1.5.3. Das Bronchialkarzinom
  • 1.6. Neue Therapieansätze
    • 1.6.1. Hepatozelluläres Karzinom
    • 1.6.2. Pankreaskarzinom
    • 1.6.3. Bronchialkarzinom
  • 1.7. 2-Methoxyestradiol (2-ME)
• 2. Zielsetzung
• 3.  Material und Methoden
  • 3.1. Zelllinien
    • 3.1.1. Pankreaskarzinomzellen
    • 3.1.2. Zellen hepatozellulärer Karzinome
    • 3.1.3. Bronchialkarzinomzellen
    • 3.1.4. Normale humane Hepatozyten
  • 3.2. Kultur und Proliferationsanalysen
    • 3.2.1. Tumorzellen
    • 3.2.2. Humane Hepatozyten
  • 3.3. Therapeutische Substanzen
  • 3.4. Western Blot Analysen:
    • 3.4.1. Aussaat der Zellen, Behandlung und Herstellung des Zelllysats
    • 3.4.2. Messung der Proteinkonzentration
    • 3.4.3. Gelelektrophorese und Proteintransfer
    • 3.4.4. Sichtbarmachung der Proteinbanden
  • 3.5. AST-Messung:
  • 3.6. Apoptosenachweis mittels Fluoreszenzfarbstoff
  • 3.7. Immuncytologischer Apoptosenachweis
    • 3.7.1. Immunfluoreszenz-Färbungen:
  • 3.8. Zellzyklusanalysen
  • 3.9. Tierversuche
    • 3.9.1. Beschreibung und Haltung der Tiere
    • 3.9.2. Hepatozelluläres Karzinom
    • 3.9.3. Pankreaskarzinom
    • 3.9.4. Bronchialkarzinom
    • 3.9.5. Leberresektion zur Proliferationsuntersuchung
  • 3.10. Immunhistochemie
    • 3.10.1. Gefrierschnitte
    • 3.10.2. Paraffinschnitte
• 4.  Ergebnisse
  • 4.1. 2-ME zur Behandlung des hepatozellulären Karzinoms (HCC)
    • 4.1.1. Wachstumshemmung durch 2-ME beim HCC
    • 4.1.2. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Kernmorphologie
    • 4.1.3. Immunzytologischer Apoptosenachweis
    • 4.1.4. Messung der Zellschädigung mittels AST-Konzentrationen
    • 4.1.5. Zellzyklusanalysen
    • 4.1.6. Molekulare Veränderungen nach 2-ME-Gabe
    • 4.1.7. Wirksamkeit von 2-ME in vivo
  • 4.2.  2-ME zur Behandlung des Pankreaskarzinoms
    • 4.2.1. p53 Mutationsstatus verschiedener Zelllinien
    • 4.2.2. Wachstumshemmung durch 2-ME beim Pankreaskarzinom
    • 4.2.3. Induktion von Apoptose und Veränderungen des Zellzyklus durch 2-ME
    • 4.2.4. Apoptosenachweis durch immuncytologische TUNEL-Färbung
    • 4.2.5. Wirksamkeit von 2-ME in vivo
    • 4.2.6. Immunhistochemische Färbung zum Nachweis der Blutgefäße
    • 4.2.7. Kombinationstherapie aus 2-ME und anderen Zytostatika
    • 4.2.8. Apoptosenachweis nach Kombinationsbehandlung
  • 4.3. 2-ME zur Behandlung des Bronchialkarzinoms
    • 4.3.1. Kombination aus 2-ME und Gentherapie in vitro
    • 4.3.2. Kombination aus 2-ME und Gentherapie in vivo
  • 4.4. Wirkung von 2-ME auf multiresistente humane Zellen
    • 4.4.1. Cisplatinresistente Bronchialkarzinomzellen
    • 4.4.2. Multiresistente Pankreaskarzinomzellen
  • 4.5.  Toxizität von 2-ME in vivo
• 5.  Diskussion
  • 5.1. Steroide und Tumorwachstum
  • 5.2. Tumorhemmung durch 2-ME
  • 5.3. Kombination mit 2-ME und anderen tumorhemmenden Substanzen
  • 5.4. Wirkmechanismen von 2-ME auf Tumorzellen
    • 5.4.1. Antiangiogenetischer Effekt
    • 5.4.2. Hemmung der Mikrotubuli
    • 5.4.3. Induktion von Apoptose und molekulare Veränderungen
    • 5.4.4. Einfluß des p53
    • 5.4.5. Einfluß des bcl-2
    • 5.4.6. Zellzyklusarrest
    • 5.4.7. Andere Mechanismen
  • 5.5. Chemoresistenz und 2-ME
  • 5.6. Wirksamkeit von 2-ME in vivo und Einschätzung der Toxizität
  • 5.7. Tumorspezifität von 2-ME
  • 5.8. Potentielles Risiko durch 2-ME
  • 5.9. Klinischer Einsatz von 2-ME
    • 5.9.1. Phase I Studie beim metastasierenden Mammakarzinom
    • 5.9.2. Phase I Studie beim metastasierenden Mammakarzinom in Kombination mit Docetaxel
      • 5.9.2.1. Ein- und Ausschlußkriterien
      • 5.9.2.2. Behandlung mit Dosiseskalationsschema (Abbildung 37)
      • 5.9.2.3. Beobachtete Nebenwirkungen
      • 5.9.2.4. Metabolismus von 2-ME
      • 5.9.2.5. Pharmakokinetik von 2-ME
      • 5.9.2.6. Klinische Wirkung auf das Tumorwachstum
      • 5.9.2.7. Schlußfolgerung
• 6.  Zusammenfassung
• Literatur
• Danksagung
• EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG

Tabellen

• Tabelle 1  Auswahl von häufigen Onkogenen mit Angabe der assoziierten Tumoren.
• Tabelle 2  Auswahl von häufigen Tumorsuppressorgene mit Angabe der assoziierten Tumoren.
• Tabelle 3  Bislang untersuchte Wirkmechanismen von 2-ME auf Tumorzellen. Drei wesentliche Gruppen sind von Bedeutung.
• Tabelle 4  Prozentualer Anteil der Zellen in Sub-G1- bzw G1-Phase nach Behandlung mit PBS oder 2-ME.
• Tabelle 5 p53 Status in 4 humanen Pankreaskarzinomzelllinien.
• Tabelle 6  Prozentueller Anteil der apoptotischen Zellen nach Behandlung mit PBS, MEC oder 2-ME.
• Tabelle 7  Darstellung der relativen Zellzahlen in verschiedenen Zellzyklusphasen je nach Behandlungsgruppe
• Tabelle 8  Literaturübersicht verschiedener Tumore, die durch 2-ME erfolgreich in ihrem Wachstum gehemmt werden konnten.
• Tabelle 9  Kliniken der USA, in denen derzeit klinische Phase I oder Phase II Studien mit 2-ME durchgeführt werden.
• Tabelle 10  Beobachtete Nebenwirkungen bei insgesamt 15 Patienten. Praktisch alle der beobachteten Nebenwirkungen sind für Docetaxel bekannt.
• Tabelle 11  Wirkung der Kombinationstherapie auf das Tumorwachstum

Bilder

• Abbildung 1  Strukturformel von 2-Methoxyestradiol
• Abbildung 2  Normaler Zellzyklus somatischer Zellen mit den verschiedenen Phasen. G1-Phase (2n DNA): RNA und Proteine werden synthetisiert, nicht jedoch DNA. S-Phase (2-4n DNA): DNA Synthese. G2-Phase (4n DNA): Tetraploider Chromosomensatz komplett. M-Phase (4n → 2n DNA): Zellteilung. (G = Gap = keine DNA-Synthese; S = DNA-Synthese; M = Mitose).
• Abbildung 3  Proliferationsanalysen der vier verwendeten HCC Zelllinien. Nach Inkubation wurde über einen Zeitraum von 5 Tagen die Zellzahl bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Dreifachzählungen ± SEM (System Error of the mean). Die Dosen sind in µM angegeben.
• Abbildung 4  Phasenkontrastaufnahmen der SK-Hep1 Zelllinie nach 3-tägiger Behandlung mit A: PBS, B: MEC 1.5µM und C: 2-ME 1.5µM. Belichtungszeit: 1sec, Vergrößerung: 384-fach. Die Pfeile markieren typische apoptotische Zellen (4C).
• Abbildung 5  Fluoreszenzfärbung (Hoechst) der SK-Hep1 Zellen nach Behandlung mit A: PBS, B: MEC 2.0µM, C: 1.5µM 2-ME und D: 4.0µM 2-ME. Behandlungsdauer: 3 Tage. Vergrößerung; 384 fach. Unterschiede zu der regulären Kernstruktur, die auf Apoptose hinweisen, sind durch weiße Pfeile markiert.
• Abbildung 6  Fluoreszenzfärbung (Hoechst) der HepG2 Zellen nach Behandlung mit A: PBS, B: MEC 5.0µM und C: 5.0µM 2-ME. Behandlungsdauer: 3 Tage. Vergrößerung; 384 fach. Unterschiede zu der regulären Kernstruktur, die auf Apoptose hinweisen, sind durch weiße Pfeile markiert.
• Abbildung 7  Fluoreszenzfärbung (Hoechst) der Hep 3B Zellen nach Behandlung mit A: PBS, B: MEC 4.0µM, C: 2.0µM 2-ME und D: 4.0µM 2-ME. Behandlungsdauer: 3 Tage. Vergrößerung; 384 fach. Unterschiede zu der regulären Kernstruktur, die auf Apoptose hinweisen, sind durch weiße Pfeile markiert.
• Abbildung 8  Fluoreszenzfärbung (Hoechst) der PLC/PRF/5 Zellen nach Behandlung mit A: PBS, B: MEC 3.0µM, C: 3.0µM 2-ME und D: 4.0µM 2-ME. Behandlungsdauer: 3 Tage. Vergrößerung; 384 fach. Unterschiede zu der regulären Kernstruktur, die auf Apoptose hinweisen, sind durch weiße Pfeile markiert.
• Abbildung 9  Prozentualer Anteil der apoptotischen Zellen aller vier Zelllinien in den mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbten Zellkulturen. Die Zellzählung erfolgte geblindet durch zwei unabhängige Untersucher. Es wurden mindestens 500 Zellen pro Behandlungsgruppe ausgezählt. Die Dosierungen unter den Namen der Zelllinien entsprechen den Dosen 2-ME.
• Abbildung 10.1.-10.2.  Spezifische immunzytologische Färbungen zum Nachweis apoptotischer Zellen. Die verwendeten Dosen von 2-ME oder MEC betrugen für Sk-Hep 1 3,0µM und für Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 und den frischen humanen Hepatozyten 5,0µM. Der Behandlungszeitraum betrug 2 Tage. Die Färbung erfolgte für Apo 2.7 (A-C), Annexin V (D-F), oder TUNEL (G-I). Kontrolle mit PBS A, D, G, mit MEC B, E, H. Bei Vorliegen von Apoptose war eine spezifische Färbung vorhanden: Gelbe Punkte bei Apo 2.7 (C), rote Färbung bei Annexin V (F) und gelbe Punkte in der TUNEL Färbung (I).
• Abbildung 10.3.-10.4.  Spezifische immunzytologische Färbungen zum Nachweis apoptotischer Zellen. Die verwendeten Dosen von 2-ME oder MEC betrugen für Sk-Hep 1 3,0µM und für Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 und den frischen humanen Hepatozyten 5,0µM. Der Behandlungszeitraum betrug 2 Tage. Die Färbung erfolgte für Apo 2.7 (A-C), Annexin V (D-F), oder TUNEL (G-I). Kontrolle mit PBS A, D, G, mit MEC B, E, H. Bei Vorliegen von Apoptose war eine spezifische Färbung vorhanden: Gelbe Punkte bei Apo 2.7 (C), rote Färbung bei Annexin V (F) und gelbe Punkte in der TUNEL Färbung (I).
• Abbildung 10.5.  Spezifische immunzytologische Färbungen zum Nachweis apoptotischer Zellen. Die verwendeten Dosen von 2-ME oder MEC betrugen für Sk-Hep 1 3,0µM und für Hep G2, Hep 3B, PLC/PRF/5 und den frischen humanen Hepatozyten 5,0µM. Der Behandlungszeitraum betrug 2 Tage. Die Färbung erfolgte für Apo 2.7 (A-C), Annexin V (D-F), oder TUNEL (G-I). Kontrolle mit PBS A, D, G, mit MEC B, E, H. Bei Vorliegen von Apoptose war eine spezifische Färbung vorhanden: Gelbe Punkte bei Apo 2.7 (C), rote Färbung bei Annexin V (F) und gelbe Punkte in der TUNEL Färbung (I).
• Abbildung 11  Messung der AST-Gehalte im Überstand aus den Zellkulturen nach Behandlung mit PBS, MEC und 2-ME.
• Abbildung 12  Zellzyklusanalysen zur Bestimmung der einzelnen Zellzyklusphasen in Abhängigkeit der Behandlungsgruppen. Die Behandlungsdosen mit MEC oder 2-ME waren 1,5µM bei SK-Hep 1 Zellen, 2,5µM bei Hep G2, Hep 3B und PLC/PRF/5 Zellen für 3 Tage. Die Pfeile markieren die Sub-G1 Region, deren Zellgehalt durch apoptotische Zellen gebildet wird.
• Abbildung 13  Western Blot Analyse der SK-Hep 1 Zelllinie. Die geladene Proteinmenge betrug für p53 50µg, für p21 und bcl-2 100µg und für ß-Actin 10µg pro Bande.
• Abbildung 14  Western Blot Analyse der Hep G2 Zelllinie. Die geladene Proteinmenge betrug für p53 50µg, für p21 und bcl-2 100µg und für ß-Actin 10µg pro Bande.
• Abbildung 15  In vivo Versuch mit subcutanen Tumoren nach Injektion von Hep 3B Zellen bei weiblichen athymischen Nacktmäusen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM (System error of the mean).
• Abbildung 16  Abbildung aller Tiere nach Beendigung des Tierversuches. Eine Maus aus der Kontrollgruppe war eine Woche nach Versuchsbeginn aus unklaren Gründen verstorben.
• Abbildung 17  Proliferationsanalysen der vier verwendeten humanen Pankreaskarzinomzelllinien. Die Zellen wurden kontinuierlich 5 Tage lang mit unterschiedlichen Dosen 2-ME und MEC behandelt. (letzteres nicht abgebildet). Die abgebildeten Dosen sind in µM angegeben.
• Abbildung 18  Durchflußzytometrische Ergebnisse nach Behandlung der vier Pankreaskarzinomzelllinien PaTu 8902, PaTu 8988t, MIAPaCa-2 und PaTu 8988s. Links ist jeweils die Kontrollgruppe ohne Behandlung, in der Mitte die Gruppe nach Behandlung mit MEC und rechts die mit 2-ME behandelten Gruppen dargestellt. Die Pfeile markieren die Sub-G1 Region, in der Zellen mit geringem DNA-Gehalt auftreten, wie es bei apoptotischen Zellen typisch ist. Die Behandlungsdosen sind in µM unter den jeweiligen Graphiken dargestellt.
• Abbildung 19  TUNEL Färbung der vier verwendeten Zelllinien mit unterschiedlichen Behandlungsgruppen. A: Mit PBS inkubierte Kontrolle; B: Mit 16-Epiestriol (MEC) inkubierte Kontrolle; C: Mit 2-ME inkubiert; D: Mit DNase inkubiert. Die Dosen für MEC und 2-ME waren 1,5µM für MIAPaCa-2, 2µM für PaTu 8988t und PaTu 8902 und 10µM für PaTu 8988s.
• Abbildung 20  Prozentsatz apoptotischer Zellen nach Behandlung wie in Abbildung 19.
• Abbildung 21  Exemplarisch dargestellte Lungenlappen von Mäusen nach Beendigung der Versuche. A: Kontrollgruppe mit Fütterung von DMSO in Olivenöl; B: Behandlung mit 1mg 2-ME pro Maus täglich über 3 Wochen nach Injektion der Zellsuspension. Die Abbildung zeigt Lungenlappen von jeweils zwei verschiedenen Mäusen aus Gruppen von je 10 Tieren.
• Abbildung 22  Anzahl der Lungenmetastasen auf der Oberfläche aller 5 Lungenlappen aller Mäuse bei n = 10 pro Gruppe. (* = p< 0,0005).
• Abbildung 23  Darstellung der Dichte der Blutgefäße im Tumor mit einer Färbung für CD31.
• Abbildung 24  Balkendiagramm der Auszählung der Gefäßdichte innerhalb der Tumoren der beiden Behandlungsgruppen. Die Error bars zeigen die SEM. (p < 0.06 im Students t-Test).
• Abbildung 25  Proliferationsanalysen der zwei Zelllinien AsPc-1 (A-D) und MIAPaCa-2 (E-H) nach 5 tägiger Behandlung mit 2-ME alleine (A, E) oder kombiniert mit Gemcitabine (B, F), Taxol (C, G) oder C225 (D, H). Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (System error of the mean).
• Abbildung 26  Wachstumsanalysen von A549 Zellen nach 5-tägiger Behandlung mit 1µM 2-ME, Ad-p53 30 MOI (multiplicity of infection), oder der Kombination aus beiden.
• Abbildung 27  Anzahl der Lungenmetastasen auf der Oberfläche aller 5 Lungenlappen pro Tier bei 10 Tieren pro Gruppe. Dargestellt sind Mittelwerte ± SD. * = signifikant weniger Kolonien als unbehandelte Kontrollen (p < 0,0001); ** = signifikant weniger Kolonien als 2-ME alleine (p < 0,05).
• Abbildung 28  Lungenmetastasen auf der Oberfläche von je zwei representativen Tieren aus verschiedenen Behandlungsgruppen makroskopisch (A-C) und immunhistochemisch mit H&E Färbung (D-F). Kontrollgruppe: A,D; 2-ME alleine: B,E; 2-ME + Ad-p53: C,F.
• Abbildung 29  Färbung von Lungenmetastasen für das p53 Protein ohne Behandlung (A) und mit 2-ME Behandlung (B). Die Pfeile markieren auf p53 positiv gefärbte Zellen. Schnitte mit CD31 zur Darstellung der Gefäße gefärbt (C-E). C: unbehandelt, D: mit 2-ME alleine behandelt, E: mit 2-ME und Ad-p53 behandelt.
• Abbildung 30  H1299 Bronchialkarzinomzellen resistent bei 2,0µg/ml Cisplatin nach 5 Tagen Behandlung mit 2-ME in unterschiedlichen Konzentrationen. Die Konzentrationen sind in µM angegeben. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.
• Abbildung 31  H1299 Bronchialkarzinomzellen resistent bei 2,0µg/ml Cisplatin nach 5 Tagen Behandlung mit 2-ME 1.0µM, Ad-p53 MOI 1 oder der Kombination aus beiden. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.
• Abbildung 32  Resistenzniveau der drei Zellklone eines humanan Pankreaskarzinoms EPP85-181P (sensibel), EPP85-181RDB (mdr-1 Gen positiv) und EPP85-181RNOV (mdr-1 Gen negativ). Insbesondere der mdr-1 Gen positive Klon EPP85-181RDB zeigte eine hohe Resistenzrate gegen die meisten Zytostatika.
• Abbildung 33  Bestimmung der IC50 der drei Klone des humanan Pankreaskarzinoms EPP85-181P (sensibel), EPP85-181RDB (mdr-1 Gen positiv) und EPP85-181RNOV (mdr-1 Gen negativ). Man erkennt eine komplette Sensibilität gegenüber 2-ME. (2-ME: 2-Methoxyestradiol; 16-E: 16-Epiestriol).
• Abbildung 34  Representative Fotographien von histologischen Schnitten von Mauslebern aus allen Behandlungsgruppen mit TUNEL Färbung auf Apoptose (A, C, E, G, I) und auf Proliferation (PCNA) (B, D, F, H, J). Vergrößerung: 512 fach. Ohne 2-ME und ohne Resektion: A, B; mit 2-ME ohne Resektion: C, D; ohne 2-ME mit Resektion: E, F; mit 2-ME mit Resektion: G, H; positive Kontrollen: I, J. Die Pfeile zeigen apoptotische Zellen.
• Abbildung 35  Prozentsatz apoptotischer Zellen in der Leber in allen Behandlungsgruppen. Positive Kontrolle: Mit DNase vorbehandelte Lebern. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM (System Error of the Mean).
• Abbildung 36  Prozentsatz der aktiv proliferierenden Zellen in den verschiedenen Behandlungsgruppen. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM.
• Abbildung 37  Therapieschema der Kombinationsbehandlung aus 2-ME und Docetaxel