Schwarzer , Evelin: Malariapigment Hemozoin und die funktionelle Hemmung von Monozyten

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Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

2.1 Der asexuelle Parasiten-Zyklus

Durch den Stich der Anopheles-Mücke gelangt der Malaria-Parasit, das einzellige Plasmodium, als Sporozoit in die Blutbahn des Menschen. Der Sporozoit dringt sofort in den Hepatozyten ein, um den Attacken des Immunsystems des Wirtes zu entgehen. Hier vermehrt er sich intrazellulär und prägt einen Phänotyp aus, der ihn nach Verlassen des Hepatozyten befähigt, die eigentliche Wirtszelle, den Erythrozyten zu befallen. Der aus dem Hepatozyten freigesetzte Merozoit wird in einem Endozytose-ähnlichen Prozeß in den Erythrozyten aufgenommen und beginnt seinen 48 Stunden währenden asexuellen intraerythrozytären Vermehrungszyklus, an dessen Ende 16-32 neue Merozoiten die Wirtszelle verlassen, um in neue Erythrozyten einzudringen. Während dieser 48 Stunden durchläuft der Parasit morphologisch gut abgrenzbare Entwicklungsstadien. In den ersten 18-24 Stunden erscheint er als in das erythrozytäre Zytosol eingebetteter Ring, was ihm seinen Namen gab. Er beginnt seine eigene Plasmamembran und die ihn umgebende Erythrozytenmembran für einen regen Stoffaustausch mit der Wirtszelle umzustrukturieren und baut seine 'food vacuole' auf, in der Aufnahme und Verdau von Hämoglobin stattfinden werden. Nach 18-24 Stunden tritt der Parasit in eine regere mRNA- und Proteinsynthese ein und baut nun in seinen 'food vacuoles' intensiv Wirtszellhämoglobin ab. Er wird ab jetzt als reifer Trophozoit bezeichnet und ist vom Ringstadium abgrenzbar durch eine Reihe neu auf der Erythrozytenmembran exprimierter Parasiten-Antigene und die Präsenz des braunen pseudokristallinen Malariapigments (Hämozoin), dem Hämablagerungsprodukt des Parasiten. Vielfältige Stoffwechselprozesse sichern die Synthese der Membran für den wachsenden Parasiten.

Während die aus dem Globinabbau des Hämoglobins stammenden Aminosäuren sofort für die eigene Proteinsynthese wiederverwendet werden, kann der Parasit die Hämkomponente nicht abbauen, da ihm die Häm-Oxygenase-Aktivität fehlt, die in Eukarionten gemeinhin den Häm-Abbau zu Biliverdin unter Freisetzung von CO und freiem Eisen katalysiert. Das in erheblichen Mengen beim Hämoglobinabbau freigesetzte Häm wäre jedoch zytotoxisch für den Parasiten (Fitch et al., 1982), so daß er evolutionär erfolgreich die Strategie der Ablagerung von Häm in unlöslicher Form entwickelt hat. Häm wird als monomeres


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Ferriprotoporphyrin-Hydroxid (Brémard et al.,1993) oder aber als polymeres beta-Hämatin (Slater et al.,1991; Bohle et al., 1997) dicht gepackt als Pseudokristall in den 'food vacuoles' des Trophozoiten abgelagert und verbleibt in den 'food vacuoles' bis während der Kernteilung nach 36 Stunden (Schizogonie, deren Resultat der Schizont ist) die Fusion der 'food vacuoles' zu einer einzigen großen Residual-Vacuole erfolgt, die sämtliches Hämozoin einschließt (Olliaro und Goldberg,1995). Diese Vacuole wird spontan freigesetzt und rupturiert, wenn der reife Schizont 48 Stunden nach Infektion des Erythrozyten aufplatzt und die infektionsfähigen Merozoiten herausschleudert. Die bei der Vakuolenruptur freigesetzten 'residual bodies' enthalten neben aggregiertem Hämin eine Anzahl angelagerter Komponenten (Lipide, Phospholipide, Proteine) parasitären oder Wirts-Ursprungs. Jeweils zum Zeitpunkt der Schizontenruptur tritt beim Wirt einer der charakteristischen Fieberschübe auf.

Es sind die Blut-Stadien des Plasmodiums, Ringform, Trophozoit, Schizont, Merozoit und die 'residual bodies', die während der Malariainfektion mit dem Monozyten/ Makrophagen- System in Wechselwirkung treten. Die Ringform ist durch Hämozoin-Freiheit und eine begrenzte Anzahl von Oberflächen-Antigenen, der Trophozoit und der Schizont hingegen sind durch Hämozoin-Präsenz und eine stark modifizierte Erythrozyten-Oberfläche durch das massenhafte Auftreten von 'Malaria-Antigenen' charakterisiert.

2.2 Das Malariapigment Hämozoin

Das als Malaria-Pigment bezeichnete Hämozoin wird allgemein als die inerte, nicht toxische hochmolekulare Speicher- oder besser Ablagerungsform des Häms aus dem Abbau des Hämoglobins der Wirtszelle betrachtet.

Während der 48-stündigen Entwicklung des Plasmodium im Erythrozyten baut der Parasit die Globinketten von etwa 75% des Wirtszell-Hämoglobins proteolytisch in seiner sauren 'food vacuole' ab. Dabei wird eine Flut von Häm (ca.15 mM) freigesetzt, welches aufgrund seiner Wechselwirkung mit Membran und DNA für den Parasiten letal wäre. Die 'Entgiftung' des Häms ist für den Parasiten überlebenswichtig, nur fehlt ihm scheinbar, wie


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erwähnt, die in Eukarionten für diese Aufgabe zuständige Häm-Oxygenase-Aktivität. Deshalb entwickelte der Malariaparasit in der Evolution die Strategie, Häm als unlösliche pseudo-kristalline Aggregate in seiner 'food vacuole' abzulagern. Wenn etwa 20 Stunden nach Eindringen in die Wirtszelle der Hämoglobinabbau in der 'food vacuole' des Parasiten ein entsprechendes Ausmaß erreicht hat, werden diese Häm-'Kristalle' lichtmikroskopisch als dunkelbraune Aggregate, als das Malaria-Pigment oder Hämozoin, in den reifen Trophozoiten sichtbar.

Obwohl zahlreiche frühe Studien Ferriprotoporphyrin IX als wichtigen Bestandteil des Hämozoins beschrieben haben (Deegan und Maegraith,1956), existieren bis heute widersprüchliche Ansichten zum Kristallisationsprozeß und zur exakten molekularen Struktur des Eisenporphyrins im Hämozoin. In der Regel wurde isoliertes Hämozoin diversen recht unterschiedlichen Extraktionsmethoden unterworfen, ehe die analytische Arbeit am dennoch einheitlich als Hämozoin bezeichneten Material zum Teil widersprüchliche Resultate zu Tage förderte (review 8). Modernere Arbeiten, die natives Hämozoin mit Resonanz-Raman Mikrospektrometrie, elektronenparamagnetischer Resonanzspektrometrie und magnetischer Suszeptibilitätsmessung untersuchten, beschreiben Ferriporphyrin IX als high-spin Monomer von Eisen(III)-protoporphyrin-Hydroxid (Brémard et al.,1993). Während des Globinabbaus in der sauren 'food vacuole' müssen also voluminöse, sperrige Substituenten die räumliche Isolierung der Häm-Moleküle sichern, um die µ-oxo-Dimerisierung des Häms zu verhindern, die sonst zwangsläufig bei der Autoxidation von Hämoglobin auftritt. Als Abstandhalter kämen die Nicht-Häm-Bestandteile im nativen Hämozoin in Frage, d.h. die 65 Gewichts-prozent Protein, die 5,9 Gewichtsprozent Kohlenhydrat und 0,1 Gewichtsprozent Lipid und Nukleinsäuren. Als 'Apoprotein' im Hämozoin wurden bisher sowohl partiell proteolytisch abgebaute Globinketten des Hämoglobins (Goldie et al.,1990) als auch vom Parasiten neu synthetisierte Eisen- bzw. Häm-bindende Proteine (Ashong et al.,1989) beschrieben. Die Frage bleibt, ob diese Bestandteile des Hämozoins von funktioneller Relevanz während seiner Entstehung sind oder ob sie nachträglich oder sogar artifiziell während der Hämozoinisolierung dank ihrer hohen Affinität zum Häm angelagert wurden. Die kürzlich von Sullivan et al. (1996) gefundenen Histidin-reichen Proteine HRP I und II im Plasmodium geben Anlaß zu der Vermutung, daß es sich dabei um funktionell notwendige Häm-bindende Proteine handelt. Ihr Nachweis im Hämozoin steht jedoch noch aus.

Im Gegensatz zu Brémards monomeren high-spin-Ferriporphyrin-Modell als


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Grundstruktur des Hämozoins steht das allgemein akzeptierte Strukturmodell, demzufolge das zentrale high-spin Eisen eines Porphyrinringes mit der Carboxylgruppe des Propionylrestes des nächsten Porphyrinringes eine schwache Bindung eingeht und so Hämscheibe über Hämscheibe stapelnd das Längenwachstum von beta-Hämatin erfolgt. Kristallografische und spektroskopische Untersuchungen an synthetischen beta-Hämatin lassen Wasserstoffbrücken zwischen den freien Propionylresten benachbarter Häminketten vermuten (Bohle et al., 1997). Im Unterschied zum zuvor beschriebenen Kristallisationsmodell, in dem Häm-bindende Proteine die Rolle von Kristallisationskeimen übernehmen, könnten im 'Bohle-Modell' Carboxylsäuren und/oder Aminosäuren in der 'food vacuole' des Parasiten die Solubilisierung und den Phasenübergang von Hämatin zu beta-Hämatin bewirken (Adams et al.,1996).

Die Aufklärung der Struktur und des Syntheseprozesses von Hämozoin sind von großem Interesse, da Hämozoin in drei grundlegenden Prozessen der Malaria eine zentrale Rolle eingeräumt wird und man sich therapeutische Ansätze verspricht.

Erstens wird Hämozoin in Verbindung gebracht mit den 'Malaria-Toxinen', welche im Wirt die Produktion endogener Pyrogene, wie TNF, MIP-1alpha und MIP-1beta induzieren und damit die periodischen Fieberschübe verursachen (Sherry et al.,1995) aber auch die Komplikationen der Malaria auslösen, wie die TNF-verursachte Hemmung der Erythropoiese als Ursache der Malaria-Anämie (Martiney, personal communication). Hämozoin selbst induziert in isolierten Monozyten/Makrophagen die Bildung der Cytokine und nimmt Einfluß auf die Thermoregulation. Bislang gibt es keinen klaren experimentellen Beleg, daß das Merozoiten-Membran-assoziierte Glycosylphosphatidylinositol-Toxin, welches in Makrophagen die Zytokinfreisetzung induziert (Schofield et al, 1993), bei der Hämozoin-bedingten Zytokin-Produktion eine Rolle spielt .

Zweitens ist Hämozoin die Überlebensstrategie des Parasiten. Herkömmliche Anti-Malariamittel wie Chlorochin behindern die Anlagerung von Häm an wachsendes Hämozoin durch Bindung an Häm und setzen zusätzlich Häm aus Hämozoin frei. Die erhöhte freie Hämkonzentration führt zur Lyse der Membran im Schizonten und zur Hemmung der Proteasen des Parasiten (Pandey und Chauhan, 1998).

Drittens, und dieses wird Gegenstand der vorliegenden Arbeit sein, ist Hämozoin nicht nur inertes Ablagerungsprodukt von Häm sondern ein wirksames Mittel des Parasiten, die


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Immunantwort des Wirtes zu kontrollieren.

2.3 Zur Rolle peripherer Monozyten bei der Malaria

Die Zell-vermittelte Immunität in nicht-immunen Malariapatienten wird von peripheren, zirkulierenden Blut- und residenten Gewebsphagozyten getragen, diese Phagozyten stellen die vorderste Front in der Immunabwehr des Menschen gegen den Parasiten dar. Sie erkennen den parasitierten Erythrozyten als fremd und attackieren ihn mit den ihnen eigenen und gegen jeden Fremdkörper gerichteten Abwehrprozessen: die Produktion von Sauerstoffradikalen für die extrazelluläre Schädigung bzw.Vernichtung und die Phagozytose (Allison and Eugui,1983; Perrin et al.,1982). Im peripheren Blut im Tiermodell und in Gewebsschnitten bei P. falciparum-Malaria wurden sogenannte 'crisis-forms' der Parasiten nachgewiesen. Das sind verklumpte, aggregierte intraerythrozytäre Parasiten, die durch das Einwirken von Radikalen morphologisch beschädigt wurden (Ockenhouse et al., 1984). Zudem wurden bei P. falciparum-Malaria im peripheren Blut, in Milz, Niere, Lunge, Leber, im Knochenmark und im Cerebralendothel Phagozyten gefunden, die vollgestopft mit parasitierten und nicht-parasitierten Erythrozyten waren (Pongponratn et al.,1987; Aikawa et al.,1980). Die Phagozytose von Parasiten läßt sich leicht durch den Gehalt an dunkelbraunen Hämozoinkristallen im Monozyten nachweisen. Hämozoin gelangt bei der Phagozytose von Hämozoin-haltigen Trophozoiten oder ‘residual bodies‘ als natürliche Phagozytosetargets in den Monozyten.

Hinweise über den Aktivitätszustand des Monozyten/Makrophagen-Systems im Menschen kommen vor allen aus klinischen Studien. Im Serum von Patienten mit akuter Malaria wurden erhöhte Konzentrationen von Syntheseprodukten aktivierter Phagozyten, wie Sauerstoffradikale (Descamps-Latscha et al., 1987) und Zytokine (Urquhart, 1994) gefunden.

Die Produktion von TNF-alpha und IL-1 durch aktive Makrophagen und Monozyten wird als Startpunkt der Entzündungsreaktion bei der Malaria betrachtet. TNF induziert Fieber, die Produktion von Akut-Phasen-Proteinen, die Aktivierung von Monozyten und Neutrophilen, die Expression der endothelialen Leukozyten-Adhäsionsmoleküle, die Proliferation von Lymphozyten, führt zur Produktion von IL-1 und IL-8 (Chemotaxin für


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Neutrophile) durch Makrophagen , Monozyten und Endothelzellen und triggert die Degranulation der Neutrophilen und den 'oxydativen burst'. IL-1 induziert die hepatozytären Akut-Phasen-Proteine, endotheliale Zellmembranrezeptoren für Neutrophile, beeinflußt die Endothelpermeabilität und löst die spezifische T- und B-Zell- Proliferation nach Antigenkontakt aus. Schließlich induzieren IL-1 und TNF gemeinsam die Produktion des 'platelet aggregation factor' (PAF) und chemotaktisch aktiver Arachidonsäuremetaboliten im Endothel, was zur Akkumulation von Neutrophilen und zur erhöhten Koagulationsbereitschaft führt. Die aufgeführten TNF- bzw. IL-1-abhängigen Prozesse fördern die Vernichtung des Parasiten durch das Immunsystem des Wirtes, werden allerdings bei überschießender Aktivität erheblich zum Pathomechanismus der Malariakomplikationen beitragen.

Die Phagozytenaktivität ist bei Erstinfektion mit Malaria am höchsten und sinkt mit jeder weiteren Infektion ab (Brown et al., 1990), was wir mit der Akkumulation von Hämozoin in den Phagozyten und der damit verbundenen Funktionseinschränkung in Zusammenhang bringen. Im Tiermodell wurde der gleiche Verlauf der Immunantwort gefunden (Jayshree et al., 1989).

Jüngere Studien zur Zytokinfreisetzung aus Hämozoin-beladenen Monozyten demonstrieren die vermehrte Freisetzung von TNF-alpha, MIP 1-alpha und -beta und IL-1beta, aber auch von IL-10 und IL-12 nach Hämozoinphagozytose (Pichyangkul et al., 1994, Sherry et al., 1995; Mordmüller et al., 1998) und korrelieren den Schweregrad der Erkrankung mit der Hämozoinbeladung peripherer Leukozyten.

Monozyten/ Macrophagen sind befähigt, parasitäre Antigene über den MHC Klasse II- Komplex zu präsentieren. Eine beeinträchtigte zelluläre Immunantwort während der Malaria läßt sich aus der verminderten T-Zell-Proliferation in Malaria-infizierten Mäusen ableiten (Greenwood et al., 1971). In alten Studien von Warren und Weidanz (1976) wurde eine Hemmung der akzessorischen Funktion der Milz-Makrophagen/Monozyten von akut Malaria-Infizierten beobachtet, was zur Hemmung der T-Zell-Proliferation beitragen könnte.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Literatur reichlich Daten zur veränderten Immunantwort während der akuten Malaria-Erkrankung liefert, welche sehr komplexe Prozesse erfassen, die zweifelsohne von großem Wert für die Beschreibung der Krankheit


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sind. Studien auf zellulärer Ebene hingegen sind rar, nur diese jedoch sind aus meiner Sicht geeignet, die komplizierte und komplexe Wechselwirkung zwischen Parasit und Wirt grundlegend zu erhellen, um gezielt und erfolgreich zu intervenieren.
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