Schwarzer , Evelin: Malariapigment Hemozoin und die funktionelle Hemmung von Monozyten

Kapitel 3. Methodische Grundlagen und Neuentwicklungen

3.1 Zellen und Hämozoin (1-11)

Plasmodien

Für sämtliche Arbeiten mit Plasmodium falciparum wurden die Stämme FCR-3 und Palo Alto aus in vitro-Kulturen genutzt. Diese Parasiten dienten als Ausgangsmaterial sowohl für die Reife-Separation der Parasiten über Percoll als auch für die Isolierung des Malariapigmentes Hämozoin nach Lyse der Trophozoiten oder Schizonten im hypotonen Puffer. Bei der Isolierung und Vorbereitung des Hämozoins für die Phagozytose durch den Monozyten

wurde Wert darauf gelegt, Material zu gewinnen, welches dem nach Schizontenruptur freigesetzten Hämozoin physikalisch und chemisch nahe kommt und während der Malariainfektion der Phagozytose unterliegt. Um eine gute Modellsubstanz für 'in vivo-Hämozoin' zu erzeugen, wurde auf die in der Regel angewandte Extraktion von Proteinen und Lipiden durch Behandlung des Hämozoins mit Proteasen und SDS verzichtet. Die Lagerung erfolgte in Gegenwart von Radikalfängern und unter Sauerstoffausschluß.

Makrophagenmodell

Voruntersuchungen an der relativ differenzierten humanen monozytären Zellinie THP-1 zur Intaktheit der Zellfunktionen ergaben eine unzureichende Stimulierbarkeit des 'oxidativen burst'. Auch die langzeitige Behandlung der Zellen mit niedrigdosierten Phorbolester konnte, entgegen der in der Literatur beschriebenen Effekte, eine nur sehr


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mäßige 'burst'-Kapazität induzieren. Für Studien von monozytären Prozessen, die von Peroxydationen beeinflußt werden, schieden diese Zellen mithin als Modell aus. Alle übrigen getesteten humanen monozytären Zell-Linien wichen in ihren funktionellen Eigenschaften stärker von den Monozyten ab als THP-1 und kamen somit nicht in Betracht.

Alle Untersuchungen wurden deshalb ausschließlich an Monozyten durchgeführt, die aus dem peripheren Blut des Menschen isoliert wurden. Um ruhende, gut stimulierbare, Lymphozyten-arme und wenig Oberflächen-modifizierte Monozytenpräparationen zu erhalten kamen nach initaler Routineseparation von peripheren mononukleären Zellen schließlich 3 Methoden zur Anwendung: 1. Separation über diskontinuierliche Dichte-Gradienten. 2. Dichtetrennung unter hypertonen Bedingungen. 3. Separation basierend auf Oberflächen-Antigen- Erkennung.. Die Monozyten wurden in vitro in Suspension auf Teflon-dishes oder adherent im Serum-freien Medium bis zu 7 Tagen im 5% CO2/Luft-Gemisch im Zell-Inkubator bei 37 °C gehalten. Diese Zellen dienten uns als Modell für zirkulierende periphere Monozyten bzw. residente Makrophagen des Menschen. Adhärente, in vitro aus Monozyten entstandene Makrophagen wie auch resuspendierte Monozyten zeigten die gleichen Hemmeffekte durch Hämozoin, lediglich die Basisiaktivität des 'burst' war in adhärenten Zellen geringer. Da keine qualitativen Unterschiede zwischen suspendierten und adhärenten Zellen nachweisbar waren, wird in der vorliegenden Arbeit generell von Monozyten gesprochen, ungeachtet der Tatsache, daß die Ergebnisse an beiden Zellqualitäten gewonnen wurden, wie im Detail in den Originalarbeiten ausgeführt wird. An dieser Stelle sei auf die in den Originalarbeiten beschriebenen neuen Protokolle zur Langzeit-Kultivierung der Monozyten in Suspension verwiesen (1,6,9).

3.2 Quantifizierung von Häm (4)

Für die Quantifizierung von Häm-haltigen Substanzen oder Zellen, wie Hämozoin oder Erythrozyten, entwickelte ich eine auf Luminol-abhängiger Lumineszenz basierende quantitative Analysetechnik für Häm. Häm katalysiert die Übertragung eines Elektrons von dem relativ stabilen tert-Butylhydroperoxid auf Luminol, welches dadurch zum


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chemilumineszenten Luminol-Anion wird. Die gemessenen Chemilumineszenz verhält sich proportional zur Menge des eingesetzten Häms. Dieses Verfahren zeichnet sich durch hohe Empfindlichkeit und Zeitökonomie aus. Außerdem ermöglicht es die präzise Quantifizierung von Häm-haltigen Verbindungen im Monozyten nach ihrer Phagozytose und zwar unabhängig von der Integrität der phagozytierten Zelle, was einen erheblichen analytischen Vorteil gegenüber der zeitaufwendigen mikroskopischen Analytik bietet, die nur weitestgehend intakte intramonozytäre Erythrozyten zu erfassen vermag. Die Empfindlichkeit der Analytik erlaubt es ebenfalls, die exakte Anzahl der adhärenten Monozyten im 'well' zu bestimmen, da der Cytochromgehalt die Quantifizierung über Häm gestattet. Deshalb wurde die Lumineszenz-Methode für die Quantifizierung der Phagozytose von Erythrozyten oder Hämozoin durch die Monozyten adaptiert.

3.3 Hämfreisetzung aus Lysosomen

An dieser Stelle sei auf die in den Originalarbeiten beschriebenen neuen Protokolle zur Immunpräzipitation der PKC des Monozyten (7) und zur Isolierung von Lysosomen aus Hämozoin-beladenen Monozyten und der Freisetzung von Häm aus isolierten monozytären Lysosomen (10) verwiesen.


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Wed Oct 18 9:17:57 2000