Schwarzer , Evelin: Malariapigment Hemozoin und die funktionelle Hemmung von Monozyten

Kapitel 4. Hämozoin und Phagozytenfunktion

Hämozoin wird als inert und unschädlich betrachtet, solange es eingeschlossen in der parasitären 'food-vacuole' vorliegt. Es gibt jedoch keine Studien zu Hämozoin-bedingten Schäden in der letzten Entwicklungsphase des Parasiten. Hämozoin wird bei der Phagozytose von Trophozoiten oder nach Schizontenruptur als 'residual body' in den Phagozyten aufgenommen.


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4.1 Die Phagozytose von parasitierten Erythrozyten in vitro und die Persistenz von Hämozoin im Monozyten. Zur Rolle der Häm-Oxygenase (1,10)

Humane Monozyten phagozytieren unter Kulturbedingungen genauso gut wie in vivo parasitierte Erythrozyten und freies Hämozoin. Das Ausmaß der Phagozytose wird vom Reifegrad des Parasiten bestimmt. Ein Monozyt phagozytierte etwa 4 Ringe oder 10 reife Trophozoiten oder Hämozoin in einer Menge, die 10 Erythrozyten, bezüglich des Häm-Gehaltes entspräche.

Der Verdau der aufgenommenen parasitierten Erythrozyten wurde mit dem von nicht-parasitierten Kontroll-Erythrozyten verglichen, die entweder durch oxidativen Stress (Diamid-Inkubation) Oberflächen-modifiziert und nach Opsonisierung via Fc-oder Komplement-Rezeptor (CRI) phagozytiert wurden oder durch anti-D IgG-Opsonisierung ausschließlich über den Fc-Rezeptor aufgenomen wurden. Der Verdau der phagozytierten Erythrozyten bzw. des Hämozoins wurde als Häm-Abbau gemessen.

Im Unterschied zu beiden Kontrollen, deren Häm-Abbau erwartungsgemäß sehr schnell war (90% der Erythrozyten wurden mit einer Halbwertszeit von unter 30 min abgebaut, 10% mit

10 h), zeigen parasitierte Erythrozyten in Abhängigkeit von ihrem Hämozoin-Gehalt eine viel langsamere Abbaukinetik. So wurden reife Hämozoin-haltige Trophozoiten nur zu 21% mit einer Halbwertszeit von 1 h abgebaut, während 79% des Häms über 2 Tage nahezu stabil im Monozyt verblieb. Phagozytiertes isoliertes Hämozoin wurde im Monozyten abgelagert ohne nachweisbaren Häm-Abbau. Hämozoin-freie Ringe hingegen unterliegen in etwa der gleichen Abbau-Kinetik wie Kontroll-Erythrozyten.

Offensichtlich ist Hämozoin im Monozyten nicht abbaubar, obwohl Trophozoiten oder isoliertes Hämozoin 20 min nach ihrer Phagozytose regulär mit dem Lysosom fusionieren und das Hämozoin für wenigstens 7 Tage im Lysosom nachweisbar bleibt (Confocal-Mikroskopie, unveröffentlicht, Schwarzer). Der von einigen Parasiten genutzte 'escape'-Mechanismus, der intrazellulären Verdauung durch Hemmung der Fusion zwischen Endo-und Lysosom zu entgehen, spielt für Plasmodium falciparum keine Rolle. Was hindert den Monozyten also am Hämozoinabbau?

Mit Kontroll-Erythrozyten in das Lysosom gelangtes Hämoglobin unterliegt nach


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Aktivierung der lysosomalen Protonenpumpe dem proteolytischen Abbau, bei dem Häm in erheblichen Konzentrationen freigesetzt wird, was einerseits das Häm-abbauende Enzym, die Hämoxygenase-1 (HO-1), induziert, und welches andererseits als Substrat der mikrosomalen HO-1 von dieser zu Biliverdin abgebaut wird. Ich unternahm einige Anstrengungen , um vom regulären Abbau abweichende Prozesse in Hämozoin-beladenen Monozyten zu finden.

  1. Das Porphyrin im von uns isolierten Hämozoin besteht ausschließlich aus nicht-modifiziertem Häm, was spektrophotometrisch abgesichert wurde. Darüberhinaus erwies sich in vitro solubilisiertes Hämozoin als gutes Substrat für aus Rattenleber isolierte, Co-induzierte, mikrosomale HO-1. Der Nachweis erfolgte über die Messung der HO-1-Aktivität als Syntheserate des Bilirubins. Bilirubin wurde differentialspektrophotometrisch quantifiziert und nach erfolgter Reaktion spektralanalytisch nachgewiesen.
  2. Die HO-1 wird in Monozyten 6 h nach Phagozytose von Kontroll-Erythrozyten induziert und erscheint in der mikrosomalen Zellfraktion, nachweisbar im Western blot und im Confocal-Mikroskop mit spezifischen Antikörpern. Diese Induktion unterbleibt vollständig, wenn analoge Häm-Mengen in Form von Hämozoin phagozytiert werden. Auch Trophozoiten sind nicht in der Lage, die HO-1 zu induzieren. Hämozoin-beladene Monozyten können aber sehr wohl die HO-1 exprimieren, wenn ihnen exogenes Häm oder exogen solubilisiertes Hämozoin zugesetzt wird. Hämozoin interferiert mithin nicht mit Induktion und Expression der HO-1.
  3. Die fehlende Induktion der HO-1 in Hämozoin-beladenen Monozyten wird offensichtlich durch die ausbleibende Freisetzung von Häm aus Hämozoin verursacht.
    In vitro-Studien zur Häm-Freisetzung aus isolierten Hämozoin-haltigen Lysosomen, die aus Monozyten präpariert wurden, die Hämozoin phagozytiert hatten, bestätigten die ausbleibende Häm-Freisetzung. Hingegen wird während der in vitro-Inkubation aus Erythroyzten-haltigen Lysosomen reichlich Häm freigesetzt. Die ausbleibende Freisetzung des Häms aus Hämozoin kann lysosomal bedingt oder Hämozoin-immanent sein.
  4. Die Hämozoin-beladenen Lysosomen sind funktionell intakt hinsichtlich ihrer Protonenpumpe, die zur regulären Ansäuerung führt (Confocal-Studie mit DAMP, was sich im sauren Kompartiment anreichert, unpubliziert, Schwarzer) und hinsichtlich ihrer proteolytischen Aktivität. Die an Hämozoin angelagerten Proteine sind 24 h nach

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    Phagozytose komplett abgebaut (elektrophoretischer Nachweis), trotzdem erfolgt keine Häm-Freisetzung.
  5. Die Struktur des Hämozoins selbst sollte für die Stabilität des Hämozoins gegen seinen Abbau verantwortlich zu machen sein. Den Proteinen des Hämozoins scheint keine Bedeutung für die Stabilität des Häm-Kernes zuzukommen. Wie schon im intralysosomalen Protein-Verdau gezeigt, sind Hämozoin-Proteine auch im in vitro-Verdau von Hämozoin in Gegenwart von Cathepsinen, Nukleasen und Carboxypeptidasen unter lysosomalen Bedingungen gut abbaubar. Es gibt auch in vitro bei saurem pH keine Freisetzung von Häm aus Hämozoin, wohl aber aus unter gleichen Bedingungen inkubiertem Hämoglobin. Hämozoin, im Unterschied zu Hämoglobin disaggregiert nicht unter lysosomalen Bedingungen, um Häm freizusetzen, welches das Lysosom verlassen und an der endosomalen HO-1 katabolisiert werden könnte. Die Stabilität des Hämozoins im Lysosom sollte allein den physikalischen Eigenschaften von aggregiertem Häm zuzuschreiben sein, dessen Löslichkeitsprodukt keine Freisetzung von Häm bei leicht saurem pH zuläßt.

Die Intaktheit sämtlicher Häm-Abbauprozesse in Hämozoin-beladenen Monozyten eröffnet die Möglichkeit des Einsatzes von Substanzen, die lysosomal zur Auflösung des Hämozoins führen, was von therapeutischem Wert sein könnte.

4.2 Die Hemmung der Phagozytose durch intrazelluläres Hämozoin (1)

Die Ablagerung von Hämozoin im Lysosom hat für den Monozyten erhebliche funktionelle Konsequenzen. Die initiale Phagozytose von Hämozoin-haltigen Trophozoiten oder von isolierten Hämozoin führte zur Beladung der Lysosomen mit Hämozoin, infolgedessen die Zelle keinen neuen Phagozytose-Zyklus aufnehmen konnte. 24, 48 oder 72 Stunden nach initialer Phagozytose wurden den Monozyten erneut Kontroll-Erythrozyten zugesetzt und die Phagozytose durch Quantifizierung des intramonozytären Häm-Gehaltes bestimmt. Initial zugesetzte Kontroll-Erythrozyten waren nach 24 h komplett abgebaut, und über Fc-und CRI-Rezeptoren wurde die initiale


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Phagozytosekapazität von 4 Erythrozyten per Monozyt in jedem weiteren Phagozytosezyklus erreicht. Analog dazu sind Monozyten nach initialer Ring-Phagozytose nach 24 h wieder vollständig Phagozytose-bereit, und nehmen in jedem Zyklus etwa 4 Erythrozyten per Monozyt auf, die sie komplett abbauen. Die Beladung der Monozyten mit Hämozoin im initialen Phagozytosezyklus führt hingegen zum vollständigen Verlust der Phagozytosefähigkeit über den gesamten Untersuchungszeitraum von 72 h ohne Tendenz zur Reversibilität der Funktionseinschränkung. Das heißt nach einmaliger Phagozytose von reifen Malaria-Parasiten ist der Monozyt oder Makrophage weder in der Lage, weitere Malariaparasiten, noch Bakterien, Pilze oder andere Parasiten im Rahmen von Sekundärinfektionen durch Phagozytose zu attackieren. Unsere These wurde aufgegriffen und fand unter Kulturbedingungen Bestätigung (Fiori et al., 1993).

4.3 Die Hemmung des 'oxydativen burst' durch intrazelluläres Hämozoin (1,2)

Die initiale 'burst'- Aktivität des Monozyten ist Ausdruck der Sauerstoffradikal-Freisetzung im Prozess der Phagozytose und kann als Luminol-abhängigen Lumineszenz quantitativ erfaßt werden. Die Phagozytose von Kontroll-Erythrozyten durch die Monozyten wurde von einem 30-minütigen geringen, aber meßbaren Anstieg der Luminol-abhängigen Lumineszenz begleitet, was auf eine geringfügige Sauerstoffradikal-Produktion hinwies. Demgegenüber löste die Phagozytose von Hämozoin eine 6-fach höhere und vergleichsweise langanhaltende (bis zu 2 Stunden) Radikalproduktion aus. Nach dieser Zeit sinkt die Radikalproduktion auf basale Werte. Die massive initiale Radikalbelastung des Monozyten während der Phagozytose von Hämozoin muß als eine wichtige Ursache der intrazellulären Modifikationen, die zum Funktionsausfall der Hämozoin-beladenen Monozyten führen, angesehen werden.

Die Fähigkeit des Monozyten auf Stimulation mit einer erhöhten Sauerstoffradikal-Produktion und -Freisetzung zu antworten, wurde durch Zusatz von diversen löslichen Agonisten überprüft, die zur Monozytenaktivierung führen. Ein gutes Maß für die Kapazität der Zelle zu 'bursten', unabhängig von eventuellen Strukturveränderungen an der


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Membran, ist der Phorbolester (PMA)-induzierte burst. Unter Umgehung der Membranprozesse in der Signal-übertragung wird mit Phorbolestern die Protein Kinase C direkt aktiviert, was die maximale Aktivierung der NADPH-Oxydase und damit die Superoxid-Radikal-Produktion zur Folge hat, die als Luminol-abhängige Lumineszenz quantifiziert wurde und um 1-2 Größenordnungen über der des 'initialen bursts' liegt . In den ersten 10 min der Phagozytose war die 'burst'-Kapazität gleich der von ruhenden Monozyten und sank in allen phagozytierenden Monozyten, unabhängig vom phagozytierten Material, kontinuierlich von 30 min bis 4 h nach Phagozytose auf 50% des Ausgangswertes. Während die 'burst'-Kapazität in Monozyten, die Kontroll-Erythrozyten phagozytiert hatten, nach 4 h wieder anstieg, um nach 24 h ihren Ausgangswert von vor der Phagozytose zu erreichen, fiel der PMA-induzierte 'burst' in Hämozoin-beladenen Monozyten bis 12 h nach Phagozytose auf 25% ab und zeigte während 48 h keine Erholungstendenz. Der nahezu vollständige Verlust der Induzierbarkeit des 'burstes' geht einher mit der Unfähigkeit des Hämozoin-beladenen Monozyten, das extrazelluläre Wachstum von Mikroorganismen zu kontrollieren, wie Fiori et al. 1993 in vitro zeigen konnten.

4.4 Die Hemmung der Interferon-induzierten Expression von MHC Klasse II (9)

Eine der immunologischen Funktionen der Monozyten/Makrophagen ergibt sich aus seiner Fähigkeit, Antigene über MHC Klasse II-Moleküle auf der Zelloberfläche zu präsentieren. Wir überprüften in vitro den Einfluß von Hämozoin auf die Expression von MHC Klasse II auf der Zell-Oberfläche des Monozyten nach geeigneter Stimulation. Der Monozyt phagozytierte im experimentellen Ansatz Hämozoin, Kontrollmonozyten hingegen Latexpartikel oder Erythrozyten. Nach 48-stündiger Stimulation mit Interferon-gamma (gamma-IFN) wurde die Expression der MHC Klasse II-Moleküle auf der Zell-Oberfläche mittels Antikörpern im Durchflußzytometer quantifiziert. Während in Monozyten nach Latex- oder Erythrozyten-Phagozytose die MHC II-Expression nach Interferon erwartungsgemäß stark zugenommen hatte, blieb sie in Hämozoin-beladenen Zellen nach gamma-IFN-Stimulation basal niedrig. Aufgrund der konstanten Expression anderer Oberflächenmarker können wir ausschließen, daß ein Phagozytose-bedingter Oberflächenverlust die Ursache für das


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vollständige Ausbleiben der Stimulierbarkeit der MHC II-Expression nach Hämozoin-Aufnahme in den Monozyten ist. Vielmehr konnten wir mittels quantitativer RT-PCR nachweisen, daß in Hämozoin-beladenen Zellen die Induktion von MHC Klasse II-spezifischer mRNA durch gamma-IFN ausblieb. Die Expression der MHC II-spezifischen mRNA lag in gamma-IFN-stimulierten Kontroll-Monozyten wenigstens 3-fach höher als in stimulierten Hämozoin-beladenen Zellen. In bakteriellen oder parasitären Erkrankungen sollte die Stimulierbarkeit der Expression von MHC II für die korrekte und effiziente Antigen-Präsentation und die adäquate TH-Zell-Proliferation von Bedeutung sein, um die Erkrankung und Sekundärinfektionen erfolgreich zu kontrollieren.

Die gefundene deutliche Reduktion der Expressionsmöglichkeit von MHC II durch Interferon in Hämozoin-beladenen Monozyten sollte eine Erklärung liefern für den bei Malaria beobachteten Defekt in der T-Zell-Aktivierung. Die eingeschränkte Funktion der Monozyten als Antigen-präsentierende Zelle während der Malaria könnte Konsequenzen für die Kontrolle der Infektion haben, wie in weiterführenden Experimenten zu zeigen sein wird.

4.5 Die Hemmung der Expression von ICAM-1 und CD11c (12)

Die Expression einer Reihe von Oberflächen-Antigenen des Monozyten, denen Aufgaben in der Phagozytose zukommen, wie CD16 und CD32 (niedrig-affine Fc-Rezeptoren, effektive Bindung von Immunkomplexen), CD64 (hochaffiner Rezeptor für IgG), CD 11b (Rezeptor für Complement iC3b/CR3), CD35 (Rezeptor für Complement C3b und C4b/ CR1) und CD36 (non-class-A scavenger Rezeptor) oder in der Monozyt-Lymphozyt -Wechselwirkung beteiligt sind (MHC Klasse I, CD54 (ICAM-1) und CD11c (p150,95 integrin), wurde in Hämozoin-beladenen Monozyten überprüft.

Hämozoin-abhängige Effekte wurden nur in der Expression von CD54 (ICAM-1) und CD11c (p150,95 integrin) gefunden.

Hämozoin bewirkte in Monozyten die 'down-Regulation' von CD11c auf der Zelloberfläche. CD11c gehört zur den beta-Integrinen und wurde kürzlich als Ligand für ICAM-1 charakterisiert.


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In Hämozoin-beladenen Monozyten war die reifungsabhängige Zunahme der Expression von ICAM-1, wie sie in Kontroll-Monozyten beobachtet wurde, vollständig aufgehoben. ICAM-1 trägt als Adhäsionsmolekül zur effizienten Interaktion zwischen der Antigen-präsentierenden Zelle und dem Lymphozyten bei, und verstärkt das Signal des T-Zell-Rezeptors, was eine stärkere Proliferation der T-Zelle zur Folge hat. Die Hämozoin-bedingte niedrige Expression von ICAM-1 im Monozyten könnte eine weitere Erklärung für die mangelhafte T-Zell-Proliferation bei der Malaria darstellen.

Unter dar Annahme einer ähnlich verminderten Expression von ICAM-1 im Endothel nach Hämozoin-Endozytose, würde dies zusätzlich einen wirksamen Hämozoin-bedingten Schutzmechanismus für den Wirt darstellen. Ockenhouse et al. verwiesen 1992 auf die mögliche Rolle von endothelialem ICAM-1 bei der Bindung parasitierter Erythrozyten während der Pathogenese der Cerebralmalaria. Infolge der Störung des Gleichgewichtes zwischen Parasit und Wirt, beispielsweise durch überschießende Zytokinproduktion, wird ICAM-1 vermehrt im Endothel exprimiert und es kommt zum Verstopfen der Kapillaren durch parasitierte Erythrozyten und zur schwer verlaufenden Cerebral-Malaria.

4.6 Vitalität der Hämozoin-beladenen Monozyten (1,8)

Ehe die Ursache für die Hämozoin-bedingte Funktionseinschränkungen behandelt werden, bedarf es der Erklärung, daß die mit Hämozoin beladenen Zellen selbstverständlich vital sind, was aus dem Adhärenz-Verhalten, den stabilen intrazellulären Konzentrationen von ATP und DNA und einer intensiven Protein-de novo-Synthese abgeleitet werden kann. Bis zu 3 Tagen waren keine Anzeichen von Apoptose in Hämozoin-beladenen Monozyten nachweisbar.


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