Schwarzer , Evelin: Malariapigment Hemozoin und die funktionelle Hemmung von Monozyten

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Kapitel 5. Molekulare Targets für Hämozoin

Einmal in das Phagolysosom des Monozyten in seiner nativen, nicht aufgereinigten Form aufgenommen, kann Hämozoin für den Monozyten gefährlich werden, es besitzt alle Bestandteile eines potenten Radikalproduzenten: aggregiertes Hämin, ungesättigte Fettsäuren und in Spuren freigesetztes Eisen. Da eine generalisierte, unspezifisch-toxische Wirkung des Hämozoins auf die Zelle wegen der nachgewiesenen Vitalität auszuschließen war, suchte ich nach einer Schädigung oxydationsempfindlicher Enzyme, die eine Schlüsselposition in den gehemmten Stoffwechselwegen Phagozytose, 'burst' und MHC II-Expression einnehmen.

5.1 Die NADPH-Oxydase (6)

Der 'oxydative burst' ist abhängig von der Synthese von Superoxid-Radikalen durch die NADPH-Oxydase (NOX). Das Enzym besteht aus den 3 membranständigen Untereinheiten des Cytochrom b558, welches das aktive Zentrum der NOX enthält. Die NOX wird aktiviert, indem ihre cytosolischen Untereinheiten p47phox, p67phox und p21rac als Aktivierungskomplex zur Membran transloziert werden und an Cytochrom b558 binden. Die Phosphorylierung der p47phox durch die Protein Kinase C (PKC) ist in intakten Zellen für den regelrechten Zusammenbau und die Aktivierung der NOX essentiell, kann aber in vitro im Zell-Lysat durch SDS-Aktivierung umgangen werden. Die SDS-stimulierbare NOX-Aktivität wird als maximale NOX-Aktivität definiert und photometrisch gemessen.

Hämozoin bewirkt parallel zum Abfall des PMA-induzierbaren 'burst' die Reduktion der maximalen NOX-Aktivität um 50% in den ersten 2 h nach Phagozytose. Die NOX-Aktivität sank nicht weiter, während der 'oxydative burst' auf 25% der Kontrollaktivität bis 12 h nach Phagozytose abfiel. In Rekonstitutionsexperimenten mit Zellkompartimenten konnte ich die Ursache für den Aktivitätsverlust der NOX einer cytosolischen Untereinheit zuordnen.

Phosphorylierungsexperimente in intakten Monozyten mit (32P)-Orthophosphat oder in


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Zellkompartimenten mit (gamma-32P)-ATP ergaben, daß die p47phox-Untereinheit bis 12 h regulär PKC-abhängig phosphoryliert wurde. Zu einem späteren Zeitpunkt ließ sich keine Phosphorylierung mehr nachweisen. Exogene PKC ist jedoch in der Lage, die p47phox-Phosphorylierung vollständig zu rekonstituieren.

Meine Befunde zeigen:

  1. Eine schnelle Modifikation an einer cytosolischen Untereinheit durch Hämozoin führt zum fehlerhaften Zusammenbau an der Membran und Aktivitätsverlust der NOX.
  2. Diese Schädigung betrifft nicht die Phosphorylierungsstelle der p47phox.
  3. Es gibt einen Langzeitdefekt der p47phox-Phosphorylierung in der Zelle, der PKC-bedingt sein sollte.
  4. Die zusätzliche Inhibition der PKC durch Hämozoin erklärt die differenten Kinetiken der 'burst'- und NOX-Hemmung.

5.2 Die Protein Kinase C (3,7)

Die Protein Kinase C (PKC) kontrolliert im Monozyten maßgeblich die Aktivität des 'oxydativen burst' und der Phagozytose und spielt bei der Regulation der Expression des MHC Klasse II- Komplexes eine Rolle. Wegen ihrer zentralen Stellung in der Regulation und ihrer Empfindlichkeit gegen Oxydation zogen wir sie als Target für die Hämozoin-Wirkung in Betracht. Die Aktivierung der PKC erfolgt durch intrazelluläre Translokation vom Zytosol zur Membran, ihre Inaktivierung durch proteolytische Spaltung an der Membran.

Ich konnte zeigen, daß die Membran-assoziierte PKC nach nur 30-minütigem Anstieg nach Hämozoin-Phagozytose im Monozyten schnell und irreversibel inaktiviert wurde. Nach einstündiger Hämozoin-Präsenz war nur noch 40% der initial membranständigen PKC nachweisbar und ab 5 h nur noch 20%. Auf diesem Niveau verblieb die membranständige PKC über 24 h ohne Tendenz zum Wiederanstieg. Aus der Phagozytose von Kontroll-Erythrozyten resultierte hingegen eine bedeutend längere initiale Ativierungsphase der PKC mit einem sich anschließenden Aktivitätsabfall über 5 h. Nach


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12 h werden die Ausgangswerte der PKC wieder erreicht.

Der Gehalt und die Translozierbarkeit der zytosolische PKC, die als Reservoir für die Aktivierung der PKC in der Zelle aufzufassen ist, blieb über 12 h nach Hämozoin-Phagozytose unverändert und war nach 24 h drastisch reduziert. Der Einsatz von Radikalfängern und Antioxydantien läßt als Ursache für die Verminderung aktiver, membranständiger PKC einen erhöhten Abbau der kontinuierlich translozierten PKC an der Membran vermuten, was durch Radikal-bedingte Modifikationen in den Cystein-reichen Regulationsdomänen der PKC erklärbar ist. Eine artifizielle Modifikation der PKC, wie sie bei Zellaufschluß in Gegenwart von Hämozoin wahrscheinlich wäre, ist durch die Messung der PKC mittels (3H)-Phorbolester in intakten Monozyten ausgeschlossen.

Die Verringerung des aktiven PKC-pools gibt eine gute Erklärung für die Funktionsausfälle in 'burst', Phagozytose und MHC II- Expression des Monozyten nach Hämozoin-Phagozytose.


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Wed Oct 18 9:17:57 2000