Schwarzer , Evelin: Malariapigment Hemozoin und die funktionelle Hemmung von Monozyten

Kapitel 6. Molekulare Mechanismen der Inhibition durch Hämozoin

Hämozoin mit seinem eisenreichen, kompakten Porphyrinkern, umgeben von angelagerten Lipiden, bietet beste strukturelle Voraussetzungen für die Bildung von Sauerstoffradikalen, zumal im Lysosom Spuren von Eisenionen freigesetzt werden, wie ich im in vitro-Modell-Versuch belegen konnte (weniger als 1% des Gesamteisens im Hämozoin werden initial pro Stunde freigesetzt). Hinzu kommt die vergleichsweise hohe Produktion von Superoxidradikalen während des initial die Hämozoin-Phagozytose begleitenden 'burst'. Via Haber-Weiss-Reaktion können so Hydroxyl-Radikale und Singulett-Sauerstoff entstehen, die zur Lipid-Peroxydation führen.


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6.1 Die Lipidperoxydation (1,7,8)

Die antioxydativen Mechanismen des Monozyten sind überlastet und es erfolgt eine überschießende Lipid-Peroxydation, nachdem Hämozoin in den Monozyten aufgenommen wurde. Tatsächlich stieg im Monozyten der Lipoperoxidgehalt auf das 6-fache während der ersten 12 h nach Hämozoin-Phagozytose und blieb über 2 Tage unverändert hoch. Monozyten, die unter gleichen Bedingungen Kontroll-Erythrozyten in vergleichbaren Mengen bezüglich des Häm-Gehaltes phagozytiert hatten, zeigten einen moderaten (2-fachen), transienten Anstieg, der nur bis 12 h nach Phagozytose nachweisbar war. 24 h nach Phagozytose wurde der basale Wert von ruhenden Monozyten wieder erreicht.

Auch in vitro war die Hämozoin in Gegenwart von Wasserstoffperoxid ein potenter Induktor der Lipid-Peroxydation in Erythrozyten-'ghosts' oder Liposomen. Die Lipid-Peroxydation konnte erfolgreich durch Eisenkomplexierung mit Desferrioxamin verhindert werden.

Die Rolle von freiem Eisen bei den Funktionseinschränkungen wird unterstrichen durch die Experimente mit Hämozoinkristallen, von deren Oberfläche Eisen partiell abgereichert wurde. Dieses so behandelte Hämozoin war ein schwächerer Inhibitor des 'oxydativen burst' als natives Hämozoin. Die Entfernung von labil gebundenem Eisen konnte die Hemmung des 'burst' jedoch nicht komplett aufheben. Freies Eisen spielt im Peroxydationsprozess mithin eine potenzierende Rolle, wohingegen das in der Porphyrinstruktur des Hämozoins gebundene Fe3+ den größeren Anteil an den Peroxydations-bedingten Hemm-Effekten hat. Es wird also nicht ausreichend sein, Eisen-Komplexbildner für die Aufhebung der Funktionseinschränkung einzusetzen, sondern das Ziel muß die Depolymerisation des Hämozoins sein.

6.2 Die Bildung von 4-Hydroxynonenal und Hydroxynonenal-Addukten (7)

Zwangsläufiges Folgeprodukt der Lipid-Peroxydation von omega-vielfachungesättigten Fettsäuren wie Linol-, Arachidon- oder gamma-Linolensäure in Zellen ist das


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4-Hydroxynonenal (4-HNE), welches hochreaktiv an Thiol- oder Aminogruppen bindet und dadurch biochemische Effekte auf enzymatischer, subzellulärer und zellulärer Ebene verursacht.

Hämozoin-Beladung von Monozyten führt folgerichtig nach einem raschen Anstieg in der Konzentration der Lipoperoxide zu einer drastischen Erhöhung des gebildeten 4-HNE. Quantifiziert wurde 4-HNE nach Zellextraktion, Reextraktion nach TLC-Separation und HPLC-Auftrennung. Bei vereinfachter Annahme einer Gleichverteilung des 4-HNE im Monozyten, würden Konzentrationen von 8 µM, 46 µM und 16 µM nach 2, 5 und 12 Stunden der Hämozoin-Präsenz im Monozyten erreicht. Der Referenzwert im ruhenden Monozyten lag bei 1µM und ist repräsentativ für das Gleichgewicht von Synthese und Abbau des 4-HNE in dieser Zelle. Die hohen Werte im Hämozoin-beladenen Monozyten sind erstaunlich, da der stoffwechselmäßig gut an oxydative Belastungen angepaßte Monozyt im allgemeinen in der Lage ist, die mit jeder Phagozytose einhergehende Sauerstoffradikalproduktion und die daraus resultierende Lipid-Peroxydation und 4-HNE-Synthese gut zu kontrollieren. Die Phagozytose von Kontroll-Erythrozyten hebt den HNE-Spiegel in der Zelle tatsächlich nur auf maximal 4 µM an. Es muß an dieser Stelle eingefügt werden, daß die lokalen HNE-Konzentrationen natürlich erheblich höher sein könnten, da HNE aufgrund seiner lipophilen Eigenschaften in der Membran akkumulieren sollte (experimentell nicht belegt).

Eine hohe initiale katabolische Aktivität für HNE von 24 nmol/min/1 Mio Zellen (gemessen als Abnahme des exogen den Monozyten zugesetzten HNE) macht ein alleiniges Überschreiten der Abbaukapazität durch vermehrte 4-HNE-Synthese im Hämozoin-beladenen Monozyten unwahrscheinlich. Vielmehr spricht die Abbaukinetik im Hämozoin-beladenen Monozyten für die zusätzliche Hemmung des HNE-Katabolismus durch Hämozoin, was den 50-fachen Anstieg des HNE-Spiegels in diesen Zellen erklärt. Der schnelle Anstieg des HNE-Spiegels nach Hämozoinphagozytose läuft zeitlich parallel mit der Hemmung des PMA-induzierten 'oxidativen burst' und der Hemmung der PKC im Monozyten.

Ich konnte zeigen, daß HNE konzentrationsabhängig die PKC-Aktivität hemmt, gemessen als Histon-Phosphorylierung im in vitro-assay. Die PKC wurde bei Zusatz von nur 10 nM 4-HNE um 30 % gehemmt, eine Konzentration, die in ruhenden Zellen lokal durchaus zu erwarten ist, was deshalb in der PKC-Regulation unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielen dürfte. HNE in Konzentrationen von über 10 µM hemmen die PKC-Aktivität


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zu über 95 %. Diese Konzentrationen sind in der oxydativ gestreßten Zelle durchaus plausibel. 4-HNE hat je nach Zelltyp und Konzentration die verschiedensten Auswirkungen auf das Wachstum und die Proliferation von Zellen und auf die Gen-Expression.

Ich konnte erstmals das vermehrte Auftreten von intrazellulären Addukten zwischen PKC und HNE in Hämozoin-beladenen Zellen nachweisen (Immunpräzipitation der PKC und Immunoblot mit monoklonalen Antikörpern gegen 4-HNE-Histidin/Lysin-Addukte).

Die vergleichsweise höheren Affinität des 4-HNE zur Thiol-Gruppe des Cysteins im Vergleich zu Lysin oder Histidin erlaubt den Schluß, daß in Hämozoin-beladenen Zellen auch die Thiol-Gruppe der PKC mit 4-HNE reagiert. Die PKC besitzt einige für ihre Funktion essentielle Thiolgruppen, die im reduzierten Zustand vorliegen müssen, um die enzymatische Aktivität aufrechtzuhalten. Die von uns in vitro beobachtete Hemmung der PKC durch 4-HNE sollte deshalb durch die Bindung des 4-HNE an diese SH-Gruppen entstehen.

Die von mir beobachtete Addukt-Bildung sollte mithin der Schlüssel zum molekularen Verständnis der PKC-Hemmung im Hämozoin-beladenen Monozyten sein.

6.3 15-Hydroxyeicosatetraensäure [15-HETE] (11)

Der PMA-induzierte 'oxydative burst' ist 20 min nach Phagozytose von nativem Hämozoin zu 50-60 % gehemmt bezogen auf den Ausgangswert. Die schnelle Hemmung sollte durch einen Bestandteil der Lipidfraktion des Hämozoins ausgelöst werden, da die Phagozytose von delipidierten Hämozoin zu einem langsameren und weniger ausgeprägten Abfall des 'burst' führt .

Die Lipidfraktion des isolierten Hämozoins enthält Derivate der Linolen- und Arachidonsäure, deren Verteilungsmuster typisch für die Häm-katalysiert Oxydation der erythrozytären Membranfettsäuren ist. Die Trennung des 15-HETE-peaks aus der SP-HPLC ergab in der Chiral-Phasen-HPLC eine Gleichverteilung der R- und S-Enantiomere, was die Lipoxygenase-unabhängige Häm-Katalyse unterstreicht. Bei einem Gehalt von 0.24 mmol bioaktiven 15S-HETE per mol Häm im Hämozoin würde eine Hämozoin-


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Phagozytose in der Größenordnung von 10 Erythrozyten-Äquivalenten per Monozyt eine intrazelluläre Konzentration von 10 µM ergeben. Ich konnte zeigen, daß eine HETE-Konzentration von 0.8 µM ausreicht, den PMA-induzierten 'burst' in Monozyten zu 40-50% zu hemmen. Mithin sollte das Molekül stromab der PKC in die Signaltransduktion eingreifen. Bei Hämozoin-Phagozytose in die monozytäre Plasmamembran diffundierendes 15-HETE sollte Ausfälle des oxydativen 'burst' verursachen, wie wir sie beschrieben haben.
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