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Kapitel 2. Patienten und Methoden

2.1 Patientenkollektiv

Von Januar 1993 bis Juli 1998 wurden 137 Männer mit rezidivierten und/oder refraktären malignen Keimzelltumoren in der Abteilung Innere Medizin mit Schwerpunkt Hämato-logie/Onkologie (Leiter: Prof. Dr. med. D. Huhn), Universitätsklinikum Charité/Virchow-Klinikum, Humboldt-Universität Berlin, mit drei bis vier Zyklen einer konventionellen "salvage" Chemotherapie behandelt. Die Separation peripherer Blutstammzellen erfolgte nach dem ersten Zyklus der Chemotherapie, bei Bedarf auch nach weiteren Zyklen. Siebzehn Patienten konnten für die vorliegende Analyse wegen unvollständiger Daten-dokumentation oder Progression ihrer Erkrankung nicht berücksichtigt werden, da bei Nichtansprechen der Krankheit auf eine Blutstammzellseparation und Hochdosis-chemotherapie in der Regel verzichtet wurde. Somit verblieben 120 Patienten für die Analyse zur Mobilisation und Separation zirkulierender Blutstammzellen. Von diesen Patienten wurden 101 Patienten nach Abschluß der konventionellen "salvage" Chemo-therapie einer Hochdosischemotherapie mit nachfolgender Transplantation autologer Blutstammzellen zugeführt. Letztlich konnten 96 Patienten in die Analyse der hämato-poetischen Rekonstitution und der Supportivtherapie aufgenommen werden.

2.2 Mobilisierungschemotherapie

Es wurden drei "salvage" Chemotherapieregime zur Mobilisation peripherer Blutstamm-zellen eingesetzt:

1. Cisplatin, Etoposid, Ifosfamid (PEI).

2. Taxol, Ifosfamid, Cisplatin (TIP).

3. Taxol, Ifosfamid (TI).

Einen Tag nach Beendigung der Chemotherapie erfolgte die erste subkutane Gabe von G-CSF: Patienten mit PEI und TIP erhielten 5 µg/kg/d und TI-Patienten 10 µg/kg/d. Die Applikation von G-CSF wurde in gleicher Dosierung bis zum Abschluß der Apheresen fortgeführt.

2.2.1 Cisplatin, Etoposid und Ifosfamid (PEI)

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Sechsundsechzig Patienten erhielten drei Zyklen PEI mit jeweils Cisplatin 20 mg/m², Etoposid 100 mg/m² und Ifosfamid 1,2 g/m² an den Tagen 1-5 (Abbildung 1). Cisplatin und Etoposid wurden als 1-h-Infusion, Ifosfamid als 2-h-Infusion verabreicht.

Abbildung 1. Ablauf der chemotherapeutischen Behandlung mit PEI und Hoch-dosis-CEI (Carboplatin, Etoposid, Ifosfamid)

2.2.2 Taxol, Ifosfamid und Cisplatin (TIP)

Sechsundzwanzig Patienten wurden mit drei Zyklen TIP und jeweils Taxol 175 mg/m² (1-h-Infusion) am Tag 1, Ifosfamid 1,2 g/m² (2-h-Infusion) und Cisplatin 20 mg/m² (1-h-Infusion) an den Tagen 2-6 behandelt (Abbildung 2).

2.2.3 Taxol und Ifosfamid (TI)

Achtundzwanzig Patienten erhielten einen Zyklus TI mit Taxol 175 mg/m² als 1-h-Infusion und Ifosfamid 5,0 g/m² als 22-h-Infusion am Tag 1. Darauf folgten drei weitere Zyklen TIP (Abbildung 3).

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Abbildung 2. Ablauf der chemotherapeutischen Behandlung mit TIP und Hoch-dosis-CET (Carboplatin, Etoposid, Thiotepa)

Abbildung 3. Ablauf der chemotherapeutischen Behandlung mit TI/TIP und Hochdosis-CET (Carboplatin, Etoposid, Thiotepa)

2.3 Bestimmung zirkulierender Blutstammzellen

Die Zahl der peripheren Blutstammzellen wurde im Labor für Durchflußzytometrie (Prof. Dr. med. S. Serke), Abteilung Innere Medizin mit Schwerpunkt Hämatologie/Onkologie, Virchow-Klinikum, Humboldt-Universität, durch den Nachweis des Antigens CD34 auf der Oberfläche der Leukozyten bestimmt und uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Zur Beschreibung der Methodik sei an dieser Stelle auf die Literatur verwiesen (57, 122).

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2.4 Separation zirkulierender Blutstammzellen

Die Sammlung der peripheren Blutstammzellen wurde mittels Leukapherese an den Zell-separatoren Fresenius AS104^® (Fresenius NPBI, Dreieich) oder COBE Spectra^® (COBE BCT, Planegg-Martinsried) durchgeführt (123, 124). Während einer 150-270 minütigen Leukapherese wurden im Median 11 l (6-16) Venenblut mit einer Geschwindigkeit von 40-70 ml/min über zwei Kubitalvenen der Arme oder einen doppelläufigen zentral-venösen Katheter, jeweils für Entnahme und Rückgabe, prozessiert. Um katheter-assoziierte Komplikationen wie Thrombose, Infektion, Blutung und Pneumothorax, sowie die Gabe von Heparin zur Katheterpflege zu vermeiden, wurden wenn möglich periphere Venenzugänge gelegt. Bei schlechten Venenverhältnissen erfolgten die Leukapheresen über großvolumige Katheter (GamCath Catheters^®, JOKA GmbH, Hechingen).

2.5 Kryokonservierung und Lagerung peripherer Blutstammzellen

Vor der Kryokonservierung wurden die Leukaphereseprodukte gegebenenfalls durch Zentrifugation (2.000 U/min, 10 min) auf ein Volumen von etwa 70 ml eingestellt und in einen Kryokonservierungsbeutel überführt (Gambro, Hechingen; Baxter Biotech, Unter-föhring). Kurz vor Beginn des Einfriervorgangs wurden 30 ml einer gekühlten Dimethyl-sulfoxid Lösung (DMSO 33,3%, Apotheke, Virchow-Klinikum) zur ebenfalls vorgekühlten Zellsuspension in den Einfrierbeutel gegeben. Nach gründlichem Durchmischen wurden drei bis fünf Pilotröhrchen mit jeweils 1 ml Zellsuspension gefüllt, um zu einem späteren Zeitpunkt Analysen aus kryokonserviertem/aufgetautem Material durchführen zu können. Der kontrollierte Einfriervorgang, wobei in 85 min -101°C erreicht wurde, fand in einem automatischen Gerät statt (Messer Griesheim, Mudersbach). Danach wurden die Blutstammzellprodukte und Pilotröhrchen in einen speziellen Tank mit flüssigen Stick-stoff (N₂) eingelagert (-196°C).

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2.6 Laboratoriumsuntersuchungen zur Qualitätskontrolle der Stammzellprodukte

2.6.1 Untersuchungen vor Kryokonservierung

Folgende Parameter wurden vor Kryokonservierung aus den Leukaphereseprodukten bestimmt: Leukozyten/µl, Thrombozyten/µl, Hämoglobin mg/dl und Hämatokrit (%) am Zell-Analysegerät NE-7000^® (TOA Sysmex, Kobe, Japan), MNC (%) nach mikrosko-pisch-manueller Auswertung von May-Grünwald gefärbten Blutausstrichen und CD34+ Zellen am Durchflußzytometer (FACScan^®, Becton Dickinson, San Jose, USA). Die Gesamtzahl der MNC und CD34+ Zellen des jeweiligen Blutstammzellprodukts ergab pro kg Körpergewicht die gesammelte individuelle Zelldosis eines Patienten. Desweiteren wurden für die Sterilitätsprüfung der einzelnen Produkte aerobe und anaerobe Blutkulturflaschen (BCB System^®, Hoffmann-La Roche, Grenzach-Wyhlen) mit jeweils 1 ml Zellsuspension beimpft und an das Institut für Mikrobiologie und Hygiene, Virchow-Klinikum, Humboldt-Universität, weitergeleitet (125).

2.6.2 Untersuchungen nach Kryokonservierung

Aus dem Inhalt von kryokonservierten/aufgetauten Pilotröhrchen eines jeden Stammzell-produkts wurde der Anteil vitaler Zellen bestimmt und ihre Wachstumsfähigkeit im Kolonie-Assay untersucht (126). Die Vitalitätsprüfung erfolgte durch die Trypanblau-Färbung, wobei tote Zellen durch den Farbstoff blau gefärbt erschienen und von den hell leuchtenden vitalen Zellen unterschieden werden konnten. Vor einer geplanten Hoch-dosischemotherapie wurden zur Prüfung der Wachstums- und Teilungsfähigkeit der kryokonservierten/aufgetauten Blutstammzellen Kulturen in Methylzellulose angelegt um hämatopoetische Kolonien zu züchten: granulozytäre/monozytäre Kolonien (CFU-GM: colony-forming units granulocyte-macrophage) und erythrozytäre Kolonien (BFU-E: burst-forming units erythrocyte). Hierbei wurde der Inhalt eines aufgetauten Pilot-röhrchens (1 ml) in ein 10 ml Falcon-Röhrchen gegeben, mit 9 ml RPMI Lösung aufgefüllt und bei 2.000 U/min für 10 min ohne Bremse zentrifugiert. Nach Abkippen des Überstands erfolgte die Resuspension der Zellen in RPMI Lösung. Danach wurde die Zellsuspension über einen Dichtegradienten (Ficoll) gegeben. Durch Zentrifugation ohne Bremse (15

15

Anzahl CFU-GM pro Kulturansatz × Gesamtzahl MNC pro Stammzellprodukt 10⁵

Die berechnete Zahl an CFU-GM wurde durch das Körpergewicht des Patienten geteilt, um die individuelle CFU-GM-Dosis pro kg zu erhalten.

2.7 Hochdosischemotherapie

Es kamen zwei Chemotherapieregime zur Anwendung:

1. Carboplatin, Etoposid und Ifosfamid (CEI).

2. Carboplatin, Etoposid und Thiotepa (CET).

Nach Beendigung der Hochdosischemotherapie folgten ein bis zwei Tage Pause, danach erfolgte die Reinjektion der gefrorenen/aufgetauten Blutstammzellen (Tag 0). Ab Tag +1 wurde G-CSF als kontinuierliche Infusion verabreicht (5 µg/kg/d).

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2.7.1 Carboplatin, Etoposid und Ifosfamid (CEI)

Von 66 Patienten, die mit PEI als konventionelle Chemotherapie behandelt wurden, erhielten 57 Patienten Hochdosis-CEI in der folgenden kumulativen Dosierung: Carboplatin 1.500 mg/m², Etoposid 2.400 mg/m² und Ifosfamid 10 g/m². Carboplatin wurde als 1-h-Infusion an drei Tagen (500 mg/m²/d), Etoposid als 1-h-Infusion an vier Tagen (600 mg/m²/d) und Ifosfamid als 22-h-Infusion an vier Tagen (2.500 mg/m²/d) verabreicht (Tabelle 1).

2.7.2 Carboplatin, Etoposid und Thiotepa (CET)

Von 55 Patienten mit TIP oder TI/TIP als “salvage“ Chemotherapie erhielten 44 Patienten Hochdosis-CET in der folgenden kumulativen Dosierung: Carboplatin 1.500 mg/m², Etoposid 2.400 mg/m² und Thiotepa 450 mg/m². Carboplatin wurde als 1-h-Infusion an drei Tagen (500 mg/m²/d), Etoposid als 1-h-Infusion an vier Tagen (600 mg/ m²/d) und Thiotepa als 1-h-Infusion an dre Tagen (150 mg/m²/d) appliziert (Tabelle 2).

2.8 Auftauen und Reinjektion autologer Blutstammzellen

Am Tag der Rückgabe der Blutstammzellen (Tag 0), wurden die tiefgefrorenen Aphere-seprodukte in einem Behälter mit flüssigem N₂ auf die Station transportiert. Kurz vor der geplanten Reinjektion erfolgte ein rasches Auftauen der gefrorenen Produkte in einem Wasserbad bei 40°C. Die Zellsuspension wurde in 50-ml-Spritzen aufgezogen und sofort über einen zentralvenösen Katheter dem Patienten injiziert. Schließlich wurden die leeren Kyrokonservierungsbeutel mit je 5-10 ml Kochsalzlösung ausgespült, der Inhalt in aerobe/anaerobe Blutkulturflaschen gespritzt und zur Sterilitätstestung an das Institut für Mikrobiologie und Hygiene, Virchow-Klinikum, Humboldt-Universität, geschickt.

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Tabelle 1. Zeitlicher Ablauf der Hochdosischemotherapie CEI

		Tag -4	Tag -3	Tag -2/ -1	Tag 0	Tag +1
		Tag -6	Tag -5	Pause
Etoposid 600 mg/m2	Etoposid 600 mg/m2	Carboplatin 500 mg/m2	Carboplatin 500 mg/m2
Ifosfamid 2,5 g/m2	Ifosfamid 2,5 g/m2	Ifosfamid 2,5 g/m2	Ifosfamid 2,5 g/m2
					Stammzell- Reinjektion
						G-CSF 5 µg/kg/d

Tabelle 2. Zeitlicher Ablauf der Hochdosischemotherapie CET

Tag -6	Tag -5	Tag -4	Tag -3	Tag -2/ -1	Tag 0	Tag +1
Carboplatin 500 mg/m2	Carboplatin 500 mg/m2	Carboplatin 500 mg/m2		Pause
Etoposid 600 mg/m2	Etoposid 600 mg/m2	Etoposid 600 mg/m2	Etoposid 600 mg/m2
Thiotepa 150 mg/m2	Thiotepa 150 mg/m2	Thiotepa 150 mg/m2
					Stammzell- Reinjektion
						G-CSF 5 µg/kg/d

2.9 Anwachsen des Transplantats ("Engraftment")

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Gerechnet ab dem Tag der Reinjektion der kryokonservierten/aufgetauten Blutstamm-zellen (Tag 0) wurde das "Engraftment" jenem Tag zugeschrieben, an dem der Patient in der Posttransplantationsphase erstmals Leukozyten >1.000/µl, Granulozyten >500/µl und Thrombozyten >20.000/µl im peripheren Blut erreicht hat und im weiteren Verlauf des stationären Aufenthalts die Zellzahlen über diesem Niveau blieben.

2.10 Supportivtherapie

Patienten erhielten vor Beginn der Hochdosischemotherapie ab Tag -7 eine tägliche Prophylaxe p.o. mit 3×250 mg Ciprofloxacin (Ciprobay^®, Bayer, Leverkusen), 3×500 mg Aciclovir (Zovirax^®, Glaxo Wellcome, Hamburg) und 30 ml Amphotericin B (Ampho-Moronal^® Suspension, Bristol-Myers Squibb, München). Bei Auftreten von Temperaturen 38°C wurde die antibiotische Therapie mit Ciprofloxacin abgesetzt und durch tägliche Gaben von 3×2 g Cefotaxim (Claforan^®, Hoechst, Bad Soden) i.v. und 3×4 g Piperacillin (Pipril^®, Lederle, Münster) i.v. oder durch 3×2 g Ceftazidim (Fortum^®, Cascan/Glaxo Wellcome, Hamburg) i.v. und 3×4,5 g Piperacillin-Tazobactam (Tazobac^®, Lederle, Münster) ersetzt. Bei Nichtansprechen kam spätestens nach zwei Tagen zusätzlich Vancomycin (Vancomycin CP Lilly^®, Lilly, Bad Homburg) in einer täglichen Dosierung von 4×500 mg zur i.v. Anwendung. Bei weiterhin persistierendem Fieber wurden Cefotaxim/Piperacillin oder Ceftazidim/Piperacillin-Tazobactam durch tägliche i.v. Gaben von 3×1 g Imipenem (Zienam^®, MSD, Haar) oder 3×1 g Meropenem (Meronem^®, Zeneca/ Grünenthal, Stolberg) ersetzt. Bei begründetem Verdacht auf eine Pilzinfektion und/oder anhaltender Nichtentfieberung wurde zusätzlich Amphotericin B (Amphotericin B^®, Bristol-Myers Squibb, München) in einer täglichen Dosis von 0,5 mg/kg i.v. verabreicht. Um den Hämoglobinwert auf 8 g/dl anzuheben und über diesem Niveau zu halten erhielten die Patienten Erythrozytenkonzentrate. HLA-A/-B kompatible Thrombozyten-konzentrate wurden gegeben um die Thrombozyten 10.000/µl oder bei Fieber/Infektion und/oder Blutungszeichen 20.000/µl zu halten. Alle transfundierten Blutprodukte waren leukozytendepletiert und mit 30 Gray bestrahlt. Um die hämatopoetische Regeneration zu beschleunigen, verabreichte man G-CSF ab Tag +1

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2.11 Dokumentation und statistische Analysen

Die Dokumentation der Patientendaten und klinischen Parameter erfolgte im Daten-verarbeitungsprogramm dBASE IV^® 1.5 (Borland International, USA). Die Apheresen wurden im Tabellenkalkulationsprogramm Excel^® 97 (Microsoft Corporation, USA) doku-mentiert. Die Analyse der Daten erfolgte im Statistikprogramm SPSS^® 8.0 (SPSS Inc., USA). Statistische Signifikanz wurde bei p<0,05 angenommen.

2.11.1 Korrelationsanalysen

Die Korrelationsanalysen wurden mit der nichtparametrischen Rangkorrelationsanalyse nach Spearman durchgeführt. Als Variablen dienten zum Beispiel die Zahl der peripheren CD34+ Zellen/µl und die Menge der gesammelten CD34+ Zellen/kg. Die Analysen erfolgten dann mit den entsprechenden Datenpaaren der einzelnen Leuka-pheresen.

2.11.2 Analysen zur Mobilisation und Separation peripherer Blutstammzellen

Folgende Zielvariablen wurden für die Mobilisation und Separation der zirkulierenden Stammzellen definiert:

1. Zahl der zirkulierenden CD34+ Zellen/µl im peripheren Blut am ersten Apheresetag.

2. Menge an gesammelten CD34+ Zellen/kg am ersten Apheresetag.

Univariate Analyse:

Die abhängigen quantitativen Variablen wurden anhand des Medians in zwei annähernd gleich große Gruppen unterteilt. Die Codierung erfolgte jeweils mit 0 ( Median) oder 1 (> Median). Der U-Test nach Mann und Whitney wurde zum Vergleich der Gruppen in

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Multivariate Analyse:

Zur Identifikation der Unabhängigkeit von signifikanten Variablen der univariaten Analyse wurde eine multiple lineare Regression mit schrittweiser Eliminierung der abhängigen Variablen durchgeführt. Folgende Modifikationen wurden für diese Analyse durchgeführt:

1. Eine logarithmische Transformation der Zielvariablen war notwendig, um eine Normal-verteilung der Werte zu erreichen. Der Kolmogorov-Smirnov Test wurde zur Überprüfung der Normalverteilung angewendet. Normalverteilung wurde bei p<0,05 angenommen.

2. Die Mobilisationschemotherapie wurde anhand von drei Variablen untersucht, die jeweils mit der Codierung 0 (trifft nicht zu) oder 1 (trifft zu) versehen wurden.

2.11.3 Analysen zur hämatopoetischen Regeneration nach Hochdosistherapie

Folgende Zielvariablen wurden für die hämatopoetische Regeneration definiert:

1. Anzahl der Tage bis zum Erreichen von Granulozyten >500/µl.

2. Anzahl der Tage bis zum Erreichen von Thrombozyten >20.000/µl.

Univariate Analyse:

Der univariate Vergleich der abhängigen Variablen in Bezug auf die Zielgrößen erfolgte nach der Methode von Kaplan-Meier mit dem log rank Test. Die Codierung der abhän-gigen Variablen erfolgte wie oben beschrieben.

Multivariate Analyse:

Zur Identifikation der Unabhängigkeit von signifikanten Variablen der univariaten Ana-lyse wurde die Cox Regressionsanalyse mit Vorwärtselimination nach Wald durch-geführt.

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