[Seite 6↓]

1.  Einleitung

Die Entstehung und Progression maligner Tumoren ist ein mehrstufiger Prozeß, der auf einer Vielzahl genetischer Alterationen beruht. Als essentielle Schritte wurden die Aktivierung von Proto-Onkogenen und die Inaktivierung von Tumor-Suppressorgenen erkannt. Infolge dessen können die Zellen unabhängig von externen Wachstumssignalen ungebremst proliferieren, die Apoptose wird gehemmt, die Angiogenese wird aktiviert, und es kommt schließlich zur Metastasierung [1],[2]. Zu den bekanntesten Proto-Onkogenen, die in humanen Tumoren aktiviert werden, gehören die RAS und MYC Gene. Sie sind in einer Vielzahl von Tumoren mutiert oder amplifiziert [3],[4]. Die Produkte beider Gene stimulieren direkt oder indirekt die Proliferation [5].

Zu den wichtigsten Tumor-Suppressorgenen, deren Inaktivierung in zahlreichen menschlichen Tumoren nachgewiesen wurde, zählen die Gene für den Transkriptionsregulator p53, die Zellzyklusproteine RB und p16 sowie für den Signalketten-Inhibitor PTEN [6], [7], [8],[9].In normalen Zellen spielen ihre Genprodukte eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der Genomstabilität sowie in der Kontrolle der intrazellulären Signalübertragung und des Zellzyklus. In Tumoren werden aufgrund von Deletionen oder Mutationen in den kodierenden Regionen dieser Tumor-Suppressorgene keine funktionsfähigen Proteine mehr gebildet. Diese klassischen Mechanismen der Inaktivierung von Tumor-Suppressorgenen können auch den Expressionsverlust weiterer, potentiell wachstumshemmender Gene nach sich ziehen. Genen, die in Tumoren zwar als Wildtyp-Sequenzen vorliegen, aber nicht mehr exprimiert werden können, hat Ruth Sager erstmals eine Funktion als Tumor-Suppressoren zugeschrieben [10], [11].

Inzwischen werden zwei verschiedene Wege unterschieden über die während der Tumorentwicklung Expressionsänderungen erzeugt werden. Sie können sowohl Tumor- Suppressorgene, als auch Proto-Onkogene betreffen:

a. Irreversible Veränderung einer Gensequenz: Durch Mutationen oder Deletionen wird die Expression eines Tumor-Suppressorgens gestört (z.B. P53). Gleiches gilt für die Gen-Amplifikationen oder Punktmutationen von Proto-Onkogenen, die hierdurch verstärkt exprimiert werden (z.B. HER2) oder für permanent aktivierte Proteine kodieren (z.B RAS). Solche Gene werden als Klasse I Gene bezeichnet.

b. Reversible Expressionsveränderungen ohne Defekt in der Gensequenz. Solchermaßen supprimierte Gene werden als Klasse II Tumor-Suppressoren bezeichnet. Verantwortlich für


[Seite 7↓]

die Expressionsveränderung sind neben epigenetischen Mechanismen auch Defekte in übergeordneten Klasse I Genen. Zwei bekannte Beispiele hierfür sind die p53-Zielgene für Thrombospondin-1, ein Angiogenese-Inhibitor [12], [13], oder die Serin-Protease Maspin, deren Expressionsverlust in Mamma-Karzinomen mit der Metastasierung korreliert [14]. Dieses Konzept beinhaltet auch die Möglichkeit, daß Klasse II Gene während der Tumorprogression durch Mutationen inaktiviert und damit zu Klasse I Genen werden und birgt ein hohes Maß an Flexibilität bezüglich der Genexpression in sich.

Eine der bekanntesten Gen-Familien, die Klasse I Gene repräsentieren schliesst die RAS Proto-Onkogene ein. Mutationen in den RAS Genen führen zu konstitutiv aktivierten RAS Protein-Isoformen. Die Gene HRAS, KRAS und NRAS kodieren für Membran-assozierte, kleine GDP/GTP-bindende Proteine. In normalen, ruhenden Zellen liegen über 99% dieser Proteine im inaktiven, GDP-gebundenen Zustand vor [15]. Bindet ein Wachstumsfaktor (z.B. EGF, PDGF) an seinen Rezeptor, kommt es am intrazellulären Teil des Rezeptors zur Aktivierung verschiedener Adapter- und GDP/GTP-Austausch Proteine (Shc, Grb2, SOS). Der Austausch des RAS-gebundenen GDP zu GTP aktiviert RAS. Eine schwache endogene GTPase sowie spezielle Aktivatoren dieser GTPase schalten das aktivierte RAS Molekül normalerweise rasch wieder ab. Die RAS Aktivierung hat im weiteren die Stimulation einer ganzen Anzahl von Effektorproteinen zur Folge, von denen die bekanntesten die Serin/Threonin Kinase RAF, RalGDS und die PI-3 Kinase darstellen [16]. Über diese Proteine werden zytoplasmatische Phosphorylierungskasdaden gesteuert, die eine Modulation der Translation [17], [18], eine direkte Veränderung des Zytoskelettes [19], [20] und vor allem gravierende Veränderungen der Genexpression auslösen. (Abbildung.1)

Bereits 1989 wurde von Johannes L. Bos in einer umfassenden Studie nachgewiesen, daß in etwa 30% aller humanen Tumoren Mutationen in einem der RAS-Gene auftreten. Hinsichtlich der Frequenz und der Isoform der mutierten RAS-Gene gibt es zwischen den Tumortypen allerdings große Unterschiede [3]. Pankreaskarzinome weisen mit über 90% die höchsten Mutationsraten im KRAS-Gen auf, ca. 50% der Kolonkarzinome haben KRAS-Mutationen, während bei Mamma– oder Prostatakarzinomen kaum Mutationen nachgewiesen werden konnten. Die häufigsten Mutationen führen zu einem Austausch der Aminosäuren 12, 13, 59


[Seite 8↓]

Abbildung 1. Effektoren der RAS Signalübertragung.

oder 61 und hemmen die Sensitivität des aktivierten RAS-Proteins gegenüber GTPase-stimulierenden Proteinen. Damit kann das mutierte RAS-Protein, einmal aktiviert, nicht mehr deaktiviert werden und stimuliert so permanent die verschiedenen intrazellulären Kinasekaskaden, unabhängig von externen Signalen. Die direkte Konsequenz einer RAS-Mutation in humanen Tumoren ist bis heute nicht hinreichend geklärt, obwohl zahlreiche experimentelle Ansätze mit transgenen Mäusen und durch Kanzerogene erzeugte Tumoren eine kausale Rolle nahe legen. Neuere Funktionsstudien in Zellkultur deuten jedoch auf eine entscheidende Rolle des RAS Onkogens in der Transformation normaler humaner Zellen hin [21].

Die Aufklärung und detaillierte Analyse der RAS-abhängigen Signalwege zeigte außerdem, daß insbesondere die PI-3-Kinase und RAF/MEK-Wege in Tumorzellen große Bedeutung


[Seite 9↓]

haben [22]. Ihre Aktivierung kommt in humanen Tumoren nicht nur als Folge eines mutiertes RAS Proteins vor, sondern kann ebenso die Folge von Rezeptor-Amplifikation und Inaktivierung von Tumor-Suppressoren sein [23], [8], [22], [2]. Die permanente Stimulation der zytoplasmatischen Signalkaskaden ist mit der Aktivierung bestimmter kritischer Zielgene verbunden. Dazu gehört z.B. das Gen für Zyklin D1, das für einen der wichtigsten Zellzyklus Regulatoren kodiert, aber auch Gene für Matrix Metalloproteasen, deren Bedeutung in Invasion und Metastasierung seit langem bekannt ist [24], [25].

Die Aktivierung der Gen-Expression durch RAS-abhängige Signalkaskaden ist gut untersucht, und viele der beteiligten Transkriptionsfaktoren sind bekannt. Eine wichtige Rolle spielen hierbei die Mitglieder der AP-1 Familie, Fos und Jun Proteine, das SRF Protein (serum response factor) und die Ets Familie [26]. Erst in den letzten Jahren wurde klar, daß RAS-abhängige Signalübertragung auch zur Repression der Genexpression führen kann. Die ersten Ergebnisse, die auf eine solche Hemmung in RAS-transformierten Zellen hinwiesen, wurden mit Hilfe von Revertanten-Zellinien und differenzieller Klonierung erzielt [27], [28], [29], [30]. Revertanten sind Zellinien, die ihren malignen Phänotyp bei gleichbleibender Onkogenexpression wieder verloren haben. In solchen Zellen wurde die Re-Expression von potentiell wachstumshemmenden Genen, wie z.B. Lysyl Oxidase oder Gelsolin, beobachtet, und man zog den Schluß, daß die Expression dieser Gene in den RAS-transformierten Zellen nur transient supprimiert war [31]. Der hierfür verantwortliche Mechanismus war und ist bislang völlig unbekannt.

Globale Analysen der Genexpression haben in den letzten Jahren zur Identifizierung einer Vielzahl von Genen geführt, die an der RAS-vermittelten Transformation in vitro und in vivo beteiligt sind. Trotzdem bleiben eine Reihe offener Fragen, deren Klärung für das Verständnis der Mechanismen, die an der Tumorentstehung beteiligt sind, und damit auch langfristig für eine Verbesserung der molekularen Diagnostik und Tumortherapie von entscheidender Bedeutung sind:

  1. Welche funktionelle Bedeutung haben einzelne RAS-regulierte Gene und die von ihnen kodierten Proteine?
  2. Wie viele Gene werden im Zuge der malignen Transformation dereguliert und in welcher biochemischen Beziehung stehen ihre Genprodukte zueinander?
  3. Wie werden diese Gene aktiviert oder supprimiert, und welche dieser Gene werden über gemeinsame Mechanismen reguliert?

Die Aufklärung dieser Probleme wird zum Beispiel anhand von Markergenen die Möglichkeit eröffnen, die Aktivierung pathogenetisch relevanter Signalwege in Tumoren diagnostisch zu [Seite 10↓]erfassen und eine entsprechende Therapie in die Wege zu leiten. Weiterhin werden mit Hilfe dieser Analysen neue therapeutische Zielstrukturen, zusätzlich zu den bereits bekannten, wie z.B. Bcr-Abl in chronisch-myeloischen Leukämien oder c-ErbB2 in Mammakarzinomen, sichtbar werden. Darüber hinaus wird man die Möglichkeit haben, mehrere Signalwege oder Zielproteine gleichzeitig oder nacheinander anzugreifen, um Resistenzentwicklung vorzubeugen.

In der vorliegenden Arbeit werden drei Zellkultur-Modelle beschrieben, mit deren Hilfe Gene analysiert wurden, deren Expression als Folge der RAS-Signalübertragung gehemmt wird. Unter Verwendung von PCR- und Microarray-gestützten Methoden wurden mehrere hundert Gene identifiziert, die in RAS-transformierten Zellen und auch in humanen Tumoren supprimiert werden. Mit Hilfe dieser Systeme konnte so erstmals nachgewiesen werden, daß die Hemmung der Genexpression in RAS-transformierten Zellen ebenso wichtig ist wie die Aktivierung. Weiterhin wird die funktionelle Analyse und Regulation der drei RAS-abhängigen Klasse II Tumor-Suppressoren H-REV107-1, H-REV107-2 und Caveolin-1 beschrieben. Die Mechanismen ihrer Regulation und Funktion wurden teilweise aufgeklärt. Sie zeigen exemplarisch, welche kausalen Zusammenhänge zwischen Signalketten-Aktivierung und Regulation von Zielgenen bestehen können und weisen auf generelle Mechanismen der Fehlfunktionen in der Genregulation bei Tumorzellen hin.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
21.04.2005