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2.  Transformationsmodelle zur Identifizierung RAS-abhängig regulierter Gene

2.1. Immortale, konstitutiv mit HRAS (V12)-transformierte Ratten Fibroblasten

Zuber, J., Tschernitsa, O.I., Hinzmann, B., Schmitz, A.-C., Grips, M., Hellriegel, M., Sers, C., Rosenthal, A. & Schäfer, R. A genome-wide survey of RAS transformation targets. Nat Genet. 2000, 24:144-52.

Für die Analyse globaler Genexpressionsveränderungen in Abhängigkeit von der RAS-Signalübertragung wurden Zellkultur-Modelle verwendet. 208F Zellen sind immortale, nicht-tumorigene Ratten Fibroblasten, FE-8 Zellen sind Derivate von 208F, die mit einem konstitutiv aktivierten humanen HRAS Onkogen transformiert wurden [32]. Mittels SSH (suppression subtractive hybridization; [33] wurde von jeder dieser Zellinien ein Genexpressionsprofil erstellt [34]. Bei dieser Subtraktionsmethode werden die RNA Populationen beider Zellinien revers transkribiert und die cDNA Populationen in bestimmten Verhältnissen miteinander hybridisiert. Alle cDNA Sequenzen, die in beiden Zellen gleich stark exprimiert werden, hybridisieren miteinander und werden dem Reaktionsansatz entzogen. Übrig bleiben die Sequenzen, die nur in einer der beiden Zellen exprimiert werden. Diese können dann mittels PCR amplifiziert, in geeignete Plasmide kloniert und durch Sequenzierung identifiziert werden.

Diese Experimente zeigten erstmals, daß in RAS-tranformierten Zellen eine annähernd gleiche Anzahl von Genen aktiviert und supprimiert wird. Unter den Genen, deren Expression gehemmt wird, fand sich eine Vielzahl von Sequenzen, die für Proteine mit Wachstums -oder Angiogenese-hemmender Wirkung kodieren. Beispiele hierfür sind die Gene für Lysyl Oxidase [30], p96DOC-2 [35] oder Thrombospondin-1 [13]. Lysyl Oxidase fördert die Vernetzung von Kollagenfasern der extrazellulären Matrix [36], [37]. Das p96DOC-2 Protein beeinflußt die Signalübertragung von Wachstumsfaktor-Rezeptoren zum RAS-Protein negativ und fungiert in humanen Ovarialkarzinomzellen als Wachstumssuppressor [38]. Thrombospondin-1 hemmt die Migration von Endothelzellen, und seine Wirkung als Angiogenese-Inhibitor wurde von Noel Bouck in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben [13], [12]. Alle drei genannten Gene wurden zudem als direkte Zielgene des RAS/RAF/MEK-Signalweges identifiziert, d.h. ihre Expression wird durch die Aktivierung dieses Signalweges [Seite 12↓]transient supprimiert. Eine Hemmung der Kinase MEK1 durch den Inhibitor PD98059 führte zu einer vollständigen oder teilweisen Re-Expression der Gene in den FE-8 Zellen [39].

2.2. Immortale Fibroblasten mit induzierbarem HRAS (V12)

Sers, C., Tchernitsa, O.I., Zuber, J., Diatchenko, L., Zhumabayeva, B., Desai, S., Htun, S., Hyder, K., Wiechen, K., Agoulnik, A., Scharff, K.M., Siebert, P.D., and Schäfer, R. Gene expression profiling in RAS oncogene-transformed cell lines and in solid tumors using subtractive suppression hybridization and cDNA arrays.Adv.Enzyme Regul., 2002, 42: 63-82

Die stabile Transfektion von immortalen Zellen mit einem RAS-Expressionsplasmid hat multiple Auswirkungen auf die Zellen. Zusätzlich zur direkten Gen-Aktivierung und –Hemmung, führt die Expression des Onkogens auch zu chromosomalen Veränderungen während der Transformation[40]. Diese haben ebenfalls Veränderungen der Genexpression zur Folge, die somit eine indirekte Auswirkung der RAS-Transformation darstellen.

Um zwischen direkter und indirekter Beeinflussung der Genexpression durch RAS unterscheiden zu können, wurde auf der Basis der 208F Zellen ein weiteres Fibroblasten-Modell etabliert, in dem das humane HRAS-Onkogen durch einen induzierbaren Promoter an-und abgeschaltet werden kann [41]. Diese Zellen (IR = Inducible RAS) unterscheiden sich im nicht-induzierten Zustand kaum von den ursprünglichen 208F Zellen. Ihre Morphologie entspricht derjenigen normaler Fibroblasten, die Zellen sind kontaktinhibiert und wachsen nicht in Weichagar. Nach Induktion der RAS-Expression mit 20mM IPTG kommt es innerhalb von 3-5 Tagen zu einer deutlichen Veränderung der Zellmorphologie, und die Zellen wachsen in Weichagar, ein typisches Merkmal transformierter Zellen [39].

Von den IR-Zellen wurde wieder mittels SSH je eine subtraktive cDNA Bank im nicht-induzierten Zustand und 5 Tage nach Induktion des RAS-Onkogens hergestellt. Diese beiden cDNA Banken sind bisher nicht veröffentlicht. Im weiteren wurden die Zellen eingesetzt, um die Expression verschiedener Gene, die in 208F und FE-8 als differenziell exprimiert identifiziert werden konnten, zu überprüfen. In diesen Experimenten konnte nachgewiesen werden, daß die Hemmung von Thrombospondin, Lysyl Oxidase (Lox) und Lysyl Oxidase-like-1 (LoxL, ein verwandtes Gen der Lysyl Oxidase), direkt von der Expression und Aktivierung des HRAS Onkogens und des MEK-Signalweges abhängig ist.

Im nicht-induzierten Zustand exprimieren IR-Zellen alle dreis Gene. Fünf Tage nach Aktivierung des RAS Gens war jedoch keine signifikante mRNA Expression von [Seite 13↓]Thrombospondin, Lox und LoxL mehr nachweisbar. Nach Abschalten der RAS-Induktion erlangten die Zellen wieder ihre normale Morphologie und die Gene für Thrombospondin und Lysyl-Oxydase like-1 (LoxL) wurden re-exprimiert. Im Fall des Gens für Lysyl-Oxydase kam es auch fünfs Tage nach Abschalten des RAS Onkogens nicht zu einer Expression. Eine mögliche Beteiligung sezernierter Wachstumsfaktoren an der RAS-abhängigen Transformation war bereits früher vermutet worden [42], [43]. Solch ein Faktor, produziert nach Induktion des RAS-Onkogens könnte, wenn er stabil im Zellkultur-Medium vorliegt, die mitogene Signalübertragung modulieren. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurde von IR-Zellen, die 5 Tage induziert waren, Zellkultur-Überstand entnommen, konzentriert und auf normale, nicht induzierte IR-Zellen gegeben. Die Expression des Lysyl Oxydase Gens konnte dadurch innerhalb von 48 Stunden vollständig gehemmt werden. Das Experiment zeigte, daß die Hemmung der Genexpression durch aktivierte RAS-Signalübertragung direkt und indirekt bewerkstelligt werden kann. Dieser Mechanismus wurde kürzlich auch in humanen MCF10 Epithelzellen nachgewiesen [44]. Anhand dieser Daten und unserer eigenen Beobachtung liegt es nahe zu vermuten, daß solche „autocrinen Verstärkungen“ in humanen Geweben nach Aktivierung der RAS-Signalübertragung vorkommen. Damit könnte die Genexpression auch in Zellen beeinflußt werden, die selbst kein aktiviertes Onkogen tragen, aber durch die sezernierten Wachstumsfaktoren von ihren Nachbarzellen beeinflußt werden.

2.3. Immortale, konstitutiv mit KRAS (V12)-transformierte Ratten Ovarial Epithelzellen

Tchernitsa, O.I.*, Sers, C.*, Zuber, J., Hinzmann, B., Schwendel, A., Schramme, A., Lund, P., Rosenthal A. and Schäfer, R. The transriptional basis of KRAS-mediated cellular transformation in ovarian epithelial cells; eingereicht

(*Die beiden Autoren haben in gleichem Umfang zu der Arbeit beigetragen)

Mit Hilfe der beiden Fibroblasten Modelle konnte eine Vielzahl von Genen identifiziert werden, deren Expression in der RAS-abhängigen Genexpression modifiziert wird. Da Karzinome jedoch aus Epithelzellen entstehen, wurde ein weiteres, Epithelzell-basiertes Zellkultur-Modell etabliert. Es besteht aus immortalen, nicht-tumorigenen Oberflächen-Epithelzellen der Ratte (Rose 199; [45] und einem davon abgeleiteten, KRAS-transformierten Derivat (Rose A2/5; [46]). Rose 199 Zellen entstanden durch spontane Immortalisierung von kultivierten Epithelzellen des Ovars. Die kodierende Sequenz des KRAS-Onkogens wurde [Seite 14↓]mittels RT-PCR aus RNA der humanen Kolonkarzinomzelle SW480 amplifiziert und unter der Kontrolle des humanen Promoters für den Elongationsfaktor EF1α [47] stabil in Rose 199 Zellen transfiziert. Mehrere Zellklone (A2/1-A2/5) wurden expandiert. Alle Klone weisen eine deutlich veränderte Morphologie hin zu einem Fibroblasten-ähnlichen Phänotyp auf (epithelial-mesenchymale Transition) und zeigen im Western-Blot eine starke Expression des KRAS-Proteins. Die im weiteren Verlauf verwendeten Zellen Rose A2/5 besitzen im Gegensatz zu den immortalen Rose 199 die Fähigkeit in Weichagar zu wachsen. Sie zeigen eine Aktivierung des mitogenen RAS/RAF/MEK-Signalweges. Eine Inkubation der Zellen mit dem spezifischen MEK Inhibitor PD98059 führt zu einer Hemmung des Weichagar-Wachstums und zur morphologischen Reversion des transformierten Phänotyps.

Zur Identifizierung derjenigen Gene, die signifikante Expressionsunterschiede zwischen Rose 199 und Rose A2/5 zeigen, wurden mittels SSH (subtractive suppression hybridization; [33] zwei subtraktive cDNA Banken hergestellt. 1070 Klone wurden sequenziert, dabei wurden 569 individuelle Sequenzen gefunden. Eine differenzielle Expression dieser Sequenzen wurde mit zwei Methoden bestätigt. Im sog. umgekehrten Northern-Blot wurden die klonierten PCR Fragmente aus den beiden cDNA Banken re-amplifiziert, mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Nylon-Membran transferiert. Diese wurde anschließend mit radioaktiv markierten cDNA-Proben der beiden Zellinien hybridisiert. Weiterhin wurde die differenzielle Expression aller klonierten Sequenzen, die für bekannte Gene kodieren, in Standard-Northern-Blotanalysen mit RNA aus den beiden Zellinien Rose 199 und Rose A2/5 überprüft. Von den bekannten Genen und ESTs (expressed sequence tags) wurden mit Hilfe der oben beschriebenen Methoden 68% der in Rose A2/5 überexprimierten Sequenzen bestätigt. Von den in den Rose199 exprimierten Sequenzen konnten 65% bestätigt werden. Von den überprüften Fragmente waren 44 mit diesen Methoden nicht nachweisbar, sie repräsentieren mit großer Wahrscheinlichkeit mRNA Transkripte, die in sehr geringen Mengen in den Zellen vorliegen.

2.3.1. Identifizierung von RAS-RAF-MEK-und PI-3 Kinase-abhängigen Regulations- Modulen

Um zu untersuchen, welche Gene in ihrer Expression durch den RAS/RAF/MEK-Signalweg beeinflußt werden, wurden Rose A2/5 Zellen für 48 Stunden mit dem MEK-Inhibitor PD98059 behandelt (siehe Abbildung 1). Die Expression von 178 Genen wurde mittels Northern-Blotanalysen in den Rose A2/5 Zellen mit und ohne PD98059 Inkubation [Seite 15↓]untersucht. Von den in Rose A2/5 supprimierten Genen wurden 46 partiell oder vollständig re-exprimiert. Von der in Rose A2/5 überexprimierten Genen wurden 52 durch PD98059 partiell oder vollständig supprimiert. Das bedeutet, daß sowohl die Unterdrückung der Genexpression als auch die Aktivierung der Genexpression ein wichtiger Bestandteil der RAS-Onkogen-abhängigen Transformation ist. Neben dem RAS/RAF/MEK-Signalweg spielt auch die direkte oder indirekte Aktivierung der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI 3K) eine wichtige Rolle in humanen Tumoren [48], [49], [22]. Insbesondere der Hemmung der Apoptose durch aktivierte PI 3-Kinase wird in humanen Tumoren eine wichtige Rolle zugeschrieben [50], [8]. Die Analyse der Kinase Akt, welche durch PI 3-Kinase gesteuerte Prozesse phosphoryliert wird, zeigte jedoch, daß in den KRAS-transformierten Rose A2/5 keine signifikante Erhöhung der Akt Phosphorylierung nachweisbar ist. Eine Inkubation der Zellen mit 10μM des PI 3-Kinase Inhibitors LY294002 ergab aber eine 50%ige Hemmung des Anker-unabhängigen Wachstums von Rose A2/5 Zellen. Wir vermuten, daß die minimale Aktivierung dieses Signalweges, die in den Zellen nachweisbar ist, bereits ausreicht, um das Wachstum positiv zu beeinflussen. Alternativ ist die PI 3-Kinase in Rose A2/5 Zellen aktiviert, stimuliert aber keine Akt-abhängige Signalübertragung, sondern beeinflußt das Wachstum über einen anderen, bisher nicht bekannten Weg. Die Hemmung der PI 3-Kinase mit LY294002 konnte die Expression von 24 der 49 getesteten, in den Rose A2/5 über-experimierten Gene ganz oder teilweise revertieren. Im Gegensatz dazu zeigte sich keinerlei Einfluß auf die supprimierten Gene. Besonders interessant war die Beobachtung, daß von den 24 über PI 3-Kinase regulierten Genen, 19 auch teilweise über den RAS/RAF/MEK-Signalweg gesteuert werden können. Mit diesen Experimenten wurden 4 Gruppen von Genen identifiziert. Gene, die a. über den RAS-RAF-MEK Signalweg gesteuert werden; b. Gene, die über den RAS-PI-3 Kinase Weg gesteuert werden; c. Gene, die über beide Wege reguliert werden; d. Gene, die über andere Mechanismen reguliert werden.

Wie die Steuerung der Genexpression über eine Kombination der beiden Signalwege funktioniert, ist völlig unbekannt. Eine Interaktion der RAS/RAF/MEK- und des RAS/PI 3-Kinase-Wege wurde 1999 von der Arbeitsgruppe Karin Möllings beschrieben [51]. Sie konnten zeigen, daß die PI-3 Kinase-abhängige Kinase Akt die Serin-Threonin-Kinase RAF phosphorylieren und damit hemmen kann. Dieser Mechanismus ist höchst wahrscheinlich auch in den Rose A2/5 Zellen aktiv, da bei einer vollständigen Hemmung des sehr schwach aktivierten PI-3 Kinase Weges mit LY294002 immer eine klare Steigerung der ERK1/2-Aktivierung zu beobachten war. Eine umgekehrte Beeinflussung des PI-3 Kinase-Weges durch den RAF/MEK-Weg konnte nicht beobachtet werden.


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Die Zielgene des PI-3 Kinase-Weges, die in diesem System identifiziert wurden, finden sich in allen funktionellen Proteinklassen und lassen keine spezifischen Rollen in der Steuerung der Apoptose erkennen. Bislang wurden zwei Gruppen von Transkriptionsfaktoren beschrieben, deren Lokalisation und Aktivierung über den PI-3K/AKT-Weg reguliert werden kann. Dies sind zum einen die Mitglieder der „Forkhead“-Transkriptionsfaktoren, die direkt durch Akt phosphoryliert werden können. Die Phosphorylierung resultiert in einer zytoplasmatischen Lokalisation dieser Proteine, wodurch sie ihre spezifischen Zielgene nicht mehr aktivieren können [50]. Dieser Mechanismus betrifft jedoch Gene, deren Expression durch den RAS/PI-3K/AKT-Signalweg gehemmt wird. In unserem Modell konnte die Hemmung der PI-3 Kinase mit LY294002 jedoch ausschließlich Gene beeinflussen, die in den RAS-transformierten Zellen überexprimiert waren. Aus diesem Grund wird hier keine Beteiligung der „Forkhead“-Transkriptionsfaktoren vermutet. Ein anderer, kürzlich beschriebener Mechanismus der AKT-abhängigen Regulation der Genexpression läuft über den Transkriptionsfaktor CREB. CREB kann direkt von AKT phosphoryliert und aktiviert werden [52]. Einige Mitglieder der CREB/ATF-Familie können Heterodimere mit den AP-1 Proteinen der FOS-und JUN-Gruppen bilden [53]. Ob die RAS/RAF/MEK-und RAS/PI3K-abhängige Regulation der Genexpression über diese Proteine gesteuert wird, ist bislang noch nicht bekannt.

2.3.2. Promoter Analysen RAS-regulierter Gene

Herzel, H., Beule, D., Kielbasa, K., Korbel, J., Sers, C., Malik, A., Eickhoff, H., Lehrach, H., Schuchhardt, J. Extracting Information from cDNA Arrays. CHAOS 2001, 11 (1), 1-10

Die Identifizierung RAS-abhängiger Expressionsmodule lieferte zum ersten Mal Hinweise darauf, daß es Gruppen von gemeinsam regulierten Genen gibt, deren Expression gleichzeitig durch die Aktivität bestimmter Signalwege gesteuert werden kann. Um die Mechanismen dieser Regulation besser zu verstehen, wurde der Versuch unternommen, die Promoter-sequenzen solcher Gene detailliert zu untersuchen. Diese Analysen wurden am Innovationskolleg Theoretische Biologie (ITB) in der Arbeitsgruppe von Prof. Hanspeter Herzel vorgenommen. Mit Hilfe eines neu entwickelten Algorithmus wurde nach definierten, in den Promotorbereichen über-repräsentierten Sequenzabfolgen gesucht. Diese Suche wurde mit den Promotoren der fünf RAS-abhängig supprimierten Gene LOX, LOXL, LOXL2, RIL und THBS durchgeführt. Dabei wurde eine signifikant über-repräsentierte Sequenzabfolge [Seite 17↓]gefunden, die in 4 der 5 Promotorregionen 9 mal auftaucht. Die Analysen zeigten, daß es möglicherweise konservierte Sequenz-Motive gibt, die für eine parallele Regulation von Genen verantwortlich sind. Um solche jedoch in Zukunft exakt zu definieren, muß eine größere Anzahl von Promotoren untersucht und die funktionelle Rolle einzelner Sequenzen in vitro analysiert werden. Diese in vitro Analysen werden zu Zeit mit zwei RAS-abhängig supprimierten Promotoren (RIL, H-REV107-1) durchgeführt. Der Promotor des humanen H-REV107-1 Gens, welches in Teratokarzinomzellen über den RAS-RAF-MEK Weg supprimiert wird (siehe IV, 2a), wurde in meinem Labor charakterisiert.


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21.04.2005