3. Identifizierung differentiell exprimierter Gene in humanen Ovarialkarzinomen mittels Hybridisierung von cDNA-Arrays

Sers, C., Tchernitsa, O.I., Zuber, J., Diatchenko, L., Zhumabayeva, B., Desai, S., Htun, S., Hyder, K., Wiechen, K., Agoulnik, A., Scharff, K.M., Siebert, P.D., and Schäfer, R. Gene expression profiling in RAS oncogene-transformed cell lines and in solid tumors using subtractive suppression hybridization and cDNA arrays.Adv.Enzyme Regul., 2002, 42: 63-82

Mit Hilfe der SSH-Analyse der normalen und KRAS-transformierten Ovarialepithelzellen wurde eine Reihe von differentiell exprimierten Genen identifiziert, deren potentielle Rolle in der Tumorgenese des Ovarialkarzinoms bereits beschrieben worden war. Dazu gehören das Zink-Finger Protein LOT1 [54], das Wilms-Tumor Suppressor- Protein WT1 und Sparc/Osteonectin [55], um nur einige zu nennen. Die Häufigkeit von KRAS Mutationen ist in humanen Ovarialkarzinomen ist eher gering, durch die Überexpression von Tyrosinkinase-Rezeptoren wie c-ErbB2 werden aber RAS-abhängige Signalwege aktiviert. Damit ist das Rose 199 – Rose A2/5 System ein sehr gutes Modell, um die Funktionen der differenziell exprimierten Gene und ihrer Genprodukte zu analysieren.

In humanen Tumoren kommt es jedoch neben und durch die Aktivierung der mitogenen Signalwege auch zu chromosomalen Aberrationen, die stabile Veränderungen der Gen-expression erzeugen. Darüber hinaus ist das normale Ovarialepithel im Gegensatz zu den immortalen Rose 199 Zellen proliferations-inaktiv. Während der Tumorentstehung in situ spielen nicht nur die Veränderungen innerhalb der Epithelzellen eine Rolle, sondern auch die Interaktion des Epithels mit dem darunterliegenden Stroma. All diese Komponenten werden [Seite 18↓]im Zellkultur Modell nicht berücksichtigt. Darüber hinaus werden nicht alle im Gewebe aktiven Gene in kultivierten Zellen exprimiert.

Um auch solche Einflüsse und damit Gene zu erfassen, die in Zellkultur eine untergeordnete Rolle spielen, wurden in Zusammenarbeit mit Luda Diatchenko, Bakhyt Zhumabayeva und Sejal Desai der Clontech Inc. in Palo Alto (Kalifornien, USA) differenziell exprimierte Gene in humanen Ovarialkarzinomen untersucht. Die Identifizierung und Verifizierung der potentiell interessanten, differenziell exprimierten Gene erfolgte in drei Schritten: a. RNA Proben aus normalen humanen Ovarien und aus serösen Ovarialkarzinomen (G3) wurden gegen einen Atlas „Select Human Tumor ArrayTM“ hybridisiert. Der RAS und cErbB2 Status der Tumoren war unbekannt. Dieser Array repräsentiert 437 Gene, die durch die Herstellung subtraktiver cDNA Banken aus verschiedenen humanen Geweben (Leber, Lunge, Mamma, Prostata, Blase) identifiziert worden waren. Ihre Expression unterscheidet sich signifikant zwischen Tumor-und Normalgewebe. b. Gene, die nach der Hybridisierung der Ovarialproben auf diesem Array einen mehr als zweifachen Expressionsunterschied zwischen Tumor und Normalgewebe aufwiesen, wurden auf einem zweiten Array getestet, dem sogenannten „Matched Tumor /Normal ArrayTM“. Dieser Array enthält 68 cDNA-Paare, die aus verschiedenen humanen Tumoren und den korrespondierenden Normalgeweben einzelner Patienten hergestellt, normalisiert und auf den Array aufgebracht wurden [56]. c. Die Produkte einzelner Gene, deren Expressionsmuster auf diesem Array wieder einen deutlichen Unterschied zwischen den cDNA Pools aus normalem Ovar und aus Ovarialkarzinomen aufwiesen, wurden mittels Immunhistochemie und Western-Blot weiter analysiert.

Die Hybridisierung der RNA aus normalen und tumorigenen Ovarialgeweben auf den „Atlas Select Tumor Array“ ergab 15 Gene mit einer mehr als zweifachen Stimulation der Expression und 40 Gene mit einer mehr als zweifachen Hemmung der Expression in den Tumoren, verglichen mit den Normalgeweben. Drei der überexprimierten Gene (KOP, ODC und MCM3) wurden mit Hilfe des „Matched Tumor/Normal Array“ weiter analysiert. Dabei zeigte sich, daß nur KOP auch in den cDNAs aus Ovarialkarzinomen auf diesem Array eine Stimulation aufwies. Das KOP-Gen kodiert für einen Protease-Inhibitor, dessen Expression in Pankreaskarzinomen gefunden wurde [56]. Eine Stimulation der KOP-Expression in Ovarialkarzinomen wurde inzwischen auch von anderen Arbeitsgruppen bestätigt, die Funktion des KOP-Proteins in der Entstehung oder Progression des Ovarialkarzinoms ist bislang unbekannt [57].

Von den 40 supprimierten Sequenzen wurden die Gene für die beiden Transkriptionsfaktoren ZFP36 und EGR-1 genauer untersucht. Weiterhin wurden die Gene für die Membranproteine [Seite 19↓]Caveolin-1 und -2 sowie das Gen für Clusterin-1, welches für ein sezerniertes Chaperon-Protein kodiert [58], analysiert. ZFP36 und EGR-1 zeigten im „Matched Tumor/Normal Array“ eine konsistente Suppression in allen Mamma -und Ovarialkarzinomen. Interessanterweise scheint ZFP36 hauptsächlich in diesen beiden Tumorarten unter-repräsentiert zu sein, was hier auf eine besondere Rolle dieses Gens schließen läßt. Die Hemmung der Clusterin-Expression hingegen ließ sich mit dem „Matched Tumor/Normal Array“ nicht bestätigen, und die kürzlich erschienene Arbeit von Hough et al. weist sogar auf eine Überexpression von Clusterin in ca. 50% der serösen Ovarialkarzinome hin [57]. Um Rückschlüsse auf eine mögliche Rolle von Clusterin in Ovarialkarzinomen ziehen zu können, muß eine größere Anzahl von Tumoren analysiert werden, und soweit möglich, die Expression und intrazelluläre Lokalisation des Proteins untersucht werden.

Die Gene für die beiden Membranproteine Caveolin-1 und -2 waren nach den Ergebnissen des „Matched Tumor/Normal Array“ in allen Ovarialkarzinomen deutlich supprimiert. Darüber hinaus zeigte sich eine Suppression in Tumoren aus Mamma, Lunge und Kolon. Caveoline sind eine kleine Familie von Membranproteinen, welche die Hauptkomponenten der sog. Caveolae bilden, Omega-förmige Einstülpungen der Zytoplasmamembran, die in allen Säugerzellen vorkommen. Innerhalb dieser Strukturen bilden die Caveoline eine Art „Steuer-Gerüst“ für Signalmolekule, wie z.B. den EGF-Rezeptor, RAS-Proteine und RAS-abhängige Proteinkinasen, und fungieren als negative Regulatoren der Signalkaskaden [59], [60]. Kürzlich wurde vorgeschlagen, daß die RAS-Isoformen HRAS und KRAS unterschiedlich über Caveolae reguliert werden [61], [62]. Die differenzielle Regulation von Caveolin-1 und –2 war daher von besonderem Interesse, da hier die Regulatoren der RAS-abhängigen Signalübertragung in Tumoren offenbar modifiziert waren. Daher wurde die Expression und Regulation von Caveolin-1 in humanen Ovarialkarzinomen und Tumorzellinien weiter untersucht.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
21.04.2005