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4.  Funktionelle Charakterisierung von Klasse II Tumor-Suppressorgenen

4.1. Caveolin-1 (CAV1)

Wiechen, K., Diatchenko, L., Agoulnik, A., Zhumabayeva, B., Desai, S., Htun, S., Scharff, K.M., Hyder, K., Siebert, P.D., Dietel, M., Schäfer, R. and Sers, C. Caveolin-1 is down-regulated in human ovarian carcinomas and acts as a candidate tumor suppressor gene. Am. J. Pathol. 2001, 159: 1635-1643

Wiechen, K., Sers, C., Dietel, M., Schlag, P.M. and Schneider U. Down-regulation of Caveolin-1, a candidate tumor suppressor gene, in sarcomas. Am. J. Pathology 2001, 158: 833-839

Die Analyse der Expression von Caveolin-1 in humanen Karzinomen und die Regulation des Caveolin-1-Gens (CAV1) in Zellinien wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Kai Wiechen im Institut für Pathologie durchgeführt.

Eine immunhistochemische Analyse von mehr als 70 humanen Ovarialgeweben mit einem Caveolin-1-spezifischen Antikörper ergab, daß Caveolin-1 im normalen Ovarialepithel exprimiert wird. In der überwiegenden Mehrzahl der serösen G2- und G3- Ovarialkarzinome zeigte sich jedoch eine deutliche Reduktion oder ein Verlust der Caveolin-1 Expression. Diese Beobachtungen bestätigten die Ergebnisse aus den Array-Hybridisierungen.

Untersuchungen in Ovarialkarzinom-Zellinien ergaben ein ähnliches Bild, nur zwei der sechs untersuchten Linien waren im Western-Blot positiv für Caveolin-1. Warum diese beiden Zellinien trotzdem ungehindert wachsen, ist bislang nicht klar. Die forcierte Expression des Caveolin-1-Gens in der Caveolin-negativen Zellinie OVCAR-3 hingegen resultierte in einer massiven Reduktion der Kolonieausbeute, und trotz wiederholter Versuche gelang es nicht, Klone zu etablieren, die Caveolin-1 stabil exprimieren. Dies bedeutet, daß in Ovarialkarzinomzellen, die einen Verlust von Caveolin-1 aufweisen, dieser Defekt auch funktionell für das Überleben und das Wachstum der Zellen von Bedeutung ist.

Auch die Mechanismen der Regulation von Caveolin-1 in Ovarialkarzinomen wurden untersucht. Das CAV1 Gen liegt auf Chromosom 7q31.1, einer Region, die in verschiedenen humanen Tumoren Deletionen aufweist [63], [64], [65], [66]. Ein Verlust des CAV1 Gens selbst konnte bisher aber nicht nachgewiesen werden [67]. Diese Daten ließen darauf schließen, daß Caveolin-1 möglicherweise als Klasse II Tumor-Suppressor fungiert. Die [Seite 21↓]Experimente in den humanen Ovarialkarzinomlinien OVCAR-3 und OAW42 bestätigten diese Vermutung. Die Suppression des Caveolin-1 Gens in diesen beiden Zellinien konnte durch eine Hemmung der DNA-Methylierung mit 5-Aza-2‘Desoxycytidin und der Histon-Deacetylierung mit Trichostatin A (TSA) fast vollständig aufgehoben werden. In diesen Experimenten fand sich jedoch ein deutlicher Unterschied zwischen der Regulation der Caveolin-1-Expression auf Ebene der mRNA und des Proteins. Die Inkubation der Zellinien mit 5-Aza-2‘Desoxycytidin und TSA konnte die Caveolin-1 mRNA-Expression nur geringfügig steigern, die Protein-Expression wurde hingegen deutlich verstärkt.

Diese Ergebnisse zeigten, daß mit Caveolin-1 ein negativer Regulator der RAS-abhängigen Signalübertragung in humanen Ovarialkarzinomen über epigenetische Mechanismen gehemmt wird. Diese betreffen nicht notwendigerweise das Caveolin-1 Gen selbst, sondern übergeordnete, bislang unbekannte Regulatoren. Die Häufigkeit der Caveolin-1 Suppression in humanen Tumoren ist ein klarer Hinweis darauf, daß die RAS-abhängige Signalübertragung in Ovarialkarzinomen nicht über Mutationen in den RAS Genen, sondern über die andere Mechanismen zustande kommt. Eine reine Analyse von Mutationen ist daher in Zukunft kein geeignetes Mittel um einen möglichen Einfluß von aktiviertem RAS in diesen Tumoren zu untersuchen.

Im Zuge der immunhistochemischen Untersuchungen von Caveolin-1 wurde eine Expression des Proteins in mesenchymalen Zellen beobachtet. Dazu gehörten Adipozyten, glatte Muskulatur und Endothelzellen der Gefäße. Weitergehende Analysen zeigten eine starke Expression in benignen mesenchymalen Tumoren, wie z.B. Fibromatosen, Leiomyomen und Lipomen. Die meisten der 77 untersuchten malignen Tumoren dagegen wiesen eine deutliche Reduktion oder einen Verlust der Caveolin-1-Expression auf. Analysiert wurden Fibrosarkome, Leiomyosarkome, Histiozytome und Angiosarkome. In einem mesenchymalen Zellkulturmodell, bestehend aus den immortalen humanen Fibroblasten IMR90 und NRAS-transformierten HT1080 Fibrosarkomzellen, wurde die Expression und Regulation von Caveolin-1 weiter untersucht. Während eine starke Expression beider Caveolin-1-Isoformen (22 und 24 kDa) in IMR-90 Zellen im Western Blot nachgewiesen werden konnte, waren HT1080 Zellen nur schwach positiv. Ein klarer Einfluß der Caveolin-1-Expression auf die Koloniebildung der HT1080 Zellen wurde in zwei unabhängigen Transfektionen nachgewiesen. Die Kolonieausbeute mit dem Caveolin-1-exprimierenden Plasmid ging jeweils auf 12% und 18% der Ausbeute mit dem Leervektor zurück. Eine stabile Überexpression von Caveolin-1 war auch in den HT1080 Zellen nicht möglich. Diese [Seite 22↓]Ergebnisse deuten auf eine wachstumshemmende Funktion von Caveolin-1 in mesenchymalen Zellen hin.

Wie bereits in Mauszellen beschrieben, wird die Expression des Caveolin-1 Gens über den RAS/RAF/MEK-Signalweg negativ reguliert und hat selbst einen hemmenden Einfluß auf diesen mitogenen Signalweg [68], [69]. Die Hemmung der Kinase MEK mit dem spezifischen Inhibitor PD98059 führte in den humanen HT1080 Zellen zu einer teilweisen Re-Expression von Caveolin-1. Wie bereits für die Ovarialkarzinom Zellen gezeigt, fungiert Caveolin-1 auch hier als Klasse II-Tumor-Suppressor und die an der Caveolin-1-Hemmung beteiligten Signalwege konnten zum Teil identifiziert werden.

Die Experimente zur Charakterisierung von Caveolin-1 haben deutlich den Nutzen und die Grenzen der Microarray-Technologie gezeigt. Ein funktioneller Zusammenhang zwischen Wachstum und/oder Überleben von Ovarialkarzinomzellen und dem Verlust der Caveolin-1-Expression konnte erst durch eine ganze Reihe von Experimenten in vitro nachgewiesen werden. Durch diese Versuche wurde insbesondere klar, daß nicht nur die Regulation der Caveolin-1 mRNA-Expression, sondern auch seine post-translationale Regulation, sowie die Modifikation und intrazelluläre Lokalisation des Proteins in Tumoren verändert sind. Auf der Basis dieser Erfahrungen bleibt die Microarray-Technologie ein wichtiges Mittel, um Hinweise auf Tumor-relevante Gene zu erhalten. Sie ist aber nur der erste Schritt auf dem Weg zu einer wissenschaftlich fundierten Aussage über die Rolle eines Gens und seines Produktes in einem humanen Tumor.

4.2. Identifizierung und Charakterisierung einer neuen RAS-Suppressor Genfamilie

4.2.1. H-REV107-1

Sers, C., Emmenegger, U., Husmann, K., Bucher, K., Andres, A.-K. & Schäfer, R.. Growth-inhibitory activity and downregulation of the classII tumor-suppressor gene H-rev107 in tumor cell lines and experimental tumors. Journal of Cell Biology, 1997, 136: 935-944

Husmann, K., Sers, C., Fietze, E., Mincheva, A., Lichter, P. and Schäfer, R. Transcriptional and translational downregulation of H-REV107-1, a tumor suppressor gene located on human chromosome 11q11-13. Oncogene 1998, 17: 1305-1312 (Die beiden Erstautoren haben in gleichem Umfang zu der Arbeit beigetragen): Knut Husmann and Christine Sers


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Sers, C., Husmann, K., Nazarenko, I., Reich, R., Wiechen, K., Zhumabayeva, B., Adhikari, P., Schroeder, K., Gontarewicz, A. and Schäfer, R. The classII tumorsuppressor gene H-REV107-1 is a target of interferon-regulatory factor 1 and is involved in interferon gamma-dependent growth suppression in human ovarian carinoma. Oncogene, 2002, 21: 2829-2839

Eines der ersten RAS-abhängig supprimierten Gene, welches in der Arbeitsgruppe identifiziert worden war, ist das H-rev107 Gen. Es wurde mit Hilfe von cDNA-Subtraktionsexperimenten isoliert, in denen die Genexpression in der immortalen, nicht tumorigenen Zellinie 208F und einer Revertanten-Zellinie F9 verglichen wurde [28]. Zum Zeitpunkt seiner Klonierung wies das Gen keine Homologien zu bekannten Sequenzen in den Datenbanken auf. In den beschriebenen Zellkultur-Modellen (208F/FE-8 und Rose199/A2/5) ist H-rev107 jeweils klar differenziell exprimiert. In den beiden immortalen Zellinien 208F und Rose 199 läßt sich eine starke Expression nachweisen, nicht aber in den HRAS- und KRAS-transformierten FE-8 und Rose A2/5 Zellen.

Um das H-rev107 Gen genauer zu charakterisieren, wurde seine mRNA Expression in Rattengeweben, in Tumorzellinien der Ratte und in HRAS-abhängig induzierten Tumoren der Maus untersucht [70]. H-rev107 war in den meisten normalen Geweben stark exprimiert. Ein deutliches mRNA-Signal wurde auch in immortalen Fibroblasten und Epithelzellen nachgewiesen, Tumorzellen aus Pankreas, Niere und Leber hingegen waren nur schwach positiv oder negativ. Mit Hilfe eines H-rev107-spezifischen polyklonalen Antiserums, konnte das Protein in Epithelzellen normaler Gewebe nachgewiesen werden. Dagegen exprimierten die meisten Zellen in Zellkultur nur sehr geringe Mengen an H-rev107 Protein. Auch in HRAS-induzierten Mammakarzinomen der Maus konnte kein H-rev107 Protein detektiert werden, und 50% der untersuchten Tumoren wiesen darüber hinaus einen Verlust der H-rev107 mRNA Expression auf. Die Suppression des H-rev107 Gens in Tumorzellinien und Tumoren war ein erster Hinweis auf seine mögliche Funktion als Wachstumsinhibitor.

Die forcierte Expression von H-rev107 in den RAS-transformierten FE-8 Zellen sowie in Anr4 Ratten Hepatokarzinomzellen ergab eine Suppression der Koloniebildung von 75%. Weiterhin gelang es nicht, H-rev107-exprimierende FE-8-oder Anr4-Klone herzustellen. Daher wurde ein Doxycyclin-induzierbares H-rev107 in FE-8 Zellen eingebaut, welches nach Induktion ebenfalls zu einer massiven Hemmung der Koloniebildung führte. Um einen möglichen Effekt der H-rev107 Expression in vivo zu untersuchen, wurden H-rev107-transfizierte FE-8 und Anr4 Zellpopulationen in Nackmäuse injiziert und das Tumorwachstum beobachtet. Die Ausgangszellen bilden normalerweise innerhalb von 4-8 [Seite 24↓]Tagen tastbare Tumoren. Die injizierten Zellpopulationen waren zu maximal 50% H-rev107-positiv. Insbesondere bei den langsamer wachsenden Anr4 Zellen zeigte sich, daß die Expression des Wildtyp-H-rev107-Proteins die Latenzzeit bis zur Entstehung tastbarer Tumorknoten um bis zu 50% verlängerte.

Als Kontrollen dienten in diesen Experimenten Zellpopulationen, die mit einem H-rev107-Antisense-Konstrukt transfiziert waren sowie solche mit einem Expressionsvektor, der ein um den C-terminalen Anteil verkürztes Protein (H-rev107 ΔC) exprimiert. Der C-terminale Anteil von H-rev107 besteht aus 21 hydrophoben Aminosäuren. Mittels biochemischer Fraktionierung von H-rev107-transfizierten COS-Zellen und anschließendem Western-Blot wurde nachgewiesen, daß das Wildtyp-H-rev107-Protein im Zytoplasma an intrazellulären Membranen und vermutlich an der nukleären Membran gebunden vorliegt. Ein mutiertes H-rev107-Protein dem die letzen 21 Aminosäuren fehlen, kommt nur im Zytoplasma, jedoch nicht mehr Membran-gebunden vor. Dieses Protein hatte in vitro eine deutlich verringerte Kapazität, die Koloniebildung zu hemmen und war in vivo in den Nacktmäusen wirkungslos. Offenbar spielt die intrazelluläre Lokalisation des Proteins eine wichtige Rolle. Mit diesen Experimenten konnte nachgewiesen werden, daß H-rev107 das Wachstum RAS-transformierter Zellen in vitro und in vivo hemmt und die Suppression seiner Expression eine wichtige Voraussetzung für die Transformation durch RAS-Onkogene ist.

Um eine mögliche Funktion dieses Gens in der humanen Tumorentwicklung studieren zu können, wurde das homologe humane H-REV107 kloniert und analysiert. Eine cDNA-Bank aus Leberzellen wurde mit einer Ratten-H-rev107 cDNA-Sonde hybridisiert, und vier positive cDNA Klone wurden sequenziert. Der längste Klon von 1064 Basenpaaren enthielt einen vollständigen offenen Leserahmen, 407 Basenpaare 5‘- und 167 Basenpaare 3‘- untranslatierte Sequenzen. Ein Vergleich der Proteinsequenzen aus Ratte und Mensch mit einer Übereinstimmung von 83 % zeigte, daß H-REV107 in der Evolution hoch konserviert ist. Das humane H-REV107-Protein ist mit 162 Aminosäuren zwei Aminosäuren länger als das Ratten-Protein und läßt sich im Western-Blot mit dem polyklonalen Kaninchen-Antiserum als etwa 18 kDa grosse Bande nachweisen. Das humane H-REV107-Gen ist ubiquitär in den meisten normalen Geweben exprimiert. Eine fehlende bzw. sehr schwache Expression in peripheren Lymphozyten und im Thymus zeigte, daß H-REV107 in hämatopoetischen Organen oder Zellen nicht exprimiert ist. In den ersten Northern-Blotanalysen, die mit der kodierenden Region als cDNA-Sonde durchgeführt wurden, traten zwei Banden auf. Mit Hilfe einer spezifischen Sonde aus dem 5‘-untranslatierten Anteil des [Seite 25↓]H-REV107-Gens konnte die ca. 1,2 kb lange, größere Bande als die H-REV107-spezifische mRNA identifiziert werden. Ein Vergleich der H-REV107 cDNA-Sequenz mit der GenEMBL EST-Datenbank ergab mehrere verwandte Sequenzen, die eine Homologie von etwa 65% aufwiesen. Zwei dieser Klone, TS 53996 und TS 71932, konnten über die Universität Washington bezogen und vollständig sequenziert werden. Beide enthielten die gleiche Sequenz in verschiedener Länge und wiesen einen offenen Leserahmen mit einer Identität von 57% zur H-REV107-Sequenz auf. Inzwischen wurde noch eine weitere Sequenz in die EMBL-Datenbank eingegeben, über die jedoch noch wenig bekannt ist. Die H-REV107-Genfamilie hat derzeit 3 Mitglieder.

H-REV107-Proteine


H-REV107 Proteinfamilie. Die zwischen den Proteinen stark konservierten Bereiche sind unterlegt. Die Homologie zwischen den verschiedenen Proteinen ist in Prozent wiedergegeben. Identische Aminosäuren sind mit *, konservative Austausche mit : markiert.

Das ursprünglich identifizierte Ratten-Homolog wird im weiteren als H-REV107-1, das neu identifizierte Gen als H-REV107-2 bezeichnet. Mit Hilfe einer H-REV107-2-spezifischen Sonde konnte nachgewiesen werden, daß auch dieses Gen ubiquitär exprimiert wird, allerdings zeigten sich einige Unterschiede zum H-REV107-1-Gen. Die ca. 1 kb große H-REV107-2-mRNA wurde in den hämatopoetischen Zellen und Organen wie Thymus und Milz stark exprimiert, konnte aber in mRNA aus Gehirn, Pankreas und Testis nicht nachgewiesen werden. Im gleichen Jahr wurde die H-REV107-2 Sequenz von einer Arbeitsgruppe aus Kalifornien als RARRES/TIG3 veröffentlicht [71]. H-REV107-2/RARRES/TIG3 wurde in dieser Arbeit als Retinsäure-induzierbares Gen mit wachstumshemmender Aktivität [Seite 26↓]beschrieben. Damit war ein weiteres H-REV107 Gen als potentieller Tumor-Suppressor identifiziert.

Das Expressionsmuster des H-REV107-1-Gens wurde zunächst in humanen Tumorzellinien untersucht. In 19 von 27 analysierten Tumorzellinien konnte keine H-REV107-1-Expression nachgewiesen werden. Wie bereits beim Rattenprotein beobachtet, erwies sich der Nachweis des humanen H-REV107-1-Proteins in kultivierten Zellen als schwierig. Obwohl das polyklonale Rattenserum in transient transfizierten COS-Zellen eine spezifische Bande erkennt, ließ sich auch in den positiven Zellinien kein H-REV107-1-Protein nachweisen. Die forcierte Expression von H-REV107-1 in der Hepatomzellinie SkHep-1 ergab eine Reihe von stabilen Zellklonen, welche jedoch nur die mRNA exprimierten. Offenbar kann die Expression von H-REV107-1 sowohl auf mRNA-Ebene wie auch auf Proteinebene reguliert werden. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Peter Lichter (DKFZ Heidelberg) konnte das H-REV107-1-Gen in der Nähe des Centromers auf dem Chromosom 11 lokalisiert werden. Im Rahmen des Humangenomprojektes konnte diese Lokalisation präzisiert werden, das H-REV107-1-Gen befindet sich auf Chromosom 11q12-13. H-REV107-2/RARRES/TIG3 liegt ebenfalls auf Chromosom 11, am Ende des langen Arms auf 11q23 [71].

Nach dem beobachteten Verlust der Expression des H-REV107-1-Gens in humanen Tumorzellinien wurde auch die Expression in humanen Tumoren analysiert. Hierfür wurde zunächst ein neuartiger Array verwendet, der 241 cDNA-Pools aus humanen Tumoren und den zugehörigen Normalgeweben enthält [72]. Die Hybridisierung dieses Arrays mit einer H-REV107-1-spezifischen Sonde ergab wieder eine ubiquitäre Expression in den normalen Geweben, mit dem höchsten Spiegel in Mamma und Niere. Beim Vergleich der jeweiligen Tumor-und Normalpaare zeigte sich, daß H-REV107-1 in etwa 50% der Tumoren aus Mamma, Lunge und Ovar sowie in 10% der Tumoren aus der Niere deutlich schwächer exprimiert wird (> 2-fach) als in den Normalgeweben. Im Gegensatz dazu ergab sich eine leichte Überexpression in Tumoren aus dem Kolon; in den anderen Geweben (Uterus, Magen, Rektum, Schilddrüse, Prostata) konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Tumor- und Normalgewebe festgestellt werden. Die so gewonnen Daten wurden mittels RT-PCR an einer Reihe von Nieren-und Ovarialkarzinomen überprüft. Die Ergebnisse aus der Array-Analyse konnten mit dieser unabhängigen Methode bestätigt werden. Die H-REV107-1-spezifischen PCR-Fragmente, die aus den Ovarialkarzinomen amplifiziert werden konnten, wurden sequenziert. Diese Analyse ergab keine Anhaltspunkte für Mutationen innerhalb der kodierenden Sequenz von H-REV107-1.


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Der Mechanismus der H-REV107-1-Suppression wurde in immortalen und transformierten Ovarialepithellinien der Ratte und des Menschen untersucht. H-REV107-1 war ursprünglich als Zielgen der RAS-Signalübertragung in Ratten-Fibroblasten identifiziert worden. In den immortalen Rattenepithelzellen (Rose 199) wird H-rev107-1 stark exprimiert, in den KRAS-transformierten Rose A2/5 Zellen konnte die Suppression von H-rev107-1 erneut beobachtet werden. In diesen Zellinien wird durch das aktivierte KRAS-Onkoprotein der RAF/MEK/ERK-Signalweg stark aktiviert. Eine Hemmung dieses mitogenen Signalweges führt zur einer Wachstumshemmung der Zellen und zu einer deutlichen Re-Expression von H-rev107-1. Das gleiche Expressionsmuster wurde in der humanen Teratokarzinomzelle PA1 nachgewiesen. Diese Zellen enthalten ein mutiertes NRAS-Onkogen, welches für die Aktivierung von RAS-abhängigen Signalwegen verantwortlich ist. Diese Ergebnisse zeigten zum ersten Mal, daß H-REV107-1 ein Zielgen des mitogenen RAS/RAF/MEK-Signalweges sein kann. Eine Aktivierung dieses Weges wurde in verschiedenen humanen Tumoren, z.B. aus Lunge, Mamma und Ovar, bereits gezeigt [23], [73]. In den meisten epithelialen Ovarialkarzinomlinien konnte die Expression von H-REV107-1 jedoch nicht über diesen Weg beeinflußt werden, so daß ein weiterer Mechanismus der Suppression existieren mußte. Bereits 1994 war eine Aktivierung der H-rev107-Expression durch IFNγ in Astrozytomzellen aus Ratten nachgewiesen worden. Experimente mit IFNγ in humanen Ovarialkarzinom-Zellinien zeigten, daß die Expression von H-REV107-1 mittels IFNγ rekonstituiert werden kann. Interferone können in humanen Zellen eine Vielzahl von Genen positiv oder negativ steuern [74]. Ein wichtiger Mediator der Interferon-induzierten Genexpression ist der Interferon regulatory factor-1, IRF-1 [75] [76]. Mit Hilfe einer Mauszellinie, welche ein Östrogen-induzierbares Fusionsprotein aus dem Maus IRF-1 und dem humanen Östrogen-Rezeptor exprimiert [77], konnte nachgewiesen werden, daß H-rev107 direkt über IRF-1 induziert werden kann. IRF-1 ist ein Transkriptionsfaktor, der selbst wachstumsinhibitorische Eigenschaften aufweist. Das Gen für IRF-1 wurde auf Chromosom 5q31.1 lokalisiert und ist in zahlreichen myeloischen Leukämien deletiert [78], [79]. In soliden Tumoren ist über die Rolle von IRF-1 und seinen Zielgenen wenig bekannt. Die Analyse der Expression von IRF-1 und H-REV107-1 in einer humanen immortalen Ovarialepithel-Zellinie (HOSE) sowie in 5 epithelialen Ovarialkarzinom-Zellinien ergab eine Korrelation der mRNA-Niveaus beider Gene. Insbesondere die immortale Zellinie HOSE exprimiert viel IRF-1-und ebenso H-REV107-1-mRNA. Die Tumorzellinien hingegen exprimieren deutlich weniger IRF-1- und H-REV107-1–mRNA. Werden diese Zellen mit IFNγ inkubiert, wird zunächst IRF-1 exprimiert und nach 9-12 Stunden auch H-REV107-1. In diesen Zellen wurde somit gezeigt, daß die [Seite 28↓]verminderte Expression von IRF-1 in den Tumorzellen, verglichen mit den normalen Zellen, zur Suppression von mindestens einem IRF-1-Zielgen mit wachstumsinhibitorischer Funktion führt. Ob dieser Mechanismus auch für humane Tumoren zutrifft, ist derzeit Gegenstand der Untersuchungen.

Die Induktion der H-REV107-1-Expression in humanen Ovarialkarzinomlinien durch IFNγ ist auf mRNA Ebene leicht nachweisbar. Das H-REV107-1-Protein hingegen wird nur schwach induziert. Der Vergleich von Westernblot-und Immunfluoreszenz-Analysen zeigte, daß nur wenige Zellen eine starke H-REV107-1-Expression aufwiesen. Diese Zellen zeigten jedoch eine Kernmorphologie, wie sie für apoptotische Zellen typisch ist. In Zellen, die mit einem H-REV107-1-Expressionsvektor transfiziert waren und nachweisbare Mengen an H-REV107-1-Protein exprimierten, zeigte sich ebenfalls eine deutliche apoptotische Kernmorphologie. Kürzlich konnten wir nachweisen, daß die Menge an H-REV107-1-Protein nach 24-stündiger Inkubation mit Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα) deutlich ansteigt. Offenbar wird über TNFα, selbst ein Induktor der Apoptose, das H-REV107-1-Protein entweder produziert oder stabilisiert. Ob und vor allem wie H-REV107-1 selbst in humanen Ovarialkarzinomzellen Apoptose induzieren kann wird derzeit genauer untersucht.

Alle bisher beschriebenen Untersuchungen zum H-REV107-1-Gen zeigen, daß die Hemmung seiner Expression eine Rolle in der Entstehung und/oder Progression humaner Tumoren spielt. Die Funktion des H-REV107-1-Proteins ist bislang jedoch völlig unbekannt und seine Proteinsequenz gibt nach wie vor keine Aufschlüsse über mögliche funktionelle Domänen. Um dennoch den Mechanismus der H-REV107-1-vermittelten Tumorsuppression aufzuklären, führen wir derzeit funktionelle Studien mit dem H-REV107-1-Protein durch.

Mit Hilfe des „yeast two hybrid“-Systems (deutsch: Hefe-2-Hybrid-System) konnten Proteine identifiziert werden, die mit H-REV107-1 interagieren, darunter Proteine mit bereits bekannter Funktion in der Wachstumsregulation. Eines der Partner-Proteine, die Phosphatase PP2A, hat eine wichtige Funktion in der Regulation des RAF-Proteins im mitogenen RAS-Signalweg [80], [81], [82]. Außerdem wird vermutet, daß PP2A ein negativer Regulator des Zellwachstums ist, und in humanen Tumoren aus Lunge und Kolon wurden Mutationen in einem der Gene, die für eine PP2A Untereinheit kodieren, gefunden [83]. Zum Nachweis der in der Hefe identifizierten Interaktion wurden die potentiellen Interaktionspartner in Säugerzellen exprimiert und die Proteinkomplexe mittels Ko-Immunopräzipitation aus den Zellen isoliert. Im weiteren wird nun die funktionelle Rolle dieser Protein-Protein Interaktionen untersucht.


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Die oben beschriebenen Experimente erlauben ausschließlich Aussagen über die Funktion von H-REV107-1 in vitro. Für Untersuchungen in vivo wird derzeit an einer H-rev107-1-defizienten Maus gearbeitet. Dazu wurde zunächst das Maus H-rev107-1 Gen identifiziert und teilweise sequenziert. Zur Zeit wird ein H-rev107-1-Vektor hergestellt, der nach seiner Fertigstellung in embryonale Stammzellen von Mäusen eingebracht und über homologe Rekombination zu einer Zerstörung des H-rev107-1 Gens in den Maus Embryonen führen soll.


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4.2.2.  H-REV107-2

Rosen, O., Massenkeil, G., Teutsch, C., Martin, T., Arnold, R., Schäfer, R. and Sers, C. Induction of the class II tumor suppressor gene H-REV107-2 (TIG3) by ATRA and gamma IFN correlates with growth inhibition of myeloid cell lines. Abstract: J. Cancer Research and Clinical Oncology 2001, 127: S23; Manuskript in Vorbereitung

Die Analyse des H-REV107-2 Gens in hämatopoetischen Zellen und Tumoren wurde in Zusammenarbeit mit Dr. Oliver Rosen, ehem. Klinik für Hämatologie/Onkologie der Charité durchgeführt.

Die Ergebnisse der Northern Blot Analysen von H-REV107-1 und –2 hatten einen deutlichen Expressionunterschied der beiden Gene in den hämatopoetischen Organen ergeben. Während H-REV107-1 hier meist nur schwach oder gar nicht nachweisbar war, konnte ein H-REV107-2-spezifisches Transkript in RNA aus peripheren Lymphozyten, aus Milz und Thymus nachgewiesen werden. Die von DiSepio [71] beschriebene Aktivierung der H-REV107-2-Genexpression durch Retinsäure veranlaßte uns, eine mögliche Regulation dieses Gens in hämatopoetischen Zellinien und Tumoren zu untersuchen. Retinoide regulieren komplexe physiologische Vorgänge während der Entwicklung von Organismen. Insbesondere ihre starke Differenzierungs-induzierende Wirkung hat den Einsatz von Retinoiden in der Therapie von hämatopoetischen Tumoren begünstigt [84].

Mittels semiquantitativer RT-PCR und Northern Blot Analysen konnte eine schwache Expression beider Gene in den meisten der untersuchten Zellpopulationen aus peripherem Blut nachgewiesen werden. CD34-positive Zellen aus Blut und Knochenmark exprimierten sehr wenig H-REV107-1 und –2, die Expression von H-REV107-2 konnte in diesen Zellen durch IFNγ stimuliert werden. In weiteren untersuchten Subpopulationen (CD3-, CD19-, CD14-positive) waren ebenfalls beide Gene nachweisbar, jedoch ohne signifikante Reaktion auf IFNγ oder IL-2.

Die Expression von H-REV107-1 und –2 wurde auch in 7 hämatopoetischen Tumorzellinien untersucht. Die Zellinien U937, HL60 und NB4 entstammen akuten myeloischen Leukämien, Jurkat und CEM sind aus akuten T-Zell Leukämien abgeleitet, K562 entstammt einer chronisch-myeloischen Leukämie und Raji einem Burkitt (B-Zell)-Lymphom. Während die meisten der untersuchten normalen Zellen beide Gene zwar gering, aber gut nachweisbar exprimieren, können H-REV107-1 und -2 spezifische Transkripte nur in CEM nachgewiesen werden. Eine sehr schwache H-REV107-2 mRNA-Expression findet sich auch in HL60 und [Seite 31↓]Jurkat. Interssanterweise läßt sich die Expression von H-REV107-2 in allen Zellinien durch IFNγ und ATRA (all trans retinoic acid) deutlich steigern, die Kombination der beiden hat hierbei einen synergistischen Effekt. In den 4 myeloischen Zellinien ist die starke Stimulation der H-REV107-2 Expression von einer deutlichen Wachstumshemmung der Zellen durch ATRA und/oder IFNγ begleitet.

Expression und Induzierbarkeit von H-REV107-2 wurden auch in Blut und /oder Knochenmark von Patienten untersucht. In allen 15 Fällen (10 AML, 5 ALL) wurde durch IFNγ alleine oder in Kombination mit ATRA eine Stimulation der Expression erreicht. Die Experimente zeigten, daß kein Verlust des H-REV107-2 Gens in diesen Tumoren vorliegt, seine Expression hingegen durch differenzierende Agenzien deutlich stimuliert werden kann.

Diese Untersuchungen deuten daraufhin, daß die beiden eng verwandten Klasse II-Tumor-Suppressoren H-REV107-1 und H-REV107-2 in hämatopoetischen Geweben und Tumoren klar unterschiedliche Funktionen haben. Obwohl in den meisten untersuchten Zellen beide Gene mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnten, war nur H-REV107-2 durch IFNγ oder ATRA stimulierbar, die Expression des H-REV107-1 Gens wird nicht beeinflußt.

Um eine mögliche funktionelle Rolle des H-REV107-2 Gens in myeloischen Leukämien zu klären, sind weitere Experimente nötig. Wie neuere Arbeiten zeigen, kann ATRA in den NB4 Zellen über eine autokrine/parakrine Schleife Apoptose auslösen [85]. Eine mögliche Rolle des H-REV107-2-Gens in diesen Prozessen kann jedoch nur über einen gezielten Gentransfer oder eine selektive Hemmung der H-REV107-2 Expression analysiert werden.


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21.04.2005