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2  Eigene Arbeiten

Ausgangspunkt meiner Arbeit war die Herstellung des ersten „tissue engineerten“ Klappensegels von Shinoka et al. aus dem Jahre 1996. Aufgrund der mechanischen Eigenschaften des verwendeten Polymers war es nicht möglich eine dreiseglige, tissue engineerten Herzklappe herzustellen. Im Anschluß an dieses Experiment war der nächste Schritt, eine funktionsfähige, dreiseglige Herzklappe per Tissue Engineering herzustellen. Um dieses Ziel zu erreichen, mußten neuartige Polymere als Gerüstmaterialien evaluiert werden, sowie optimale in-vitro–Bedingungen neu entwickelt werden. In einem nächsten Schritt wurden die entstandenen Konstrukte in-vitro als auch in-vivo getestet.

Ausgehend von diesen ersten Ergebnissen wurde die Methode weiterentwickelt und auf andere kardiovaskuläre Gewebe wie großlumige Gefäße und Patches ausgeweitet. Parallel zu den Arbeiten mit tierischen Zellen wurde weiterhin versucht, Konstrukte aus humanen Zellen herzustellen.

2.1 Evaluierung resorbierbarer Polymergerüste für das „Tissue Engineering“ von Herzklappen

Das Hauptprinzip des „Tissue Engineerings“ beruht auf der Besiedlung von körpereigenen Zellen auf ein resorbierbares Polymergerüst. Diese Zellen beginnen anschließend, in das Polymer einzuwachsen und ihre eigene extrazelluläre Matrix zu bilden. Im Idealfall sollte sich das Polymergerüst komplett auflösen und ein vitales, körpereigenes Gewebe entstanden sein.

Um dieses Prinzip auf die Herstellung einer „tissue engineerten“ Herzklappe anzuwenden, wird eine geeignete dreidimensionale Matrix für die Besiedlung mit Fibroblasten, glatten Muskelzellen und Endothelzellen benötigt. Das Hauptproblem bisheriger Ansätze war, daß das verwendete Gerüstmaterial ungeeignet war für die Herstellung einer dreisegligen Herzklappe. PGA war als Herzklappengerüst zu steif, zu dick und wies eine zu geringe Biegsamkeit auf.


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Aus diesem Grunde habe ich zum Beginn meiner Arbeit im Labor von Dr. J.P. Vacanti und Dr. J.E. Mayer jr. versucht neuartige Polymere zu testen, um folgende relevanten Fragen zu beantworten:

Läßt sich aus den vorhandenen Polymeren ein Herzklappengerüst formen?

Haben die Polymere ausreichende biomechanische Eigenschaften?

Kann man vaskuläre Zellen auf diesen Polymeren besiedeln?

Können diese Zellen auf diesen Polymeren ihre eigene extrazelluläre Matrix bilden?

( Sodian R , Hoerstrup SP, Sperling JS, Martin DP, Daebritz S, Mayer JE Jr, Vacanti JP.
Evaluation of biodegradable, three-dimensional matrices for tissue engineering of
heart valves. ASAIO J 2000;46:107-110.)

2.2 Herstellung eines Herzklappengerüst für das „Tissue Engineering“

Bis heute ist die Frage, wie und woraus man ein geeignetes Herzklappengerüst für das Tissue Engineering herstellt, ungeklärt. Da das Polymergerüst sich beim Tissue Engineering von Herzklappen nach Implantation komplett resorbieren soll und das neue Gewebe in der Form des Gerüstes heranwächst, ist das Klappendesign, die Funktionsfähigkeit und die chirurgische Anwendbarkeit des Klappengerüstes von Bedeutung. Zum Zeitpunkt des Experimentes gab es keine veröffentlichte Arbeit, wie ein solches dreisegliges Herzklappengerüst aus Polymeren hergestellt werden könnte.

( Sodian R , Sperling JS, Martin DP, Egozy A, Stock UA, Mayer Jr JE, Vacanti JP.
Fabrication of a trileaflet heart valve scaffold from a polyhydroxyalkanoate biopolyester for use in tissue engineering. Tissue Eng 2000;6:183-188.)


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2.3  Bioreaktorsystem für die Herstellung von „tissue engineerten“ Herzklappen

Um funktionsfähiges und vitales Herzklappengewebe in-vitro herzustellen gingen wir davon aus, daß pulsatiler Fluß eine adäquate Gewebeentwicklung induzieren könnte. Daher entwickelten wir ein neuartiges Bioreaktorsystem, welches unter sterilen Zellkulturbedingungen funktionieren sollte.

(Hoerstrup SP, Sodian R , Sperling JS, Vacanti JP, Mayer JE Jr.
New pulsatile bioreactor for in vitro formation of tissue engineered heart valves.
Tissue Eng 2000;6:75-79.)

2.4  In-vitro-Herstellung von „tissue engineerten“ Herzklappen

Aus der Kombination der gewonnenen Erkenntnisse wurde in den nachfolgenden Experimenten die erste in-vitro-Herstellung eines tissue engineerten Herzklappenkonstruktes versucht. Es wurden dreiseglige Herzklappengerüste aus einem porösen Polyhydroxyalkanoate (PHA) und in einem zweiten Versuch aus einer Kombination von PGA und PHO gefertigt, mit vaskulären Zellen von Schafen besiedelt und anschließend einem pulsatilen Fluß ausgesetzt, um die Gewebebildung in-vitro zu induzieren. Diese Versuche dienten zum einen dazu, neuartige Polymer für das Tissue Engineering von Herzklappen zu evaluieren, sowie den positiven Einfluß von dynamischen Druck- und Flußbedingungen für die Gewebebildung in-vitro nachzuweisen.

( Sodian R , Sperling JS, Martin DP, Stock U, Mayer Jr JE, Vacanti JP.
Tissue engineering of a trileaflet valve - early in vitro experiences with a combined polymer.
Tissue Eng 1999;5:489-493.)

( Sodian R , Hoerstrup SP, Sperling JS, Daebritz SH, Martin DP, Schoen FJ, Vacanti JP, Mayer Jr JE. Tissue engineering of heart valves: in vitro experiences.
Ann Thorac Surg 2000;70:140-144.)


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2.5  In-vivo-Ergebnisse von „tissue engineerten“ Herzklappen

2.5.1 Ergebnisse mit einem porösen PHOH-Herzklappengerüst

Nachdem sich in den vorbeschriebenen Experimenten gezeigt hat, daß es möglich ist eine funktionsfähige, dreiseglige Herzklappe aus porösem PHA herzustellen und in-vitro zu einem vitalen Gewebe-Polymer-Konstrukt zu konditionieren, war der nächste Schritt die Anwendbarkeit dieses Konzeptes in einem ersten Tierexperiment zu überprüfen.

Im nachfolgenden Experiment wurden fünf tissue engineerte Herzklappen in Pulmonalisposition im Schafmodell implantiert. Die vaskulären Zellen für die tissue engineerten Herzklappe entstammten bei diesem Experiment vom gleichen Tier welches nach entsprechender in-vitro Konditionierung die Herzklappe erhalten sollte (Schema). Die Funktionsfähigkeit der Herzklappen wurde regelmäßig echokardiographisch kontrolliert. Nach einer in-vivo Zeit von 1, 5, 13 und 17 Wochen wurden die Klappen explantiert und anschließend histologisch, biochemisch und biomechanisch untersucht. Als zusätzliche Kontrolle wurde eine unbesiedeltes Herzklappengerüst (poröses PHA) in gleicher Weise implantiert und anschließend untersucht.

( Sodian R , Hoerstrup S, Sperling JS, Daebritz S, Martin DP, Moran AM, Kim BS, Schoen FJ, Vacanti JP, Mayer Jr JE. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves. Circulation 2000;102(Suppl 3):III-22-III-29.)

2.5.2  In-vivo-Ergebnisse mit einer in-vitro hergestellten Herzklappe

In einer Weiterentwicklung des vorbeschriebenen Experimentes wurden die Herzklappenkonstrukte vor der Implantation in einem pulsatilen Flußsystem konditioniert. Weiterhin wurden die Klappengerüste aus einer Kombination von PGA und einem neuartigen Polymer (Poly-4-Hydroxybutyrate, P4HB) gefertigt.

(Hoerstrup SP, Sodian R , Daebritz S, Wang J, Bacha EA, Martin DP, Moran AM, Guleserian KJ, Sperling JS, Kaushal S, Vacanti JP, Schoen FJ, Mayer Jr JE.
Functional living trileaflet heart valves grown in vitro.
Circulation 2000;102(Suppl 3):III-44-III-49.)


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2.6  Limitationen des bisherigen Konzeptes und potentielle Modifikationsmöglichkeiten

2.6.1 Anwendung von stereolithographischen Techniken für die Herstellung von Herzklappengerüsten

Ziel dieser Versuche war es, ein Herzklappegerüst herzustellen, daß der komplexen anatomischen Struktur einer natürlichen, humanen Pulmonal- oder Aortenklappe sehr nahe kommt. Um dies zu erreichen wurde versucht, pulmonale oder aortale Homografts dreidimensional zu rekonstruieren und über stereolithographische Techniken eine Polymerkopie der Homografts anzufertigen. Aufgrund der vermutlich zu langen Resorptionszeit von PHA wurde in diesem Versuch zusätzlich P4HB (kürzere Resorptionszeit) verwendet. Wie zuvor bereits beschrieben, sind beide Polymere biokompatibel und eignen sich für die Ausbildung von vaskulärem Geweben sowohl in-vitro als auch in-vivo.

( Sodian R , Loebe M, Hein A, Martin DP, Hoerstrup SP, Potapov EV, Hausmann H, Lueth T, Hetzer R. Application of stereolithography for scaffold fabrication for tissue engineered heart valves. ASAIO J 2002;48(1):12-16.)

2.6.2 Modifiziertes Bioreaktorsystem zur Herstellung von klappentragenden Konduits

Zahlreiche andere Forschergruppen konnten ebenfalls den positiven Effekt von dynamischen Zellkulturbedingungen für die Gewebeentwicklung in-vitro beobachten. Allerdings bleiben die technischen Voraussetzungen, um aus vaskulären Zellen funktionelle Gewebeformationen herzustellen, ein signifikantes Problem. Um die Limitationen des Konzeptes zu verbessern, haben wir in diesem Experiment ein neuartiges Zellbesiedlungs- und Konditionierungssystem für die Herstellung von Herzklappen und Gefäßen entwickelt. Bei der Zellbesiedlung kam es darauf an, unter sterilen Bedingungen eine optimale Zellverteilung auf den Polymergerüsten zu erreichen. Im Anschluß sollten die Zell-Polymerkonstrukte in ein steriles Konditionierungssystem überführt werden, welches eine optimale Umgebung, sowie die biochemischen als auch biomechanischen Stimuli für das entstehende Gewebe liefern kann. Die meisten Autoren beschreiben den Besiedlungsvorgang und die spätere Konditionierung als zwei verschiedene Prozesse. Bei diesem Konzept muß das besiedelte Konstrukt mit einem hohen Kontaminationsrisiko in ein zweites Konditionierungssystem gebracht werden, welches [Seite 23↓]insbesondere für die Anwendung beim Menschen fatale Folgen haben könnte. Aus diesem Grunde haben wir versucht ein kombiniertes Besiedlungs- und Konditionierundssystem zu entwickeln, bei dem die Konstrukte vom Zeitpunkt der Sterilisation bis zur Implantation in einem geschlossenen System verweilen. Dies hätte den Vorteil, daß man das Kontaminationsrisiko insbesondere beim Tissue Engineering von humanen, kardiovaskulären Geweben weiter minimieren könnte.

( Sodian R , Lemke T, Fritsche C, Hoerstrup SP, Fu P, Potapov EV, Hausmann H, Hetzer R.
Tissue-engineering bioreactors: a new combined cell-seeding and perfusion system for vascular tissue engineering.Tissue Eng 2002;8(5):863-870.)

2.6.3 Bioreaktorsystem zur Herstellung eines „Patches“

In diesem Experiment haben wir ein Bioreaktorsystem zur in-vitro Konditionierung von kardiovaskulären „Patches“ entwickelt und seine Funktionsfähigkeit nachgewiesen.

( Sodian R , Lemke T, Loebe M, Hoerstrup SP, Potapov EV, Hausmann H, Meyer R,
Hetzer R. New pulsatile bioreactor for fabrication of tissue-engineered patches.
J Biomed Mater Res 2001;58(4):401-405.)

2.7 Erste Ergebnisse mit humanen Zellquellen für das „Tissue Engineering“ von kardiovaskulären Geweben

In diesem Experiment haben wir den Einfluß von Wachstumsfaktoren auf humane, vaskuläre Zellkulturen untersucht und ihre Anwendbarkeit für das Tissue Engineering von Herzklappen und Gefäßen evaluiert. Hier wird versucht das bisher nur im Tierexperiment nachgewiesene Tissue Engineering Konzept auf menschliche Gewebe zu übertragen.

(Fu P, Sodian R , Lüders C, Lemke T, Kraemer L, Hübler M, Weng Y, Hoerstrup SP, Meyer R, Hetzer R. Effects of basic fibroblasts growth factor and transforming growth factor-ß on maturation of human pediatric aortic cell culture for tissue engineering of cardiovascular structures. ASAIO Journal 2004;50(1):9-14.)


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13.06.2005